庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種庫(kù)蚊黃病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法及試劑盒。所述引物和TaqMan探針是根據(jù)庫(kù)蚊黃病毒E基因區(qū)段的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。試劑盒中包括的上游引物：5'-CACGCCGAACGGACTTCT-3’，下游引物：5’-TCCATTGGCCGCCATATATC-3’、TaqMan探針序列：5'-TTTCGCACCGGAGCAGCCG-3’，5’端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)、3’端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增的目前片段長(zhǎng)度為62bp。該試劑盒可用于檢測(cè)庫(kù)蚊黃病毒，具有良好的靈敏度性和特異性，能檢測(cè)到庫(kù)蚊黃病毒的最低病毒滴度為10PFU/反應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特別是涉及庫(kù)蚊黃病毒 的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 庫(kù)蚊黃病毒（Culexflavivirus，CxFV)是一種蚊傳蟲(chóng)媒病毒，屬黃病毒科 黃病毒屬，于2003年由日本學(xué)者在淡色庫(kù)蚊（Culexpipiens)和三帶_庫(kù)蚊（Culex tritaeniorhynchus)中首次分離到病毒，隨后相繼在印度尼西亞、美國(guó)、西印度群島特立尼 達(dá)、非洲烏干達(dá)、南美洲秘魯、巴西、臺(tái)灣地區(qū)和我國(guó)的山東省、遼寧省等地的多種庫(kù)蚊屬蚊 蟲(chóng)中分離到該病毒。隨著近年CxFV在全球不同地區(qū)的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，可以將CxFV分為兩種基 因型，在兩種型別內(nèi)均存在致細(xì)胞病變和非致細(xì)胞病變兩種表現(xiàn)型。
[0003] 目前，對(duì)蚊蟲(chóng)中CxFV的檢測(cè)主要采用病毒分離和病毒核酸的普通PCR檢測(cè)。病毒 分離耗時(shí)且無(wú)法用于非致病變表型CxFV的檢測(cè)，普通PCR快捷特異，但易造成污染且檢測(cè) 敏感性低。TaqManReal-timePCR是一種實(shí)時(shí)熒光定量的檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)體系中熒光 強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化對(duì)核酸進(jìn)行定性、定量分析體外擴(kuò)增技術(shù)。本研究利用TaqManReal-time PCR技術(shù)建立了針對(duì)CxFV特異、快捷、敏感、有效的分子檢測(cè)方法，為媒介中CxFV的監(jiān)測(cè)與 檢測(cè)提供了技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了針對(duì)庫(kù)蚊黃病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探 針。
[0005] 本發(fā)明所提供的引物和TaqMan探針，是根據(jù)庫(kù)蚊黃病毒E基因區(qū)段最為保守的保 守區(qū)域設(shè)計(jì)的，即可用于檢測(cè)庫(kù)蚊黃病毒，也可用于定量檢測(cè)樣本中庫(kù)蚊黃病毒的核酸拷 貝數(shù)。
[0006] 所述引物與探針序列分別為：庫(kù)蚊黃病毒上游引物：CxFV-E-F: 探針：CxFV-E-Probe:FAM5'-TITCgCACCggAgCAgCCg-3'TAMRA，5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)、 3'端標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
[0007] 所述庫(kù)蚊黃病毒25uL實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系，包括： 2XReactionMixl2.L、EnzymeMixliiL、10iiM上下游引物與 5iiM探針各 1iiL、RNA模 板 1UL、Nuclease-freewater7. 5yL。
[0008] 所述庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系的最佳擴(kuò)增條件為：先 45°ClOmin;然后 95°ClOmin;最后 95°C15s和 60°C60s40 個(gè)循環(huán)。
[0009] 所述庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)突光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系適用于所有突光定量PCR反 應(yīng)儀。
[0010] 所述庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)構(gòu)建的病毒數(shù)定量分析模型最低 檢測(cè)限為10PFU/反應(yīng)。
[0011] 所述庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)通過(guò)與普通PCR檢測(cè)方法對(duì)蚊蟲(chóng) 標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)用比較，結(jié)果顯示該方法具有較常規(guī)PCR檢測(cè)法更加敏感、特異、簡(jiǎn)便和不易 污染的特征。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為對(duì)庫(kù)蚊黃病毒的特異性檢測(cè)的擴(kuò)增曲線(xiàn)；
[0013] 圖2為10倍系列稀釋定量庫(kù)蚊黃病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒滴度PFU 定量分析擴(kuò)增曲線(xiàn)；
[0014] 圖3為庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度的病毒滴度PFU定量分析標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)；

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法是基于TaqMan Real-time PCR 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)，利用在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)后產(chǎn)生的熒光信號(hào)積累的動(dòng)態(tài)變 化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程，最終可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。本 發(fā)明還涉及上述檢測(cè)方法建立所包含的所有內(nèi)容。
[0016] 該方法具體步驟為：
[0017] (1)引物與探針的設(shè)計(jì)
[0018] 選擇GenBank發(fā)表的世界各地不同年代不同地區(qū)分離得到的具有代表性的50株 庫(kù)蚊黃病毒的全基因組序列，用生物信息學(xué)分析軟件ClustalXl. 8進(jìn)行E片段基因的序列 比對(duì)，根據(jù)TaqManPCR引物、探針設(shè)計(jì)原則，選擇最為保守的1031-1111區(qū)域作為擴(kuò)增的 目的基因片段。在此區(qū)域內(nèi)利用PrimerExpreSs3.0輔助設(shè)計(jì)引物及探針序列，然后進(jìn)行 Blast分析驗(yàn)證E片段基因的廣譜性和特異性。序列信息見(jiàn)表1。
[0019] 表1CxFV檢測(cè)體系特異引物與探針序列信息
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)突光定量PCR檢測(cè)方法及試劑盒，其特征在于包含一對(duì)特異性 引物與一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為62bp，引物與探針是根據(jù)庫(kù)蚊黃病毒E 基因區(qū)段最為保守的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定量檢測(cè)樣本中庫(kù)蚊黃病毒的核酸拷貝數(shù)。所 述引物與探針序列分別為： 引物：CxFV-E-F :5, -CACGCCGAACGGACTTCT-3， CxFV-E-R :5' -TCCATTGGCCGCCATATATC-3' 探針：CxFV-E-Probe :FAM5, -TTTCgCACCggAgCAgCCg-3, TAMRA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種庫(kù)蚊黃病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及試劑盒，其特 征在于由以下幾部分組成： (1) 選擇庫(kù)蚊黃病毒E基因區(qū)段最為保守的保守區(qū)域?yàn)榘心繕?biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目 標(biāo)的核苷酸序列為： 5 ' -CACGCCGAACGGACTTCTTGAGTTTCGCACCGGAGCAGCCGAGATATATGGCGGCCAATGGA-3 ' ； (2) 應(yīng)用Primer Express3. 0軟件和Primer Primier5. 0軟件，設(shè)計(jì)引物和探針； (3) 探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM、3'端標(biāo)記 的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104342498SQ201310323597
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】王環(huán)宇, 梁國(guó)棟, 赫曉霞, 何英, 付士紅 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 王環(huán)宇