構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，其是將編碼至少一種特定細(xì)胞因子的基因整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組中，隨飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。該方法建立的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以替代培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞因子，一方面可以大大降低目前干細(xì)胞培養(yǎng)中因添加細(xì)胞因子造成的高成本，另外可針對(duì)不同物種干細(xì)胞的特性有針對(duì)性地建立表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，實(shí)用性強(qiáng)，可推廣應(yīng)用到各個(gè)物種不同類型干細(xì)胞的培養(yǎng)。
【專利說(shuō)明】構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和干細(xì)胞領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì) 胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞，embryonic stem cells)是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（ICM 細(xì)胞，Inner cell Mass)或原始生殖細(xì)胞（PGC細(xì)胞，Primordial germ cells)經(jīng)體外分 離、抑制分化培養(yǎng)獲得的多潛能細(xì)胞，其具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征及分化潛能。在 體外抑制分化培養(yǎng)條件下可以對(duì)其進(jìn)行各種遺傳操作，通過(guò)胚胎嵌合和細(xì)胞核移植參與各 種組織的發(fā)育，形成克隆動(dòng)物。通過(guò)對(duì)體外ES的操作，除了克隆動(dòng)物之外，ES細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物，藥物篩選甚至在人類疾病治療上都有不可比擬的用處。2006年，日本Yamanaka 率先利用0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞向干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。誘導(dǎo) 多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞，induced pluripotent stem cells)具有和ES -樣的干細(xì)胞特性。 周琪課題組于2009年成功利用四倍體補(bǔ)償技術(shù)證明了 iPS細(xì)胞的全能性。
[0003] 盡管應(yīng)用前景廣闊，但是ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的培養(yǎng)條件也相對(duì)苛刻。一方面 要保證不斷增殖，同時(shí)又要求不能分化。目前為止，無(wú)論是ES細(xì)胞系還在近年來(lái)興起的 iPS細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過(guò)程中飼養(yǎng)層細(xì)胞和小分子例如白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF，F(xiàn)ibroblast growth factors)發(fā)揮了舉 足輕重的作用。
[0004] 有關(guān)飼養(yǎng)層的不斷探索發(fā)現(xiàn)，不同的飼養(yǎng)層在維持干細(xì)胞特性上存在差異，而且， MEF (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，Mouse Embryonic Fibroblast)作為國(guó)際上公認(rèn)的最常用的飼 養(yǎng)層細(xì)胞也有自身無(wú)法回避的缺點(diǎn)，例如，生命期有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代，而且其產(chǎn)生 促生長(zhǎng)因子和抑制分化因子的能力也會(huì)隨著傳代時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱甚至喪失。再如， 在人ES細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能造成的交叉污染問(wèn)題。無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系雖然也有報(bào)道，但 其對(duì)維持干細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定性還有待研究。
[0005] LIF是在干細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的添加物。在干細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重 要的作用。但是，LIF價(jià)格不菲。而且有相關(guān)的研究表明，小鼠和大鼠的LIF在序列上的同 源性高達(dá)90%，但是，在大鼠 ES的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，大鼠 LIF要優(yōu)于小鼠 LIF。也就是說(shuō)盡管不 同物種的LIF同源性很高，但是差異依然存在。目前已經(jīng)商品化的LIF僅有鼠源、人源和大 鼠的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足不同物種的需求。
[0006] 基于上述原因，亟待建立一種能快速建立高效表達(dá)細(xì)胞因子飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法。 該方法使得飼養(yǎng)層和細(xì)胞因子都不再受物種來(lái)源的限制。一方面在研究中可用于優(yōu)化體外 培養(yǎng)體系，也可以建立同時(shí)表達(dá)多個(gè)細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。另外，在實(shí)際應(yīng)用中降低實(shí)驗(yàn) 成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種快速構(gòu)建能高效分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì) 胞的方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì) 胞的方法，其是將編碼至少一種特定細(xì)胞因子的基因整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組 中，隨飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。
[0009] 前述方法中，所述特定細(xì)胞因子包含白血病抑制因子（LIF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)等。其中，LIF來(lái)源于哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、豬、人等。
[0010] 前述方法中，所述哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、豬胚胎成纖維細(xì) 胞等。
[0011] 前述方法中，將含有編碼至少一種特定細(xì)胞因子的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(優(yōu)選電轉(zhuǎn)化） 到哺乳動(dòng)物的飼養(yǎng)層細(xì)胞中，獲得的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子。
[0012] 前述方法中，構(gòu)建含有編碼至少一種特定細(xì)胞因子的基因的表達(dá)載體，將構(gòu)建的 表達(dá)載體通過(guò)PB (PiggyBac)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組中，隨飼養(yǎng)層 細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。
[0013] 前述方法中，所述表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子EF-la (Human elongation factor-1 alpha)或CAG (巨細(xì)胞病毒CMV的增強(qiáng)子和雞β -actin啟動(dòng)子的組合體)。
[0014] 前述方法中，所述表達(dá)載體中還含有藥物篩選標(biāo)記，如新霉素（neomycin)的抗藥 基因 Neo等。
[0015] 本發(fā)明的高效表達(dá)細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞的構(gòu)建方法，通過(guò)建立表達(dá)細(xì)胞因子的 轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞，并通過(guò)飼養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的方式來(lái)替代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基 中添加的細(xì)胞因子。具體包括以下步驟：
[0016] 1)構(gòu)建PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的表達(dá)載體；
[0017] 2)采用電轉(zhuǎn)化的方式，將構(gòu)建的表達(dá)載體整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組 中；
[0018] 3)藥物篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞；
[0019] 4)陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)繁，經(jīng)Co-60照射細(xì)胞不再增殖，即得可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的 飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0020] 由前述方法獲得的可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0021] 由前述方法獲得的可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞在干細(xì)胞體外培養(yǎng)和 分離中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明進(jìn)一步提供用于檢測(cè)權(quán)利要求8所述可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層 細(xì)胞的通用反向引物，所述引物為R:5' -GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3'。
[0023] 具體地，本發(fā)明提供一種快速建立在豬成纖維細(xì)胞中分別表達(dá)小鼠、人和豬等物 種LIF的方法。包括以下步驟：
[0024] 1、構(gòu)建表達(dá)不同物種LIF蛋白的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體通過(guò)PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)整合 到基因組中表達(dá)。
[0025] 2、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將表達(dá)載體導(dǎo)入豬胚胎成纖維細(xì)胞中，通 過(guò)氨基糖苷類抗生素（G418)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群。
[0026] 3、將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制作成飼養(yǎng)層細(xì)胞。利用射線照射的方式處理細(xì)胞。
[0027] 4、用制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞，觀察培養(yǎng)的iPS細(xì)胞形態(tài)多能性等指標(biāo)，以檢 測(cè)特制飼養(yǎng)層細(xì)胞的效果。
[0028] 經(jīng)過(guò)藥物篩選后得到的細(xì)胞是成功轉(zhuǎn)入外源表達(dá)載體的細(xì)胞。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法（western blots)可以從RNA水平和蛋白兩個(gè)層面確認(rèn) 細(xì)胞因子的表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞用作飼養(yǎng)層細(xì)胞可以取代培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞因子。
[0029] 前述方法中，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，細(xì)胞因子的基因是合成序列，通過(guò)酶切連接的方式 連入表達(dá)載體上。
[0030] 前述方法中，建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法優(yōu)選采用電轉(zhuǎn)化的方式，電轉(zhuǎn)使用Lonza公 司（德國(guó)）電轉(zhuǎn)儀，程序設(shè)置為A024。
[0031] 前述方法中，每次電轉(zhuǎn)使用的細(xì)胞數(shù)目為2X106個(gè)，電擊液用量為200μ 1。
[0032] 前述方法中，電轉(zhuǎn)時(shí)，表達(dá)載體和ΡΒ酶表達(dá)載體的重量比為3:1。每次電轉(zhuǎn)用 2 X 106個(gè)細(xì)胞，相應(yīng)使用6 μ g的表達(dá)載體和2 μ g的ΡΒ酶表達(dá)載體。
[0033] 前述方法中，采用的表達(dá)系統(tǒng)是利用PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源表達(dá)載體整合到基因組 中。
[0034] 前述方法中，轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞建系所用的培養(yǎng)基是普通小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培 養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不添加 LIF。
[0035] 前述方法中，進(jìn)行G418藥物篩選，從而得到陽(yáng)性細(xì)胞。
[0036] 得到的陽(yáng)性細(xì)胞在液氮中保存，待后續(xù)試驗(yàn)需要，可按需解凍擴(kuò)繁使用。
[0037] 前述方法中，將陽(yáng)性細(xì)胞制備成飼養(yǎng)層細(xì)胞是通過(guò)Co-60射線照射的方式。
[0038] 本發(fā)明提供了一種快速高效地建立能穩(wěn)定表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞的方 法，即將表達(dá)特定細(xì)胞因子的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，通過(guò)藥物篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞。該方法建立 的飼養(yǎng)層細(xì)胞可以替代培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞因子，一方面可以大大降低目前干細(xì)胞培養(yǎng)中 因添加細(xì)胞因子造成的高成本，另外可針對(duì)不同物種干細(xì)胞的特性有針對(duì)性地建立表達(dá)特 定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，實(shí)用性強(qiáng)，可推廣應(yīng)用 到各個(gè)物種不同類型干細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0039] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0040] (一）本發(fā)明提供了一種高效、簡(jiǎn)便快速的方法，利用來(lái)源方便的細(xì)胞系制備表達(dá) 所需的細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞，為干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和大動(dòng)物ES細(xì)胞的分離研究提供了 一種優(yōu)化的體外培養(yǎng)體系。有利于促進(jìn)體外大動(dòng)物ES細(xì)胞的分離研究，創(chuàng)建大動(dòng)物ES細(xì) 胞培養(yǎng)的最優(yōu)條件。
[0041] (二）本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，實(shí)用性強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于不同物種各 種類型干細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0042] (三)可根據(jù)本發(fā)明的方法開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的表達(dá)不同細(xì)胞因子的PB表達(dá)載體，按需表 達(dá)所需的細(xì)胞因子。
[0043](四）根據(jù)本發(fā)明的方法開(kāi)發(fā)出的表達(dá)載體，其細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著高于普通商 品化細(xì)胞中同種細(xì)胞因子的表達(dá)量，滿足了干細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)于特定細(xì)胞因子量的需求。
[0044] (五）可根據(jù)本發(fā)明的方法開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的表達(dá)不同細(xì)胞因子的細(xì)胞系，為以后科研 工作提供便利。
[0045] (六）本發(fā)明為體外干細(xì)胞培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
[0046] (七）通過(guò)設(shè)計(jì)合適的表達(dá)載體，還可以制備同時(shí)表達(dá)多個(gè)細(xì)胞因子的細(xì)胞系。
[0047] (八）本發(fā)明可以通過(guò)選用不同的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)量的調(diào)節(jié)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中從RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平檢測(cè)LIF的表達(dá)量；其 中，A為本發(fā)明的飼養(yǎng)層細(xì)胞與商品化細(xì)胞ST0和BRL中LIF的蛋白表達(dá)量對(duì)比以及使用 不同啟動(dòng)子的PB載體LIF表達(dá)量與商品化飼養(yǎng)層細(xì)胞LIF表達(dá)量對(duì)比，B為本發(fā)明中飼養(yǎng) 層細(xì)胞與商品化細(xì)胞ST0和BRL中LIF的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)比。
[0049] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中使用本發(fā)明的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)iPS細(xì)胞結(jié)果；其中，a為 陽(yáng)性對(duì)照，豬iPS克隆63312在添加 LIF的2i中培養(yǎng)，使用普通飼養(yǎng)層細(xì)胞；b為陰性對(duì) 照，豬iPS克隆63312在不添加 LIF的2i培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用普通飼養(yǎng)層細(xì)胞；c為陰性對(duì) 照，豬iPS克隆63312在2i不加 LIF中培養(yǎng)，使用普通PEF (豬胚胎成纖維細(xì)胞）作為飼養(yǎng) 層細(xì)胞；d為豬iPS克隆63312在2i不加 LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用PEF-mouse-LIF (過(guò)表達(dá) 鼠源LIF的PEF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞；e為豬iPS克隆63312在2i不加 LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用 PEF-human-LIF (過(guò)表達(dá)人源LIF的PEF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞；f為豬iPS克隆63312在2i不加 LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用PEF-pig-LIF (過(guò)表達(dá)豬源LIF的PEF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0050] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中使用本發(fā)明的飼養(yǎng)層細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)iPS細(xì) 胞；其中，a為陽(yáng)性對(duì)照，豬iPS克隆63312在添加 LIF的2i培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b為陰性對(duì)照， 豬iPS克隆63312在未加 LIF的2i培養(yǎng)基中培養(yǎng)；c為陰性對(duì)照，使用PEF (豬胚胎成纖維 細(xì)胞)飼養(yǎng)層細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基(其中沒(méi)有人工添加 LIF)，培養(yǎng)豬iPS克隆63312 ;d為 使用PEF-小鼠-LIF飼養(yǎng)層細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基(其中沒(méi)有人工添加 LIF)，培養(yǎng)豬iPS克 隆63312 ;e為使用PEF-人-LIF飼養(yǎng)層細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基(其中沒(méi)有人工添加 LIF)， 培養(yǎng)豬iPS克隆63312 ;f為使用PEF-豬-LIF飼養(yǎng)層細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基(其中沒(méi)有人 工添加 LIF)，培養(yǎng)豬iPS克隆63312。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0052] 以下實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：
[0053] MEF培養(yǎng)基配方
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建能分泌表達(dá)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，其特征在于，將編碼至 少一種特定細(xì)胞因子的基因整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組中，隨飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分 泌表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定細(xì)胞因子包含白血病抑制因子 或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞為小鼠胚胎成 纖維細(xì)胞、豬胚胎成纖維細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，構(gòu)建含有編碼至少一種特定細(xì)胞因子的 基因的表達(dá)載體，將構(gòu)建的表達(dá)載體通過(guò)PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因 組中，隨飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子EF-la或 CAG。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體中還含有藥物篩選標(biāo)記。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 構(gòu)建PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的表達(dá)載體； 2) 采用電轉(zhuǎn)化的方式，將構(gòu)建的表達(dá)載體整合至哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)層細(xì)胞的基因組中； 3) 藥物篩選得到陽(yáng)性細(xì)胞； 4) 陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)繁，經(jīng)Co-60照射細(xì)胞不再增殖，即得可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng) 層細(xì)胞。
8. 由權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法獲得的可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求8所述可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞在干細(xì)胞體外培養(yǎng)和分離 中的應(yīng)用。
10. 用于檢測(cè)權(quán)利要求8所述可分泌表達(dá)特定細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞的通用反向引 物，其特征在于，所述引物為-GGGAGGTGTGGGAGGTTTT-3'。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104099369SQ201310306415
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月9日
【發(fā)明者】胡曉湘, 李書(shū)萍, 趙茜, 李寧 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)