一種檢測食品中馬肉成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測食品中馬肉成分的方法。本發(fā)明提供了用于檢測食品中馬肉成分的6對不同目的片段的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12所示。本發(fā)明還提供了含有上述引物組的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以快速、準確檢測肉制品中是否摻雜馬肉，其中對于檢測深加工肉制品效果尤為明顯。本發(fā)明還可為食品檢驗人員在對比檢測其他肉源時提供靈活多變的目的片段，進而提高檢測效率，另外本發(fā)明提供的引物也可作為實時熒光定量PCR的引物，對食品中摻雜的馬肉成分進行定量，更好的應用于食品檢測領域。
【專利說明】-種檢測食品中馬肉成分的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領域和分子生物學【技術領域】，具體來說，涉及一種利用PCR 技術檢測食品中馬肉成分的方法。

【背景技術】
[0002] 2013年1月中旬英國和愛爾蘭發(fā)現(xiàn)部分超市出售的牛肉漢堡中摻雜了馬肉和其 他肉類，其中在被檢測的27種漢堡中，有10種含有馬肉。此后，"掛牛頭賣馬肉"的事件持 續(xù)擴大，多個歐洲國家卷入丑聞中，消費者對食品工業(yè)的信任遭受了嚴重的打擊，歐盟也為 此對成員國的加工牛肉展開"DNA檢測"以消除"馬肉風波"憂慮，恢復消費者信心。
[0003] 在我國，近年來食品安全問題群眾反映強烈、社會關注度高。一些食品生產(chǎn)商為一 己私利，投機取巧、以次充好、偷工減料，在損害消費者利益的同時，嚴重危害人們的生命健 康。此外，我國還沒有健全統(tǒng)一的熟肉制品快速檢測標準。通常對于生肉制品我們可以通 過味道、色澤、肌肉紋理等進行檢測，但對于經(jīng)過加工的熟肉制品我們很難用這種傳統(tǒng)的理 化方法進行檢測。
[0004] PCR技術（Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應）作為一種快速而又靈敏 度高、特異性強的分子生物學檢測手段，已廣泛應用于諸多檢測領域。同時由于線粒體DNA 為核外遺傳物質，種內(nèi)高度保守，同時與核DNA相比，具有分子結構簡單、母性遺傳方式遺 傳、進化速度快等特點，大量存在于組織細胞中，具有抗腐蝕性，使用少量樣品即可進行PCR 反應。本發(fā)明利用PCR技術，擴增馬的線粒體DNA (mtDNA)達到檢測目的。檢測手段不僅簡 便易行，而且時間周期短、效率高、適用于食品快速檢測領域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于，提供一組優(yōu)選后的檢測食品中馬肉成分的PCR引物對。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有上述引物組，用于檢測食品中馬肉成分的試 劑盒。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是為食品檢驗人員對比檢測其他肉源提供靈活多變的選擇， 進而提高檢測效率，更好的應用于食品檢測領域。
[0008] 本發(fā)明的第四個目的是為進行實時熒光定量PCR，檢測食品中摻雜馬肉成分的含 量提供引物對。
[0009] 本發(fā)明的技術方案概述如下：
[0010] 一種檢測食品中馬肉成分的PCR引物組，由1號引物對、2號引物對、3號引物對、4 號引物對、5號引物對、6號引物對組成，所述1號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1 和2所示，所述2號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號引物對 的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5和6所不，所述4號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6號引 物對的核苷酸序列分另如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0011] 一種檢測食品中馬肉成分的試劑盒，包括引物組、PCR管、DNA聚合酶、PCR緩沖液、 dNTPs，所述引物組由1號引物對、2號引物對、3號引物對、4號引物對、5號引物對、6號引物 對組成，所述1號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2號引物對的核 苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5 和6所示，所述4號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號引物對的 核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0012] 本發(fā)明的引物組擴增的目的片段大小如下，1號引物對：183bp ;2號引物對： 202bp ;3號引物對：231bp ;4號引物對：266bp ;5號引物對：268bp ;6號引物對：300bp。
[0013] 本發(fā)明的試劑盒可以快速、準確、靈敏的檢測肉制品中的馬肉成分。特別是針對線 粒體DNA降解嚴重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均為小片段，可以很好的進行 檢測，進而克服了目的片段過大，在實際檢測中無法針對熟肉制品進行檢測的情況。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1-圖6分別為本發(fā)明中涉及的6對引物，S卩1號引物對、2號引物對、3號引物 對、4號引物對、5號引物對、6號引物對，分別對8個物種的肉制品基因組DNA進行PCR擴增 的結果，M 為 DL2000DNA Ma rker (從下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp); 1-8分別為豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗的基因組DNA。
[0015] 圖7為本發(fā)明中涉及的6對引物對經(jīng)深加工的市售馬肉制品基因組DNA的PCR擴 增結果，]?為01^20000嫩1&^1?51'(從下往上，10(^口、25(^口、50(^口、75(^口、100(^口、200(^口） ； 1、2、3、4、5、6分別為1號引物對、2號引物對、3號引物對、4號引物對、5號引物對、6號引物 對。

【具體實施方式】
[0016] 以下通過具體實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0017] 實施例1
[0018] 本發(fā)明所提供的6對引物，經(jīng)PCR反應擴增的目的片段長度如下，1號引物對： 183bp ;2號引物對：202bp ;3號引物對：231bp ;4號引物對：266bp ;5號引物對：268bp ;6號 引物對：300bp。
[0019] 1.肉制品的基因組DNA提取
[0020] 將樣品處理成肉末狀，取30mg加入1.5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl ΡΗ8. 0 ;0· 5Μ EDTA ΡΗ8. 0 ;5M Nacl ;0· 5 % N-Lanroyl SarcOsine ;蛋白酶 K ; RNaseA)70°C消化0. 5-lh或50°C過夜消化，離心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等體 積的酚、氯仿與異戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加 ^ylNacLlml冰乙醇， 冰上放置30min ;離心（12000r/min，5min)，棄上清；用lmUO%無水乙醇洗3次，瞭干；力口 70-100μ 1TE，靜置 30min。
[0021] 所提基因組DNA放置于-20°C冰箱中保存，為以后實驗使用。
[0022] 2.引物設計
[0023] 首先從 NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國國家生物 技術信息中心）的Genbank數(shù)據(jù)庫中找到馬與牛的線粒體DNA全序列（馬Equus caballus 登陸號：NC_001640. 1 ;牛Bos Taurus登陸號：NC_006853. 1)，進行序列比對。再分別將馬 的線粒體DNA全序列、馬線粒體DNA編碼的十三個多肽序列和馬線粒體DNA序列分解成3 段、4段、5段、14段后的序列放入Primerf. 0中進行引物設計。在設計引物的同時參考馬 (Equus caballus)與牛（Bos Taurus)的序列對比結果，保證設計出的用于擴增馬線粒體 基因組片段的引物序列不與牛線粒體基因組任意序列匹配。同時考慮到熟肉制品的基因組 DNA降解明顯，因而所設引物范圍為100bp-400bp。并且為了增強引物的特異性，所設引物 的TM值均在55°C-62°C之間。根據(jù)以上條件，挑選出數(shù)十對引物進行合成。以豬、牛、羊、 雞、鴨、馬、鹿、狗全基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增檢驗引物特異性與產(chǎn)物量，挑選最優(yōu)引物 對，即本發(fā)明所提供的6對引物。篩選結果如下，
[0024] 1號引物對：
[0025] F :5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 1 所示）
[0026] R :5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 2 所示）
[0027] 2號引物對：
[0028] F :5' -AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 3 所示）
[0029] R :5' -GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 4 所示）
[0030] 3號引物對：
[0031] F :5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 5 所示）
[0032] R :5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 6 所示）
[0033] 4號引物對：
[0034] F :5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 7 所示）
[0035] R :5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（序列表中 SEQ ID NO. 8 所示）
[0036] 5號引物對：
[0037] F :5' -CAAGACGCAACATCCCCTATT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 9 所示）
[0038] R :5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 10 所示）
[0039] 6號引物對：
[0040] F :5-ACCACAAAGACATCGGCACT-3 (序列表中 SEQ ID NO. 11 所示）
[0041] R :5-GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3 (序列表中 SEQ ID NO. 12 所示）
[0042] 3.弓丨物特異性驗證
[0043] 提取豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗8個物種的肉制品中基因組DNA，以此為模板進行 PCR反應。
[0044] 反應體系：20μ 1 (模板：1μ I ;dNTP0· 4μ I ;10XPCR buffer2y 1 ;上下游引物分 別 0· 8 μ I ;rTaq0. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ I)。
[0045] 反應條件：
[0046] 第一步：94°C 5min ;
[0047] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 個循環(huán)
[0048] 第三步：72°C 5min。
[0049] PCR產(chǎn)物-20°C保存，備用。
[0050] 4.瓊脂糖凝膠電泳驗證
[0051] 首先配制I %瓊脂糖凝膠，在微波爐中加熱致透亮，取出稍微冷卻后加 EB，充分混 勻倒入已插好梳子的板上，靜置30min后即可使用。
[0052] 凝膠后將板取出，放入電泳槽中，每個點樣孔上樣2μ 1產(chǎn)物+1μ 16Xlodding buffer,上樣后鄰近孔點3 μ IDNA marker。
[0053] 最后，電壓120V，25min進行凝膠電泳。PCR擴增結果用凝膠成相系統(tǒng)分析，結果如 圖1-圖5所示。其中，圖1為1號引物對擴增結果；圖2為2號引物對擴增結果；圖3為3 號引物對擴增結果；圖4為4號引物對擴增結果；圖5為5號引物對擴增結果；圖6為6號 引物對擴增結果；M 為 DL2000DNA Marker (從下往上，IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、 2000bp) ;1-8分別為豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗的基因組DNA。
[0054] 實施例2
[0055] 對市售經(jīng)深加工的馬肉制品進行驗證
[0056] 1.提取馬肉的基因組DNA :方法同實施例1中提肉制品的基因組DNA。
[0057] 2. PCR 驗證：
[0058] 以上述所提的基因組DNA為模板，用本發(fā)明中提供的6對引物分別進行PCR。
[0059] 反應體系：20μ 1 (模板：1μ 1 ;(1ΝΤΡ0·4μ I ;10XPCR buffer21y 1 ;上下游引物分 別 0· 8 μ I ;rTaqO. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ 1)。
[0060] 反應條件：
[0061] 第一步：94°C 5min ;
[0062] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 個循環(huán)
[0063] 第三步：72°C 5min。
[0064] 3.瓊脂糖凝膠電泳驗證
[0065] 配制2%瓊脂糖凝膠，制膠過程同實施例I中所述。電壓50V，電泳lh，PCR擴增結 果用凝膠成相系統(tǒng)進行分析，結果如圖6所示。其中，M為DL2000DNA Marker (從下往上， IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、2000bp) ; 1、2、3、4、5、6 分別為 1 號引物對、2 號引物對、 3號引物對、4號引物對、5號引物對、6號引物對。
【權利要求】
1. 用于檢測食品中馬肉成分的引物組，其特征在于，由1號引物對、2號引物對、3號引 物對、4號引物對、5號引物對、6號引物對組成，所述1號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號 引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5和6所示，所述4號引物對的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述 6號引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 11和12所示。
2. 用于檢測食品中馬肉成分的試劑盒，其特征在于，含有如權利要求1所述引物組，還 包括PCR管、DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs。
3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有1號引物對可擴增183bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（SEQ ID NO. 1) 下游引物：5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（SEQ ID N0.2)。
4. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有2號引物對可擴增202bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5'-AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（SEQ ID NO. 3) 下游引物：5'-GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（SEQ ID N0.4)。
5. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有3號引物對可擴增231bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（SEQ ID N0.5) 下游引物：5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（SEQ ID N0.6)。
6. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有4號引物對可擴增266bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（SEQ ID N0.7) 下游引物：5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（SEQ ID NO·8)。
7. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有5號引物對可擴增268bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5'-CAAGACGCACATCCCCTATT-3'（SEQ ID N0.9) 下游引物：5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（SEQ ID NO. 10)。
8. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有6號引物對可擴增300bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -ACCACAAAGACATCGGCACT-3'（SEQ ID NO. 11) 下游引物：5' -GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3'（SEQ ID NO. 12)。
9. 根據(jù)權利要求1所述的6個引物對，其特征在于，擴增目的片段183bp、202bp、 231bp、266bp、268bp、300bp可用于實時熒光定量，對食品中的馬肉成分進行定量。
10. -種檢測食品中馬肉成分的方法，其特征在于，包括步驟如下： 1)提取肉制品中的基因組DNA: 將樣品處理成肉末狀，取30mg加入1. 5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl PH8. 0 ;0· 5M EDTA PH8. 0 ;5M Nacl ;0· 5%N-Lanroyl Sarcosine ;蛋白酶K ;RNaseA)7(TC消 化0. 5-lh或5(TC過夜消化；離心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等體積的酚、氯仿與 異戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加40ylNacl，lml冰乙醇，冰上放置30min; 離心（12000r/min，5min)，棄上清；用lml70%無水乙醇洗3次，晾干；加 70-100μlTE，靜置 30min〇 2) 以所提基因組DNA為模板，進行PCR反應擴增； 3) 對PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，并使用凝膠成相系統(tǒng)分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293899SQ201310304040
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權日:2013年7月19日
【發(fā)明者】聶凌云, 魏迪, 程東慶, 池振奮, 高敬, 張瑩瑩, 趙永良, 聶凌虎 申請人:聶凌云