專利名稱：用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物及檢測反應(yīng)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物及反應(yīng)檢測體系。
背景技術(shù)：
布魯桿菌病是由布魯桿菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害。布魯桿菌病的防控和治療關(guān)鍵在于對病原微生物的快速、準(zhǔn)確、及早的檢測并確診。目前用于常規(guī)的布魯桿菌診斷技術(shù)有細(xì)菌分離培養(yǎng)、血清凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、PCR等方法，但上述方法花費(fèi)時(shí)間較長，而且判定結(jié)果需要借助精密儀器設(shè)備，難以在基層生產(chǎn)中普及應(yīng)用，因此建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的病原診斷方法顯得十分必要。Notomi等于2000年發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增革巴序列(Notomi T, Okayama H, MAsubuchi H, et al.Loop-mediated isothermalamplification of DNA[J].Nucleic Acids Res, 2000，28(12):e63.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種方法操作簡便，實(shí)驗(yàn)儀器要求較低的用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物及檢測反應(yīng)體系。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，包含擴(kuò)增布魯桿菌保守基因omp25特異堿基序列的正向內(nèi)引物FIP、正向外引物F3、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3，序列如下:
外引物:F35，-ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’B3 5’ -GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’內(nèi)引物:FIP 5，-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’BIP 5’ -GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’所述引物與基因omp25的412_618bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。采用上述的用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物的檢測反應(yīng)體系，25μ L反應(yīng)體系為:外引物F3:5pmol.L ^0.5 μ L外引物Β3:5pmol.L ^0.5 μ L內(nèi)引物FIP:40pmol.L'0.5μ L內(nèi)引物BIP:40pmol.L'0.5μ LMg2+:100πιΜ、2μ L甜菜堿:5M、4yLdNTP 混合液:10mM、3.5 μ L不含Mg2+的IOXbuffer:2.5μ L
Bst DNA 聚合酶:8U.μ L' I μ L模板:2yL去離子水:8 μ L反應(yīng)溫度為63°C。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明針對布魯桿菌的0MP25基因設(shè)計(jì)了一套LAMP特異性引物，建立了一種用于布魯桿菌基因檢測的方法。與傳統(tǒng)PCR相比，該方法操作簡便，實(shí)驗(yàn)儀器要求較低，在普通恒溫水浴鍋中反應(yīng)45min即可完成，而且可以通過在終產(chǎn)物中加入染料的方法直接用肉眼觀察結(jié)果，能快速準(zhǔn)確地鑒定布魯桿菌，在基層生產(chǎn)中具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。


圖1 是布魯桿菌 LAMP 產(chǎn)物電泳圖(M.1OObp DNA ladder marker (IOObp 梯狀 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))；1.布魯桿菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照)。圖2是敏感性試驗(yàn)結(jié)果(M.1OObp DNA ladder marker ;1 7.布魯桿菌DNA稀釋液濃度分別為5 X IO5 5 X IO^1Copies/μ L ；8.陰性對照)。圖3是特異性試驗(yàn)結(jié)果(M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；1.羊種布魯桿菌；2.胎兒彎曲桿菌；
3.大腸桿菌；4.沙門氏菌；5.犬種布魯桿菌；6.金黃色葡萄球菌；7.豬種布魯桿菌；8.牛種布魯桿菌；9.陰性對照)。圖4是本發(fā)明布魯桿菌0ΜΡ25基因引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)?！?br> 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明:本發(fā)明的用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，包含擴(kuò)增布魯桿菌保守基因omp25特異堿基序列的正向內(nèi)引物FIP、正向外引物F3、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3，序列如下:外引物:F35’ -ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’B3 5， -GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’內(nèi)引物:FIP 5，-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’BIP 5’ -GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’所述引物與基因omp25的412_618bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。采用上述的用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物的檢測反應(yīng)體系，25 μ L反應(yīng)體系為:外引物F3:5pmol.L ^0.5 μ L外引物Β3:5pmol.L ^0.5 μ L內(nèi)引物FIP:40pmol.L'0.5μ L內(nèi)引物BIP:40pmol.L ^0.5 μ LMg2+:100πιΜ、2μ L甜菜堿:5M、4yLdNTP 混合液:IOmM, 3.5 μ L
不含Mg2+的 IOXbuffer:2.5 μ LBst DNA 聚合酶:8U.μ L' I μ L模板:2yL去離子水:8 μ L反應(yīng)溫度為63°C。布魯桿菌0MP25基因庫登錄號:U33003.1布魯桿菌0MP25基因引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)見圖4。I材料和方法1.1 材料Bst DNA聚合酶、EcoR I限制性內(nèi)切酶、MgSO4購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；Betaine Solution(甜菜堿)、DNA marker、全血基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；布魯桿菌弱毒疫苗(S2株)購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠；胎兒彎曲桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌株購自廣州粵晨生物科技有限公司；羊、牛、豬、犬種布魯桿菌基因組核酸由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。1.2引物設(shè)計(jì)與合成米用引物設(shè)計(jì)軟件Primer4.0 (http: //primerexlorer.jp; Eiken ChemicalC0.Ltd, Japan)，針對布魯桿菌保守的0MP25蛋白基因設(shè)計(jì)了 4條LAMP的特異性引物，包括2條外引物(F3和B3)以及2條內(nèi)引物(FIP和BIP)，引物序列見表I。表I引物序列表
權(quán)利要求
1.一種用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，其特征在于，包含擴(kuò)增布魯桿菌保守基因omp25特異堿基序列的正向內(nèi)引物FIP、正向外引物F3、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3，序列如下: 外引物:F3 5 ’ -ATTGCCGGTTCGCAGATC-3， B3 5’ -GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’ 內(nèi)引物:FIP 5’ -TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3，BIP 5’ -GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’ 所述引物與基因omp25的412-618bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
2.采用如權(quán)利要求1所述的用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物的檢測反應(yīng)體系，其特征在于，25 μ L反應(yīng)體系為:外引物 F3:5pmol.L'0.5μ L外引物 Β3:5pmol.L'0.5μ L內(nèi)引物 FIP:40pmol.L'0.5μ L內(nèi)引物 BIP:40pmol.L'0.5μ LMg2+:100πιΜ、2μ L舌甘菜堿:5Μ、4μ LdNTP 混合液:1 0mM、3.5 μ L不含 Mg2+ 的 IOXbuffer:2.5μ LBst DNA 聚合酶:8U.μ L' I μ L模板:2 μ L去離子水:8 μ L反應(yīng)溫度為63 C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于布魯桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物及檢測反應(yīng)體系，針對布魯桿菌保守的OMP25蛋白基因設(shè)計(jì)了4條LAMP的特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了布魯桿菌的LAMP快速檢測方法。特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能夠特異地檢測布魯桿菌，其最低檢測限為5copies/μL。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳、顯色反應(yīng)進(jìn)行判定。LAMP可以快速、直觀、準(zhǔn)確地檢測布魯桿菌，是一種適合基層現(xiàn)場應(yīng)用的檢測方法。
文檔編號C12Q1/04GK103243095SQ201310186230
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者李秀梅 申請人:天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心