專利名稱：口蹄疫病毒分型診斷環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一套用于病毒分型診斷的引物組、試劑盒及其實(shí)時(shí)診斷方法，尤其涉及一套用于診斷0型、AsiaI型、A型、C型、SATl型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、試劑盒及其使用方法，屬于口蹄疫病毒檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Food and MouthDisease Virus,FMDV)感染偶蹄類動物引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動物疫病，會給畜牧養(yǎng)殖業(yè)，尤其是進(jìn)出口貿(mào)易造成巨大損失。口蹄疫病毒有0型、AsiaI型、A型、C型、SATl型、SAT2型、SAT3型七種血清型，各血清型之間無交叉免疫反應(yīng)，我國曾出現(xiàn)過0型、A型和AsiaI型的疫情，C型和非洲型在周邊國家的出現(xiàn)也對我國威脅較大，因此建立快速、準(zhǔn)確的口蹄疫病毒分型診斷方法對于防控國內(nèi)疫情以及防止國外病毒的入侵具有重要的戰(zhàn)略意義。目前，口蹄疫的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病原生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法三大類。其中， 病原生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法對實(shí)際樣品具有一定的依賴性，尤其是對于免疫動物、感染并有癥狀動物與已感染但尚未出現(xiàn)發(fā)病癥狀動物難以進(jìn)行區(qū)分和及時(shí)有效的判斷，而基于核酸檢測的分子生物學(xué)方法可從根本上解決這一難題，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸分子診斷方法成為我國口蹄疫病毒診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)對溫度具有一定的依賴性，需要精準(zhǔn)的溫度循環(huán)變化設(shè)備作為技術(shù)保障，不僅增加了檢測時(shí)間，也增加了檢測的成本。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法是2000年由日本Notomi博士發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，更具有簡便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，該方法得到不斷完善，尤其在結(jié)果判定方面，已有多種肉眼可視的方法得到廣泛應(yīng)用，可從源頭上控制住由電泳開蓋造成的氣溶膠污染，特別適合于現(xiàn)場快速檢測以及田間檢測。中國發(fā)明專利200810034124和201210221684分別提供了 0型和C型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法，靈敏度高，檢測時(shí)間短，特別適合用于口蹄疫病毒的現(xiàn)場快速診斷。然而，由于口蹄疫病毒核酸序列的型間差異比較分散，而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)又相對比較復(fù)雜，目前尚未見有關(guān)口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分型診斷研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一套用于口蹄疫病毒分型診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由0型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組構(gòu)成，可用于0型口蹄疫病毒或者AsiaI型口蹄疫病毒或者A型口蹄疫病毒或者C型口蹄疫病毒或者SATl型口蹄疫病毒或者SAT2型口蹄疫病毒或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。所述各型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組是通過大量比對Genbank中下載的七種血清型口蹄疫病毒的核酸序列，針對特異性差異較大的VPl片段所設(shè)計(jì)，每種引物組均包括一對外引物和一對內(nèi)引物，A型引物組中另包括一條環(huán)引物(SEQ N0.13)，SAT3型引物組中另包括一對環(huán)引物(SEQ N0.30,SEQ N0.31)。引物組中的各引物可按一定比例配制成引物組溶液，用于制備口蹄疫病毒分型診斷試劑盒，其中內(nèi)引物與外引物的濃度比例確定方法為，分別按內(nèi)引物與外引物的濃度比例為2: 1-12: I配制引物組溶液，構(gòu)成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的濁度信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線。30min內(nèi)可監(jiān)測到擴(kuò)增信號的引物組溶液的內(nèi)引物、夕卜引物濃度比例為6: 1-12: 1，根據(jù)獲得濁度信號的時(shí)間及試劑使用量確定內(nèi)外引物對濃度的最優(yōu)比例，優(yōu)選比例為8: 1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1: 2。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種口蹄疫病毒分型診斷試劑盒，由0型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、 C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SAT3型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液構(gòu)成，其特征在于，可以進(jìn)行0型口蹄疫病毒或者AsiaI型口蹄疫病毒或者A型口蹄疫病毒或者C型口蹄疫病毒或者SATl型口蹄疫病毒或者SAT2型口蹄疫病毒或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種型口蹄疫病毒的分型診斷。該試劑盒適用樣品類型有發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)等組織；病毒細(xì)胞培養(yǎng)液、血清等。所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液，可以是使擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)出熒光信號的一種商品化試劑盒Isothermal Master mix或者等效的其他試劑盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜堿、MgS04和緩沖溶液構(gòu)成。試劑盒中還同時(shí)引入一組陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品是由各型口蹄疫病毒人工合成片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其濃度均為lng/ii L，陰性質(zhì)控品是不含口蹄疫病毒基因組的介質(zhì)溶液。本發(fā)明還提供一種用于口蹄疫病毒分型診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的使用方法，其特征在于，將7個(gè)反應(yīng)管作為一個(gè)整體，分別加入0型口蹄疫病毒、AsiaI型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SATl型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)同步等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的熒光信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線和溶解曲線，也可以使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)同步等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的濁度信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線。所述各型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25iiL，其中包括各型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液5 u L，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液15 u L，待測試樣或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品各5 y L ;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)的擴(kuò)增程序?yàn)?①65°C，60min，②98°C -80°C，0.05°C /s，lOmin，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)的擴(kuò)增程序?yàn)?65°C,60min ;擴(kuò)增結(jié)果的分析和判定方法為:(I)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)測得的擴(kuò)增曲線平臺熒光值高于本底噪音信號5倍且溶解曲線為單一尖銳峰的判定為陽性結(jié)果，擴(kuò)增曲線平臺熒光值低于本底噪音信號5倍的判定為陰性結(jié)果，擴(kuò)增曲線平臺熒光值高于本底噪音信號5倍但溶解曲線不是單一尖銳峰的判定為非特異性的交叉干擾信號。(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)測得的擴(kuò)增曲線的濁度值超過0.1的判定為陽性結(jié)果，擴(kuò)增曲線的濁度值低于0.1的判定為陰性結(jié)果。(3)陽性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陽性結(jié)果，陰性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果的視為有效試驗(yàn)，否則試驗(yàn)無效，重新進(jìn)行。(4)待測試樣各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果，則未檢測到口蹄疫病毒；待測試樣各反應(yīng)管任意一管為陽性結(jié)果，則為該型口蹄疫病毒感染；待測試樣各反應(yīng)管任意兩管或者多管為陽性結(jié)果，則為口蹄疫病毒混合感染。其中0型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SATl型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒、SAT3型口蹄疫病毒的擴(kuò)增曲線以20min時(shí)的讀數(shù)為基準(zhǔn)，AsiaI型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的擴(kuò)增曲線以60min時(shí)的讀數(shù)為基準(zhǔn)。一種用于口蹄疫病毒分型診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的使用方法，還包括靈敏度的檢驗(yàn)，其方法為，用DEPC 水稀釋每種血清型口蹄疫病毒的陽性質(zhì)控品(lng/iiL)，濃度梯度為 lng/ V- L、IOOpg/ u L、IOpg/ u L、lpg/ u L、IOOfg/ u L、IOfg/ u L、lfg/ u L,進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，分別通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的熒光信號，比較兩種檢測方法的靈敏度。


圖10型口蹄疫病毒引物組溶液中內(nèi)、外引物摩爾數(shù)比的影響。圖2實(shí)時(shí)熒光檢測法0型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，(b)實(shí)時(shí)熒光溶解曲線圖3實(shí)時(shí)濁度檢測法0型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4實(shí)時(shí)熒光檢測法0型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5實(shí)時(shí)濁度檢測法0型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖60型口蹄疫乳鼠傳代毒株實(shí)時(shí)熒光檢測法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，(b)實(shí)時(shí)熒光溶解曲線圖7實(shí)時(shí)熒光檢測法AsiaI型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8實(shí)時(shí)濁度檢測法AsiaI型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9實(shí)時(shí)熒光檢測法AsiaI型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10實(shí)時(shí)濁度檢測法AsiaI型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1lAsiaI型口蹄疫乳鼠傳代毒株實(shí)時(shí)熒光檢測法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖12實(shí)時(shí)熒光檢測法A型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖13實(shí)時(shí)濁度檢測法A型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖14實(shí)時(shí)熒光檢測法A型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15實(shí)時(shí)濁度檢測法A型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖16A型口蹄疫乳鼠傳代毒株實(shí)時(shí)熒光檢測法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖17實(shí)時(shí)熒光檢測法C型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖18實(shí)時(shí)濁度檢測法C型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖19實(shí)時(shí)熒光檢測法C型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖20實(shí)時(shí)濁度檢測法C型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖21實(shí)時(shí)熒光檢測法SATl型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖22實(shí)時(shí)濁度檢測法SATl型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖23實(shí)時(shí)熒光檢測法SATl型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖24實(shí)時(shí)濁度檢測法SATl型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖25實(shí)時(shí)熒光檢測法SAT2型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖26實(shí)時(shí)濁度檢測法SAT2型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖27實(shí)時(shí)熒光檢測法SAT2型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖28實(shí)時(shí)濁度檢測法SAT2型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖29實(shí)時(shí)熒光檢測法SAT 3型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖30實(shí)時(shí)濁度檢測法SAT3型口蹄疫病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖31實(shí)時(shí)熒光檢測法SAT3型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖32實(shí)時(shí)濁度檢測法SAT3型口蹄疫病毒引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。附圖標(biāo)記圖1中的2: 1、4: 1、6: 1、8: UlO: 1、12: I分別代表引物組溶液中內(nèi)、
外引物摩爾數(shù)比圖2-圖32中的0、AS、A、C、S1、S2、S3分別代表0型口蹄疫病毒、AsiaI型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SATl型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒、SAT3型口蹄疫病毒，水代表陰性質(zhì)控品。其中，引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖中的X-X均代表用前者所代表血清型的口蹄疫病毒引物組溶液擴(kuò)增后者所代表血清型的口蹄疫病毒模板，引物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖中X-X均代表用前者所代表血清型的口蹄疫病毒引物組溶液擴(kuò)增對應(yīng)血清型口蹄疫病毒的不同濃度的模板。具體實(shí)施方法下面以0型口蹄疫病毒的具體實(shí)施方法為例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1.試驗(yàn)材料與方法1.1試驗(yàn)材料七種血清型口蹄疫病毒VP3-VP1-2A人工合成片段，是參考Genbank上已發(fā)表的序列(所參考的0型口蹄疫病毒的序列號為HM008917.1)人工合成，片段連接到PMD18-TSimple載體上，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 a，以30%甘油的菌液的形式儲存。0型口蹄疫病毒的乳鼠傳代毒株由蘭州獸醫(yī)研究所提供。1.2引物設(shè)計(jì)
運(yùn)用DNAMAN軟件對七種血清型口蹄疫病毒的VP3-VP1-2A片段進(jìn)行比對，選擇各型差異性較大的VPl片段作為祀序列，運(yùn)用在線軟件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)0型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組,包括一對外引物(SEQ N0.USEQ N0.2)和一對內(nèi)引物(SEQ N0.3、SEQ N0.4)，其引物序列為:
權(quán)利要求
1.一套用于口蹄疫病毒分型診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，由O型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增弓I物組構(gòu)成，其特征在于，可用于O型口蹄疫病毒或者Asial型口蹄疫病毒或者A型口蹄疫病毒或者C型口蹄疫病毒或者SATl型口蹄疫病毒或者SAT2型口蹄疫病毒或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種型口蹄疫病毒診斷時(shí)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。
所述O型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，由一對外引物(SEQ N0.1、SEQ N0.2)和一對內(nèi)引物(SEQ N0.3, SEQ N0.4)組成，其引物序列為: 引物名稱序列(5’-3’) caacgcgagXgot^cctSEQ N0.2 TTCACAGGCGCCACAATCSEQ N0.3 CCCGAGTGGCTTTGATGGCGCC-CAAGTGTTGACCCCGAAGGSEQ No’:4 GCTTTACCGCATGAAGAGGGCC-TCGCTCGGGTGAATAGCC_ 所述AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，由一對外引物(SEQN0.5, SEQ N0.6)和一對內(nèi)引物(SEQ N0.7, SEQ N0.8)組成，其引物序列為: 引物名稱一一引^^-.(5’_3’) —SEqn0.5CGCCTTCGTTCTCGACAGSEQ N0.6 GGGTTGGTGTGGTTGTTCASEQ N0.7ACCAGTGTGTGTGAGGGGATCT-TGAAACTCACCCAGCCCA SEQ N0.8CTCAGACCTGGAGGTTGCGC-GGTCTTAGGCGCACCATTG__ 所述A型口蹄設(shè)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，由一對外引物(SEQ N0.9、SEQ N0.10)、一對內(nèi)引物(SEQ N0.1USEQ N0.12)和一條環(huán)引物(SEQ N0.13)組成，其引物序列為:引物名稱__引物序列(5’-3，)__SEQ N0.10 CCCAGGTCAGATTACCATCGSEQ N0.1] TGACATGTGTGGGGCTCAGG-ACGTCGGCTTCATCATGGASEQ N0.12 ACACCCACAAACACGGGATCG-CCGCACA ACAATCTCCAAGT SEQ N0.13 GCAGCCACGTACTACTTCTCC__ 所述C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，由一對外引物(SEQN0.14、SEQN0.15)和一對內(nèi)引物(SEQ N0.16、SEQ N0.17)組成，其引物序列為: 弓丨物~~~，) SEQN0.14AATCACTCACGGCAAGGC ''SEQ N0.15GAAGGCAACGTCGGTGTGSEQ N0.16TCTAGCGTCCACAGGTAGCCG-GCTCGTCGTCTCCGCATCASEQ N0.11CGACCACTGGTGA ATCTGCTGA-GACCTGAGTCTCTCCTCCG 所述SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，由一對外引物(SEQN0.18、SEQN0.19)和一對內(nèi)引物(SEQ N0.20、SEQ N0.21)組成，其引物序列為:
2.如權(quán)利要求1所述的0型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組、SAT3型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，用于口蹄疫病毒診斷的方法包括:1)直接熒光目視方法，其特征在于，在擴(kuò)增反應(yīng)前向體系中加入鈣黃綠素作為熒光指示劑，可直接通過肉眼觀測結(jié)果，反應(yīng)管中反應(yīng)液呈綠色的為陽性結(jié)果，不呈綠色的為陰性結(jié)果；2)紫外光照射熒光目視方法，其特征在于，擴(kuò)增反應(yīng)后反應(yīng)管中反應(yīng)液在紫外光照射下，呈紅色熒光的為陽性結(jié)果，不呈紅色的為陰性結(jié)果；3)凝膠電泳方法，其特征在于，反應(yīng)后反應(yīng)液電泳時(shí)有特征梯形條帶者為陽性結(jié)果，無特征梯形條帶者為陰性結(jié)果；4)實(shí)時(shí)熒光檢測方法，其特征在于，反應(yīng)時(shí)實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)管中的熒光信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線和溶解曲線，進(jìn)而判定檢測結(jié)果；5)實(shí)時(shí)濁度檢測方法，反應(yīng)時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)管中的濁度信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線，進(jìn)而判定檢測結(jié)果；6)微全分析方法，其特征在于，樣品裂解、核酸提取純化、等溫?cái)U(kuò)增和檢測均集成在微全分析系統(tǒng)上自動完成，結(jié)果判定方法包括前述的直接熒光日視方法、紫外光照射熒光目視方法、凝膠電泳方法、實(shí)時(shí)熒光檢測方法、實(shí)時(shí)濁度檢測方法，該微全分析系統(tǒng)由微膜片泵(閥)驅(qū)動，通過程序控制微膜片泵(閥)的開啟與閉合實(shí)現(xiàn)微流體樣品的驅(qū)動控制。
3.—種如權(quán)利要求1所述的各型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組用于口蹄疫病毒分型診斷的試劑盒，主要由0型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、AsiaI型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、C型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SATl型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、SAT3型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液、各型口蹄疫病毒陽性質(zhì)控品和各型口蹄疫病毒陰性質(zhì)控品構(gòu)成，其特征在于，采用實(shí)時(shí)熒光檢測方法和實(shí)時(shí)濁度檢測方法，實(shí)現(xiàn)口蹄疫病毒分型診斷，可以進(jìn)行O型口蹄疫病毒或者AsiaI型口蹄疫病毒或者A型口蹄疫病毒或者C型口蹄疫病毒或者SATl型口蹄疫病毒或者SAT2型口蹄疫病毒或者SAT3型口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種型口蹄疫病毒的分型診斷。
所述O型、AsiaI型、C型、SATl型、SAT2型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液，其特征在于，是由其中的內(nèi)引物與外引物按6: 1-12: I的比例配制成，優(yōu)選比例為8: I ；所述A型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液，其特征在于，是由一對內(nèi)引物、一對外引物和一條環(huán)引物按一定的比例配置而成，其中內(nèi)引物與外引物按6: 1-12: I的比例配制成，優(yōu)選比例為8: 1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1: 2;所述SAT3型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，是由內(nèi)引物、外引物和一對環(huán)引物按一定的比例配置而成，其中內(nèi)引物與外引物按6: 1-12: I的比例配制成，優(yōu)選比例為8: 1，環(huán)引物與內(nèi)引物的比例為1: 2。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液，其特征在于，-由Bst聚合酶、dNTP、甜菜堿、MgSO4、緩沖溶液和顯色試劑構(gòu)成。所述各型口蹄疫病毒陽性質(zhì)控品，其特征在于，可以是由各型口蹄疫病毒人工合成片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其濃度均為lng/ u L0所述各型口蹄疫病毒陰性質(zhì)控品，其特征在于，不含口蹄疫病毒基因組片段。
4.一種如權(quán)利要求3所述的口蹄疫病毒分型診斷試劑盒，其特征在于，將7個(gè)反應(yīng)管作為一個(gè)整體，分別加入0型口蹄疫病毒、AsiaI型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SATl型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒、SAT3型口蹄疫病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組溶液5 y L，各型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液15 y L，待測試樣或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品各5 u L。所述實(shí)時(shí)熒光檢測方法，其特征在于，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)同步等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)管中的熒光信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線和溶解曲線，熒光檢測系統(tǒng)的擴(kuò)增程序?yàn)?①65°C，60min，②98°C _80°C，0.05°C /s, IOmin0所述實(shí)時(shí)濁度檢測方法，其特征在于，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)同步等溫?cái)U(kuò)增并實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)管中的濁度信號，獲得等溫?cái)U(kuò)增曲線，濁度檢測系統(tǒng)的擴(kuò)增程序?yàn)?65°C，60mino
5.一種如權(quán)利要求2所述的口蹄疫病毒分型診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，擴(kuò)增結(jié)果的分析和判定方法為: (1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)測得的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)平臺時(shí)，其熒光值高于本底噪音信號5倍且溶解曲線為單一尖銳峰的判定為陽性結(jié)果，其熒光值高于本底噪音信號5倍但溶解曲線不是單一尖銳峰的判定為非特異性的交叉干擾信號；其熒光值低于本底噪音信號5倍的判定為陰性結(jié)果。
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增濁度檢測系統(tǒng)測得的擴(kuò)增曲線的濁度值超過0.1的判定為陽性結(jié)果，擴(kuò)增曲線的濁度值低于0.1的判定為陰性結(jié)果。
(3)陽性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陽性結(jié)果且陰性質(zhì)控品各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果的視為有效試驗(yàn)，否則試驗(yàn)無效，重新進(jìn)行。
(4)當(dāng)待測試樣各反應(yīng)管全部為陰性結(jié)果時(shí)，則未檢測到口蹄疫病毒；待測試樣各反應(yīng)管任意一管為陽性結(jié)果，則為該型口蹄疫病毒感染；待測試樣各反應(yīng)管任意兩管或者多管為陽性結(jié)果，則為所對應(yīng)型口蹄疫病毒的混合感染。其中0型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SATl型口蹄疫病毒、SAT2型口蹄疫病毒、SAT3型口蹄疫病毒的擴(kuò)增曲線以20min時(shí)的讀數(shù)為基準(zhǔn)，AsiaI型口蹄疫病毒`和A型口蹄疫病毒的擴(kuò)增曲線以60min時(shí)的讀數(shù)為基準(zhǔn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于口蹄疫病毒診斷的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其使用方法。所述試劑盒，其特征在于，分別由O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物混合液、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)預(yù)混液、各型口蹄疫病毒陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品構(gòu)成，可進(jìn)行O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型的口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種血清型口蹄疫病毒的分型診斷。所述試劑盒的使用方法，其特征在于，可通過等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)或者等溫?cái)U(kuò)增濁度系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)口蹄疫病毒實(shí)時(shí)分型診斷。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，為口蹄疫病毒防控及各型流行趨勢調(diào)查分析提供了一種簡便、快速的途徑。
文檔編號G01N21/64GK103224994SQ201310067020
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者鄒明強(qiáng), 薛強(qiáng), 孫芳芳 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院