專利名稱：一種磁性納米基因載體系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，具體涉及磁性納米基因載體系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，基因治療在遺傳疾病和腫瘤治療研究方面已經(jīng)成為一個(gè)最活躍的領(lǐng)域之
一?；蜉d體的研究是基因治療研究的核心。由于非病毒性基因載體具有安全、低毒等方面的優(yōu)點(diǎn)，使其成為基因載體研究的熱點(diǎn)。大多數(shù)非病毒載體在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較高的基因轉(zhuǎn)染效果，但在體內(nèi)靶組織的轉(zhuǎn)染效果卻很低。因此，在基因治療過程中，基因載體的靶向性是基因治療的瓶頸之一。磁靶向基因傳遞系統(tǒng)因具有高的體外基因表達(dá)效率，良好的體內(nèi)靶向性等優(yōu)點(diǎn)使其極具應(yīng)用前景的載體系統(tǒng)。目前，應(yīng)用最多的磁性載體材料是陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺(PEI)和聚酰胺)和陽離子脂質(zhì)成分等修飾的正電性的磁性納米粒子。這些正電性的磁性納米粒子在提供給基因載體系統(tǒng)磁響應(yīng)性的同時(shí),壓縮DNA。但是，這些正電性的磁性納米粒子在制備過程中易產(chǎn)生磁性納米粒子的聚集體(Acta Biomater, 2011.7(3): p.1319-26.)，與基因靜電作用結(jié)合后，更易形成較大粒徑的基因復(fù)合物，并具有較高的表面正電荷，易產(chǎn)生高的細(xì)胞毒性，從而其影響其體外的基因轉(zhuǎn)染的效果及體內(nèi)應(yīng)用的安全性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對磁性基因載體存在的不足，提供了一種磁性納米基因載體系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。作為優(yōu)選方式，所述磁性納米基因載體系統(tǒng)中，三種組分間通過靜電相互作用，所述負(fù)電性的磁性納米粒子和基因彌散地分布于所述陽離子載體中。采用具有負(fù)電性磁性納米粒子，一方面使磁性納米粒子相互之間產(chǎn)生靜電排斥作用，避免磁性納米粒子相互團(tuán)聚，另一方面，由于基因是帶負(fù)電的，負(fù)電性磁性納米粒子與基因不形成緊密的靜電吸附結(jié)合，使基因在進(jìn)入靶向位置后更易于與磁性納米粒子脫離，同時(shí)磁性納米粒子和基因之間存在一定的靜電排斥作用有助于壓縮基因，而且負(fù)電性磁性納米粒子與陽離子載體產(chǎn)生靜電作用更有利于陽離子載體的體積收縮，使得載體系統(tǒng)的體積更小，并降低載體表面電荷，更有利于其傳遞和穿膜。所述基因載體系統(tǒng)中磁性納米粒子和基因彌散地分布于所述陽離子載體中，其分布更均勻，整個(gè)系統(tǒng)的物理化學(xué)性能更均一，在于外加磁場配合進(jìn)行祀向運(yùn)輸時(shí)也能使整個(gè)系統(tǒng)受力更均衡，移動更平穩(wěn)。作為優(yōu)選方式，本發(fā)明中所述負(fù)電性的磁性納米粒子為表面修飾負(fù)電性有機(jī)材料的鐵氧磁性納米粒子。其平均粒徑優(yōu)選為5 50 nm,其表面電位優(yōu)選為_5 -50 mV。小粒徑的磁性納米粒子可以確保形成的小粒徑的磁性基因復(fù)合物。較高的負(fù)電位保證磁性納米粒子與陽離子載體更加緊密地靜電結(jié)合。作為優(yōu)選方式，上述的鐵氧磁性納米粒子是指四氧化三鐵，伽馬三氧化二鐵，摻有如錳，鈷或鋅等金屬元素的鐵氧磁性納米粒子中的一種。作為優(yōu)選方式，上述負(fù)電性有機(jī)材料為羧基硅烷偶聯(lián)劑、氨基酸類樹狀分子、酒石酸、檸檬酸、草酸、乙酸中的至少一種。作為優(yōu)選方式，本發(fā)明所述的陽離子載體為聚乙烯亞胺，聚賴氨酸，聚酰胺等聚陽離子，魚精蛋白和陽離子脂質(zhì)體中的至少一種。作為優(yōu)選方式，本發(fā)明所述的磁性納米基因載體系統(tǒng)的基因?yàn)槊撗鹾颂呛怂?、核糖核酸中的一種。作為優(yōu)選方式，所述三種組分間的比例，具體為:陽離子載體與基因的比例按照質(zhì)量比例為0.1:1 50:1 ;負(fù)電性的磁性納米粒子與基因的比例，按照磁性納米粒子中鐵元素質(zhì)量與基因的質(zhì)量之比為0.2:1 100:1。本發(fā)明還提供了一種所述磁性納米基因載體系統(tǒng)的制備方法，具體步驟如下:
1)將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液
中；
2)將三種組分的溶液混合均勻后室溫下放置5 30分鐘得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。作為優(yōu)選方式，在上述步驟2)中可以先將任意兩種組分的溶液均勻混合，并放置5^30分鐘，得到二元混合物，再加入第三種組分的溶液均勻混合，并放置5 30分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)；也可以直接將三種組分的溶液混合均勻后在室溫下放置5 30分鐘得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。作為優(yōu)選方式，上述磁性納米基因載體系統(tǒng)制備過程中所述的緩沖溶液是HBG緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，20毫摩爾，pH 7.4，5%葡萄糖)或pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中的一種。本發(fā)明還提供了一種所述磁性納米基因載體系統(tǒng)的應(yīng)用，即將其用于體外基因轉(zhuǎn)染、腫瘤、心血管疾病的基因治療或基因疫苗。作為優(yōu)選方式，將本發(fā)明所述磁性納米基因載體系統(tǒng)用于呼吸道相關(guān)疾病的治療時(shí)，采用呼吸道給藥方式。該方式有利于磁性納米基因載體系統(tǒng)快速抵達(dá)病灶，提高療效。作為優(yōu)選方式，還將所述磁性納米基因載體系統(tǒng)與外加磁場相結(jié)合，通過外加磁場的作用將基因載體系統(tǒng)集中到病灶部位。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所述的磁性納米載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于將負(fù)電性的磁性納米粒子直接通過靜電作用力與PEI/DNA 二元復(fù)·合物結(jié)合，形成三元磁性納米基因復(fù)合物，體系的制備方法簡單，快捷。這種負(fù)電性的磁性納米粒子不僅為基因載體體系提供了對磁場的響應(yīng)性，并且在不影響PEI對基因壓縮的同時(shí)，降低了基因載體的粒徑和表面電荷，從而降低了載體的細(xì)胞毒性，提高了其基因轉(zhuǎn)染效率；尤其在有血清條件下的體外轉(zhuǎn)染，表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染能力。


圖1是PEI/DNA 二元基因復(fù)合物和MNP/PEI/DNA三元基因復(fù)合物的瓊脂糖凝膠測試結(jié)果，泳道左起分別為裸質(zhì)粒DNA，PEI/DNA 二元基因復(fù)合物(PD)，MNP/PEI/DNA三元基因復(fù)合物(MPD)，其中鐵元素與DNA的質(zhì)量比例為0.4:1。圖2是在有、無血清條件下，PEI/DNA 二元基因復(fù)合物(PD)和MNP/PEI/DNA三元基因復(fù)合物(MPD)在磁場條件下介導(dǎo)pEGFP對H印G2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖，標(biāo)尺是500 μ m。圖3是PEI/DNA 二元基因復(fù)合物(PD)和MNP/PEI/DNA三元基因復(fù)合物(MPD)在有無血清條件下介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖。圖4是PEI/DNA 二元基因復(fù)合物(PD)和MNP/PEI/DNA三元基因復(fù)合物(MPD)在轉(zhuǎn)染條件下對HepG2細(xì)胞的毒性測試結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。所述基因載體系統(tǒng)通過·以下方法制備:
將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中；按照陽離子載體與基因的質(zhì)量比為0.3:1，將陽離子載體加入基因溶液中，室溫下放置8分鐘，得到溶液二元基因復(fù)合物；再按照鐵元素與基因的質(zhì)量之比為0.2:1的比例，將負(fù)電性的磁性納米粒子加入二元基因復(fù)合物中(所述磁性納米粒子平均粒徑為20nm，表面電位為
-25mV)，室溫下放置6分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。實(shí)施例2
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。所述基因載體系統(tǒng)通過以下方法制備:
將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中；按照陽離子載體與基因的質(zhì)量比為45:1，將基因溶液加入陽離子載體中，室溫下放置30分鐘，得到溶液二元基因復(fù)合物；再按照鐵元素與基因的質(zhì)量之比為10:1的比例，將負(fù)電性的磁性納米粒子加入二元基因復(fù)合物中(所述磁性納米粒子平均粒徑為50nm，表面電位為
-48mV)，室溫下放置25分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。實(shí)施例3
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。所述基因載體系統(tǒng)通過以下方法制備:
將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中(所述磁性納米粒子平均粒徑為12nm，表面電位為-18mV);按照陽離子載體與基因的質(zhì)量比為12:1，將陽離子載體加入負(fù)電性的磁性納米粒子中，室溫下放置18分鐘，得到二元復(fù)合物；再按照鐵元素與基因的質(zhì)量之比為8:1的比例，將基因溶液加入二元復(fù)合物中，室溫下放置12分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。
實(shí)施例4
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。所述基因載體系統(tǒng)通過以下方法制備:
將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中(所述磁性納米粒子平均粒徑為28nm，表面電位為_30mV);按照鐵元素與基因載體的質(zhì)量之比為90:1的比例，將負(fù)電性的磁性納米粒子加入陽離子載體中，室溫下放置28分鐘，得到溶液二元復(fù)合物；再按照陽離子載體與基因質(zhì)量比為0.8:1的比例，將基因溶液加入二元復(fù)合物中，室溫下放置10分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。實(shí)施例5
一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子(MNP)，陽離子載體和基因組成。所述基因載體系統(tǒng)通過以下方法制備:
將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中；將負(fù)電性的磁性納米粒子和基因溶液混合均勻后(所述磁性納米粒子平均粒徑為20nm，表面電位為_25mV)，室溫下放置，5分鐘，得到二元混合物；將陽離子載體加入二元混合物中，室溫下放置15分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。其中陽離子載體與基因的質(zhì)量比為1.5:1，磁性納米粒子中鐵元素與基因的質(zhì)量之比為20:1。實(shí)施例6:磁性納米基因載體系統(tǒng)的制備
將質(zhì)粒DNA溶于無菌水中，配制成濃度為0.2 mg/mL的DNA溶液；將陽離子聚合物基因載體聚乙烯亞胺(PEI)溶于無菌HBG緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，20毫摩爾，pH 7.4，5%葡萄糖)中，配制成濃度為0.2 mg/mL的PEI溶液；羧基硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米粒子(MNP)分散于無菌HBG緩沖液中，配制成鐵元素濃度為73 μ g/mL的MNP溶液。按照質(zhì)量比為1.3 = UfPEI溶液加入質(zhì)粒DNA溶液中，均勻混合后在室溫下靜置孵育10分鐘后，得到PEI/DNA 二元基因復(fù)合物。再按照鐵元素與DNA的質(zhì)量比為0.4:1，向二元基因復(fù)合物中加入鐵元素濃度為73 μ g/mL的MNP，在室溫下靜置孵育5分鐘后，得到MNP/PEI/DNA三元磁性納米基因復(fù)合物。實(shí)施例7:磁性納米基因載體系統(tǒng)的凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)
將1.3 μ L 0.2 mg/mL的PEI溶液加I μ L 0.2 mg/mL的DNA溶液中，均勻混合后在室溫下靜置孵育10分鐘，得到PEI/DNA 二元基因復(fù)合物。再加入I μ L鐵元素濃度為73 μ g/mL的MNP，并在室溫下靜置孵育5分鐘后，得到MNP/PEI/DNA三元磁性納米基因復(fù)合物。以PEI/DNA 二元基因復(fù)合物作為對照，利用凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)檢測基因復(fù)合物在負(fù)電性的磁性納米粒子加入后的穩(wěn)定性。附圖2的電泳結(jié)果表明，所加入的負(fù)電性的磁性納米粒子不會影響陽離子聚合物對DNA的壓縮。本實(shí)施例所選取的陽離子載體與基因的質(zhì)量比能夠使所得的三元復(fù)合物具有合適的氮磷比，從而提高其轉(zhuǎn)染效率，本實(shí)施了所選取的鐵元素與基因的質(zhì)量比，使所得的三元復(fù)合物既具有很高的磁轉(zhuǎn)染效率又具有很好的磁響應(yīng)性。實(shí)施例8:磁性納米基因載體系統(tǒng)的透射電鏡、粒徑和Zeta電位實(shí)驗(yàn)
將19.5 μ L 0.2 mg/mL的PEI溶液加入15 μ L 0.2 mg/mL的DNA溶液中，均勻混合后在室溫下靜置孵育10分鐘后，再加入15 μ L鐵元素 濃度為73 μ g/mL的MNP，并在室溫下靜置孵育5分鐘，得到MNP/PEI/DNA三元磁性納米基因復(fù)合物。將制備的樣品用滅菌水稀釋至I mL后，進(jìn)行粒徑和Zeta電位檢測。按照上述方法制備的三元復(fù)合物顆粒的性能如表I所示。表I MNP/PEI/DNA三元磁性納米基因復(fù)合物的性能
權(quán)利要求
1.一種磁性納米基因載體系統(tǒng)，其特征在于，由具有負(fù)電性的磁性納米粒子，陽離子載體和基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，三種組分間通過靜電相互作用，所述負(fù)電性的磁性納米粒子和基因彌散地分布于所述陽離子載體中。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述負(fù)電性的磁性納米粒子為表面修飾負(fù)電性有機(jī)材料的四氧化三鐵，伽馬三氧化二鐵或摻有錳、鈷或鋅的鐵氧磁性納米粒子中的至少一種；其平均粒徑尺度在5 50 nm之間，其表面電位在_5 -50 mV之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的負(fù)電性有機(jī)材料為羧基硅烷偶聯(lián)劑、氨基酸類樹狀分子、酒石酸、檸檬酸、草酸、乙酸中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的陽離子載體為聚乙烯亞胺，聚賴氨酸，聚酰胺等聚陽離子，魚精蛋白和陽離子脂質(zhì)體中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述三種組分間的比例，具體為陽離子載體與基因的比例按照質(zhì)量比例為O. I Γ 50 1 ;負(fù)電性的磁性納米粒子與陽離子載體的比例，按照磁性納米粒子中鐵元素質(zhì)量與基因的質(zhì)量之比為O. 2:1 100Io
7.一種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的基因載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，具體步驟如下 1)將基因溶于無菌水中，陽離子載體和負(fù)電性的磁性納米粒子分別溶于無菌的緩沖液中； 2)將三種組分的溶液混合均勻后室溫下放置5 30分鐘得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟2)中先將任意兩種組分的溶液均勻混合，并放置5 30分鐘，得到二元混合物，再加入第三種組分的溶液均勻混合，并放置5 30分鐘，得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)；或直接將三種組分的溶液混合均勻后在室溫下放置1(Γ30分鐘得到三元磁性納米基因載體系統(tǒng)。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的磁性納米基因載體系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，其用于體外基因轉(zhuǎn)染、腫瘤、心血管疾病的基因治療或基因疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的磁性納米基因載體系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，將所述磁性納米基因載體系統(tǒng)與外加磁場相結(jié)合，通過外加磁場的作用將基因載體系統(tǒng)集中到病灶部位。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁性納米基因載體系統(tǒng)及其制備和應(yīng)用，該基因載體系統(tǒng)由負(fù)電性的磁性納米粒子，陽離子載體和基因組成；三種組分間通過靜電相互作用按照一定比例和復(fù)合順序制備成磁性納米基因載體系統(tǒng)。本發(fā)明的磁性納米基因載體系統(tǒng)，制備方法簡單，具有粒徑小、表面電荷合適的理化性質(zhì)。相對于非磁性納米復(fù)合物，在外加磁場的作用下，其對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率顯著提高。同時(shí)，其細(xì)胞毒性也明顯降低。
文檔編號C12N15/85GK103255175SQ201310184988
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者顧忠偉, 聶宇, 謝麗, 何一燕, 姜倩, 岳冬, 江雯, 劉克霞 申請人:四川大學(xué)