專(zhuān)利名稱(chēng)：一種瓊脂糖酶的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬酶工程研究開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶的方法研究,適合工業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
瓊膠是一種重要的海藻多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠組成。瓊膠酶降解瓊膠糖，根據(jù)其作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類(lèi):α -瓊膠酶和β -瓊膠酶。α -瓊膠酶裂解瓊月父糖的α _1，3_糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為非還原性末端和以3,6_內(nèi)醚-a-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖列；β -瓊膠酶裂解瓊膠糖的β -1，4-糖苷鍵，生成以β -D-半乳糖為還原性末端和以3，6-內(nèi)醚-a -L-半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖系列。瓊膠酶降解過(guò)程具有得率高、污染小和產(chǎn)物的安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是降解瓊膠糖最有潛力的方法。瓊膠酶降解瓊膠糖生產(chǎn)瓊寡糖產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于食品業(yè)，化妝品業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，例如作為天然的防腐劑、淀粉老化抑制劑、功能性食品基料、抗氧化劑等。同時(shí)瓊膠酶在海藻的單細(xì)胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等過(guò)程具有重要的使用價(jià)值，是一種海藻遺傳工程的工具酶；在分子生物學(xué)方面，利用瓊膠酶降解瓊膠糖從瓊膠糖凝膠中回收DNA和RNA，已經(jīng)被證明是最好的方法之一；瓊膠酶也用于海藻多糖的結(jié)構(gòu)研究，用瓊膠酶水解某些海藻的多糖，測(cè)定其水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而推測(cè)多糖的結(jié)構(gòu)，是行之有效的方法。但目前該酶的應(yīng)用研究主要是對(duì)游離酶，但游離酶穩(wěn)定性差，保質(zhì)期短，重復(fù)利用率低，往往使應(yīng)用成本增高而限制了其應(yīng)用。所以在酶的應(yīng)用研究中，固定化酶的研究是生物技術(shù)領(lǐng)域中新興的一門(mén)技術(shù)。酶的固定化是指用載體材料將酶限制于一定空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)，固定化酶可回收及反復(fù)連續(xù)利用的一類(lèi)技術(shù)。固定化 酶保留了游離酶高效專(zhuān)一、溫和的催化性質(zhì)，同時(shí)又克服了游離酶的缺點(diǎn)，具有高穩(wěn)定性、易分離純化、回收使用、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。然而，廣泛投入工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶卻不多。因此，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更經(jīng)濟(jì)適用的固定化方法，使更多的酶取得工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，仍是科技工作者追求的目標(biāo)。酶的固定化方法常用的是:吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合和法包埋法。在此基礎(chǔ)上還出現(xiàn)了上述方法的結(jié)合法等酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關(guān)鍵。所以在酶固定化領(lǐng)域，作為固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。甲殼素是由乙酰胺基葡萄糖以β_1，4鏈連接而成的天然線性高聚物，是自然界中僅次于纖維素的第二可再生資源。殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；磻?yīng)得到的產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)中含有豐富的游離氨基。選擇殼聚糖作為固定化載體是基于它來(lái)源豐富，具親水性，生物相容性以及抗微生物分解特性等。殼聚糖氨基與戊二醛基形成schifT堿，在膠囊表面形成一層致密的保護(hù)膜，可增加微膠囊球的強(qiáng)度，這就是吸附-交聯(lián)法固定化酶。由于目前瓊脂糖酶的固定化國(guó)內(nèi)外還沒(méi)人研究，所以利用廉價(jià)的殼聚糖作為固定化載體固定瓊脂糖酶具有較大的理論和實(shí)踐意義。而本方法研究的目的是開(kāi)發(fā)殼聚糖的應(yīng)用領(lǐng)域，并可以增強(qiáng)瓊脂糖酶在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明涉及用殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，其特征在殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，包括以下過(guò)程:步驟(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；步驟(二):將步驟(一)的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖將凝聚成白色顆粒，過(guò)濾收集殼聚糖珠；步驟(三):將步驟(二)的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性；步驟(四):將步驟(三)的殼聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過(guò)夜；步驟(五):取步驟(四)中的殼聚糖珠載體2.5_5g，加入2.5%的戊二醛20-25ml，水浴振蕩0.5小時(shí)，室溫交聯(lián)5_6小時(shí)，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體；步驟(六):在步驟(五)中的殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10_15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4°C固定2-3小時(shí)，用磷酸緩沖液沖洗；步驟(七):將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。2.根據(jù)本發(fā)明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖微球。


圖1是pH值對(duì)酶活性的影響圖，圖2是溫度對(duì)酶活性的影響圖，圖3是游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶方法包括以下實(shí)施例，下面的實(shí)施例可進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:pH值對(duì)酶活性的影響平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應(yīng)的游離酶，在不同pH(4.0-9.0)條件下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測(cè)定其酶活力，結(jié)果如圖1所示。圖1表明,游離酶的最適pH值為8.0，隨著pH值的升高酶活性下降；對(duì)固定化酶而言，在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)PH值達(dá)到8.5的時(shí)候酶活性達(dá)到最大值，固定化使酶的最適pH往堿性方面升高0.5個(gè)單位，符合酶和載體結(jié)合后的基本規(guī)律。實(shí)施例2:溫度對(duì)酶活性的影響平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應(yīng)的游離酶，在不同溫度(30°C -80°C )條件下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測(cè)定其酶活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，游離瓊脂酶在40°C下表現(xiàn)出最高活力，隨溫度升高，活力急劇下降，酶開(kāi)始失活，但對(duì)固定化酶而言，在40-60°C范圍內(nèi)均有較大酶活，50°C時(shí)酶活力達(dá)最大值，固定化酶耐熱性顯著提高。實(shí)施例3:游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應(yīng)的游離酶，在不同溫度(20°C -80°C )條件下保溫0.5h，然后加底物與其作用，分別測(cè)定其酶活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，酶液在40°C以下短暫保溫對(duì)酶活影響較小，溫度進(jìn)一步提升至50°C時(shí)對(duì)游離酶活性影響增加，損失約為27.36%，而對(duì)固定化酶活力影響仍較小。在60°C時(shí)，游離酶的活性很低，而固定化酶活約為50%，70°C時(shí)酶基本都已完全沒(méi)有活性，說(shuō)明固定化酶的熱穩(wěn)定性高于游離酶。實(shí)施例4:固定化酶的操作穩(wěn)定性取固定化酶0.5g，加0.5%瓊脂糖底物1.5ml與之反應(yīng)，連續(xù)操作6次，分別測(cè)定6次反應(yīng)后的酶活力大小,結(jié)果如表I。表I固定化瓊脂酶的操作穩(wěn)定性
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及用殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，其特征在殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，包括以下過(guò)程: 步驟(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解； 步驟(二):將步驟(一)的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖將凝聚成白色顆粒，過(guò)濾收集殼聚糖珠； 步驟(三):將步驟(二)的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性； 步驟(四):將步驟(三)的殼聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過(guò)夜；步驟(五):取步驟(四)中的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5%的戊二醛20-251111，水浴振蕩0.5小時(shí),室溫交聯(lián)5-6小時(shí),磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體； 步驟(六):在步驟(五)中的殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10-15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4°C固定2-3小時(shí)，用磷酸緩沖液沖洗； 步驟(七):將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。
2.根據(jù)本發(fā) 明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖微球。
全文摘要
本發(fā)明所屬酶工程研究開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種瓊脂糖酶的固定化方法研究。用1.5-2％(V/V)乙酸配制1∶20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；溶解后的殼聚糖溶液逐滴滴入1mol/L氫氧化鈉溶液中，過(guò)濾收集殼聚糖珠；用蒸餾水洗滌至中性，再用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過(guò)夜；取浸泡的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5％的戊二醛20-25ml，水浴振蕩0.5小時(shí)，室溫交聯(lián)5-6小時(shí)，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體；在殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10-15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4℃固定2-3小時(shí)，用磷酸緩沖液沖洗；抽真空得到固定化瓊脂糖酶。本發(fā)明制備固定化酶的方法，載體廉價(jià)易得，工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)酶活性損失小，酶活回收率可達(dá)到77.6％。
文檔編號(hào)C12N11/10GK103232988SQ201310128450
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月4日
發(fā)明者朱啟忠, 張瑞, 張揚(yáng) 申請(qǐng)人:山東大學(xué)(威海)