專利名稱：基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法。
背景技術(shù)：
豬薩佩羅病毒(Porcine Sapelovirus)是微RNA病毒科薩佩羅病毒屬的一種豬的病毒。它可以引起豬的神經(jīng)紊亂、繁殖失敗、呼吸衰竭、肺炎以及腹瀉等綜合癥狀。該病毒可以同其他豬的病毒發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)非常巨大的經(jīng)濟(jì)威脅。因此，對(duì)該種病毒的檢測(cè)，是早預(yù)防、早防治以及解除豬群間相互感染的重要措施。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)的是中國(guó)第一株薩佩羅病毒(PSV-Csh)(基因編號(hào):HQ875059)，該病毒的基因組全長(zhǎng)是7502個(gè)堿基對(duì)，只有一個(gè)開放閱讀框架，編碼一個(gè)多聚蛋白前體，在基因組的5’端和3’端是基因組的非翻譯區(qū) 5’ UTR 和 3’ UTR0目前，對(duì)于該病毒的檢測(cè)手段有很多，如病毒的分離、酶聯(lián)免疫吸附法、各種PCR手段。病毒分離和酶聯(lián)免疫吸附法都是最基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，但是卻也是最耗時(shí)的檢測(cè)手段，對(duì)于突發(fā)性的疫病的提前診斷，不能做到盡早的檢測(cè)，這樣可能會(huì)耽誤了疫病的控制。分子生物學(xué)的檢測(cè)方法已經(jīng)越來(lái)越受到重視，如RT-PCR已經(jīng)成為一種常規(guī)的檢測(cè)手段，但是這些方法需要高精密的儀器和熟練的技術(shù)。對(duì)于那些偏遠(yuǎn)地區(qū)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)和動(dòng)物診所來(lái)說(shuō)，這些方法并不能發(fā)揮它們的作用。本發(fā)明報(bào)道的用于檢測(cè)豬薩佩羅病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、高特異的檢測(cè)方法，最值得關(guān)注的是該檢測(cè)方法不需要昂貴的儀器，只需要一個(gè)水浴鍋，即可完成整個(gè)檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，是由日本學(xué)者Notoni等人研發(fā)的一種在恒溫條件下完成的具有高特異和高效率的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法針對(duì)目的基因的6個(gè)特異區(qū)域設(shè)計(jì)4個(gè)引物，在鏈置換DNA聚合酶-Bst DNA聚合酶的作用下，恒溫保持幾十分鐘，即可完成擴(kuò)增。其原理是內(nèi)引物FIP的F2序列起始反應(yīng)，外引物F3進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，置換出新鏈，然后內(nèi)引物BIP與新鏈結(jié)合打開莖環(huán)，B3在BIP外側(cè)形成互補(bǔ)鏈，最終形成一個(gè)類似啞鈴形狀的DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為擴(kuò)增反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)，開始了循環(huán)和延伸，保證了反應(yīng)的不斷進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)是在反應(yīng)管內(nèi)加入DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，一步法完成RNA的擴(kuò)增。這不僅節(jié)省了 RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)耗材、試劑，也提高了 RNA的擴(kuò)增效率。RT-LAMP在病毒檢測(cè)方面有著傳統(tǒng)檢測(cè)方法所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì):①快速:整個(gè)實(shí)驗(yàn)的完成只需2h，對(duì)于熟練地工作人員來(lái)說(shuō)只需1.5h，同時(shí)它不要特殊的儀器，只要在一個(gè)恒溫的設(shè)備中即可完成該實(shí)驗(yàn)，無(wú)需復(fù)雜的溫控設(shè)備；②擴(kuò)增效率高:幾個(gè)拷貝反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物可以達(dá)到IO9拷貝檢測(cè)方便快速:由于反應(yīng)產(chǎn)物很多，在反應(yīng)管內(nèi)會(huì)形成白色渾濁物，可以據(jù)此判斷反應(yīng)是否發(fā)生，也可以利用熒光染料鈣黃綠素進(jìn)行閉管檢測(cè)，這樣既避免了核酸造成的環(huán)境污染又節(jié)省了電泳所需時(shí)間RT-LAMP節(jié)省了將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的過(guò)程，避免了核酸的二次污染以及RNA酶的污染；⑤特異性高:4條引物需要模板結(jié)合，才會(huì)出現(xiàn)啞鈴形狀，才能出現(xiàn)循環(huán)和大量的擴(kuò)增。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、快速、簡(jiǎn)單地檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，可應(yīng)用于各級(jí)動(dòng)物預(yù)防控制中心、各級(jí)動(dòng)物診所以及企業(yè)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法。本發(fā)明所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，包含如下步驟:(I)設(shè)計(jì)4條引物所述引物包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，所述引物序列如SEQID NO: 1-4 所示； (2)制備待測(cè)樣品采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA ；(3)配制反應(yīng)液采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書在反應(yīng)管中加入反應(yīng)緩沖液、酶混液、4條引物、熒光染料鈣黃綠素、所述RNA和水，總體積為25 μ L ;(4)進(jìn)行反應(yīng)將配制好的所述反應(yīng)管置于反應(yīng)設(shè)備中，60 65°C恒溫反應(yīng)lh，83°C 5min結(jié)束反應(yīng)；(5)結(jié)果檢測(cè)。具體操作如下:(I)設(shè)計(jì)4條引物通過(guò)在線搜索引擎BLAST和序列分析軟件DNAstar篩選出薩佩羅病毒的相對(duì)保守序列區(qū)5’ UTR0根據(jù)這段序列，利用Primer Explorer VE4.0設(shè)計(jì)出4條引物,其中包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，引物序列如SEQ ID N0:l_4所示。 (2)制備待測(cè)樣品采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA。(3)配制反應(yīng)液采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書在反應(yīng)管中加入12.5μ L2X反應(yīng)緩沖液(RM) ;1.0yL酶混合液(EM);終濃度為0.20 μ M的外引物F3和Β3 ;終濃度為:1.6 μ M的內(nèi)引物FIP和BIP ;1.0μ L熒光染料鈣黃綠素；5μ L所述RNA ;補(bǔ)足去離子水至總體積25 μ L0(4)進(jìn)行反應(yīng)將配置好的反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀或水浴鍋中，60 65°C恒溫反應(yīng)lh，83°C 5min結(jié)束反應(yīng)。(5)結(jié)果判斷。將反應(yīng)管置于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀中，根據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀輸出的擴(kuò)增曲線判斷反應(yīng)液中的反應(yīng)情況。將反應(yīng)管置于水浴鍋中，由于反應(yīng)液中加入了熒光染料鈣黃綠素，所以可根據(jù)反應(yīng)前后反應(yīng)液顏色的變化判斷反應(yīng)是否發(fā)生:a)樣品反應(yīng)管液體呈黃綠色，該樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；b)樣品反應(yīng)管液體呈橙紅色，該樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性。此外，也可以采用渾濁度觀察法，如果發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)液的顏色會(huì)由透明變?yōu)槿榘咨?，但是該方法的精確度不高。根據(jù)本發(fā)明所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為63°C。本發(fā)明的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒檢測(cè)的方法，檢測(cè)方便快速，僅經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)便可達(dá)到檢測(cè)目的；檢測(cè)靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需2.97 X IO2拷貝/微升；鑒定簡(jiǎn)便，根據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀或熒光染料鈣黃綠素的變色情況即可判斷反應(yīng)是否發(fā)生。以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。


圖1是具體實(shí)施例1中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀的監(jiān)測(cè)結(jié)果。1:63°C ；2:65V ;3:61°C。圖2是具體實(shí)施例2中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀的監(jiān)測(cè)結(jié)果。1:豬薩佩羅病毒。圖3是具體實(shí)施例3中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀的監(jiān)測(cè)結(jié)果。左起依次為:2.97X IO8拷貝、2.97X IO9 拷貝、2.97X IO7 拷貝、2.97X IO6 拷貝、2.97X IO5 拷貝、2.97X IO4 拷貝、
2.97 X IO3拷貝、2.97 X IO2拷貝、2.97 X IO1拷貝(水平線)、陰性對(duì)照(水平線)。本發(fā)明中，所用 試劑、儀器均可從市售獲得。所用病毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和附表通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:RT_LAMP檢測(cè)豬薩佩羅病毒最佳反應(yīng)溫度在GeneBank上獲得中國(guó)第一株豬薩佩羅病毒的全基因組(登錄號(hào)為HQ875059)，根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，篩選出該基因組的保守序列區(qū)5’UTR，針對(duì)該序列的六個(gè)特異序列區(qū)設(shè)計(jì)出4條引物并合成。薩佩羅病毒的RNA模板的獲得是利用天根的RNA\DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書提取病毒純液。按照北京蘭譜生物科技有限公司購(gòu)買的RT-LAMP反應(yīng)試劑盒的操作說(shuō)明書配置反應(yīng)體系，總體積為25 μ L0外引物F3和Β3的終濃度為0.2 μ Μ，內(nèi)引物FIP和BIP的終濃度為1.6μΜ。按照如上反應(yīng)體系配置反應(yīng)液，設(shè)計(jì)三個(gè)反應(yīng)溫度:61°C、63°C和65°C。將平行兩組反應(yīng)管分別放置于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀和水浴鍋中，反應(yīng)時(shí)間為60min。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增曲線明顯指示63°C為最佳反應(yīng)溫度。置于水浴鍋中的第二組反應(yīng)管中顯示置于63°C的反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度比其它反應(yīng)管強(qiáng)，雖然反應(yīng)的渾濁度肉眼觀察區(qū)別不明顯，但也可以說(shuō)明63°C為最佳反應(yīng)溫度。實(shí)施例2 =RT-LAMP檢測(cè)豬薩佩羅病毒的特異性選取不含有薩佩羅病毒的豬捷申病毒(？17\哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng))、豬腸道病毒9 (PEV9\實(shí)驗(yàn)室保存)、豬口蹄疫病毒(FMDV\購(gòu)買于中國(guó)中牧實(shí)業(yè)股份有限公司)、豬腸道病毒9 (PEV9\實(shí)驗(yàn)室保存)、腦心肌炎病毒(EMCV\蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng))、豬傳染性胃腸炎(TGEV\實(shí)驗(yàn)室保存)、豬流行性腹瀉(PEDV實(shí)驗(yàn)室保存)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV\實(shí)驗(yàn)室保存)核酸，按照如上的反應(yīng)體系配置反應(yīng)液，兩組平行的反應(yīng)管，分別放置在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀和水浴鍋中，溫度設(shè)置63°C，保存70min，80°C 5min結(jié)束反應(yīng)。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增曲線明顯指示只有豬薩佩羅病毒的樣品發(fā)生了擴(kuò)增。置于水浴鍋中的第二組反應(yīng)管中顯示只有含有豬薩佩羅病毒的反應(yīng)液的顏色由橙紅色變成黃綠色。說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物的特異性很高。實(shí)施例3 =RT-LAMP檢測(cè)豬薩佩羅病毒的靈敏度將提取的豬薩佩羅病毒的RNA用無(wú)RNase的水以10倍梯度進(jìn)行稀釋，RNA母液的濃度為:2.97Χ109拷貝/微升。依次稀釋為2.97\108拷貝/微升、2.97父107拷貝/微升、2.97Χ106拷貝/微升、2.97Χ105拷貝/微升、2.97Χ104拷貝/微升、2.97Χ103拷貝、2.97X IO2拷貝/微升和2.97Χ101拷貝/微升。按照如上的反應(yīng)體系配置反應(yīng)液，兩組平行的反應(yīng)管，分別放置于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀和水浴鍋中，溫度設(shè)置為63°C，保存60min，80°C 5min結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果分析方法同上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終顯示豬薩佩羅病毒的RT-LAMP的最低檢出限度為2.97 X IO2拷貝/微升，但是此反應(yīng)最佳的反應(yīng)濃度是2.97 X IO8拷貝/微升，并不是模板濃度越高越好。實(shí)施例4 =RT-LAMP檢測(cè)豬薩佩羅病毒的臨床驗(yàn)證選取28份健康公豬(湖南)的糞樣，提取RNA。按照如上的反應(yīng)體系配置反應(yīng)液，兩組進(jìn)行平行反應(yīng)。分別放置于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀和水浴鍋中，溫度設(shè)為63°C，保存60min，80°C 5min結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果分析方法同上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有3份樣品出現(xiàn)擴(kuò)增，陽(yáng)性率為
10.7%。對(duì)相同的樣品用普通RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，RT-PCR結(jié)果顯示有2份樣品出現(xiàn)擴(kuò)增，陽(yáng)性率為7.1%。說(shuō)明RT-LAMP比RT-PCR方法靈敏度更加敏銳，可以檢測(cè)到樣品中低含量的病毒。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本 發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，包含如下步驟: (1)設(shè)計(jì)4條引物 所述弓I物包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，所述弓I物序列如SEQ IDNO: 1-4 所示； (2)制備待測(cè)樣品 采用商品化的RNA\DNA病毒核酸的提取試劑盒提取樣品的RNA ； (3)配制反應(yīng)液 采用商品化的RT-LAMP試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書在反應(yīng)管中加入反應(yīng)緩沖液、酶的混合I液、所述4條引物、熒光染料鈣黃綠素、所述RNA和水，總體積為25 μ L ; (4)進(jìn)行反應(yīng) 將配制好的所述反應(yīng)管置于反應(yīng)設(shè)備中，60 65°C恒溫反應(yīng)lh，83°C 5min結(jié)束反應(yīng)； (5)結(jié)果檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，所述4條引物是通過(guò)在線搜索引擎BLAST和序列分析軟件DNAstar篩選出薩佩羅病毒的相對(duì)保守序列區(qū)5’UTR并根據(jù)這段序列利用PrimerExplorer VE4.0設(shè)計(jì)出來(lái)的。
3.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述外引物在所述反應(yīng)液的終濃度為0.20 μ M0
4.如權(quán)利要求3中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物在所述反應(yīng)液的終濃度為1.6μΜ。
5.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述反應(yīng)設(shè)備為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀。
6.如權(quán)利要求5中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(5)中，所述結(jié)果檢測(cè)的方法為根據(jù)所述實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀輸出的擴(kuò)增曲線判斷所述反應(yīng)液中的反應(yīng)情況。
7.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，所述反應(yīng)設(shè)備為水浴鍋。
8.如權(quán)利要求7中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述步驟(5)中，所述結(jié)果檢測(cè)的方法為根據(jù)反應(yīng)前后的所述反應(yīng)液顏色的變化判斷反應(yīng)是否發(fā)生:a)所述樣品反應(yīng)管液體呈黃綠色，則所述樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；b)所述樣品反應(yīng)管液體呈橙紅色，則所述樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性。
9.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:反應(yīng)溫度為63°C。
10.如權(quán)利要求1中所述的基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，其特征在于:所述RNA在所述反應(yīng)液中的終濃度為2.97X IO8拷貝/微升。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，提供了一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法。本發(fā)明的方法為篩選出豬薩佩羅病毒的保守序列區(qū)5'UTR并根據(jù)所述保守序列區(qū)設(shè)計(jì)4條引物；準(zhǔn)備待測(cè)樣品；配制反應(yīng)液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(RT-LAMP)；通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度儀輸出的擴(kuò)增曲線、熒光染料鈣黃綠素的變色情況或者直接觀察反應(yīng)液的濁度變化鑒定反應(yīng)結(jié)果。對(duì)于相關(guān)的檢測(cè)部門或公司來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了一種廉價(jià)、快速、高效、高特異的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173577SQ201310127728
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者崔立, 王春艷, 郁達(dá)義, 華修國(guó), 劉雨瀟, 湯賽冬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)