專利名稱：一種規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法及其用于生產(chǎn)病毒的方法
一種規(guī)模化培養(yǎng)細胞增殖的方法及其用于生產(chǎn)病毒的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物制品制造領(lǐng)域，尤其涉及一種規(guī)模化培養(yǎng)細胞增殖的方法及其將增殖細胞用于生產(chǎn)病毒的方法。
背景技術(shù)：
疫苗免疫是預(yù)防和控制病毒類疾病的有效措施，疫苗生產(chǎn)過程中需要依賴培養(yǎng)基質(zhì)或大量動物細胞，如禽流感疫苗的生產(chǎn)，傳統(tǒng)方法是以雞胚為培養(yǎng)基質(zhì)，但用雞胚尿囊液分離或傳代禽流感病毒易引起抗原性變異；大規(guī)模生產(chǎn)時還存在雞胚數(shù)量不足和潛在外源病毒污染等生物安全問題；應(yīng)用動物細胞生產(chǎn)疫苗，可完全避免雞胚中的蛋白質(zhì)引起的不良反應(yīng)，可克服雞胚要求嚴格、來源少的問題，但用犬腎細胞(Mardin Darby canine kidneycells, MDCK)生產(chǎn)疫苗時，由于MDCK細胞培養(yǎng)過程中存在很嚴重的“失巢凋亡”現(xiàn)象，即細胞一旦不黏附其它基質(zhì)就會發(fā)生凋亡，存在細胞培養(yǎng)體積較小的問題，通常培養(yǎng)體積在100L左右，且培養(yǎng)的細胞族細胞密度較小，在5X IO5 I X IO6ceIls/ml，要實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗，需要先生產(chǎn)多組細胞系，工藝復(fù)雜，不能滿足要求。因此應(yīng)用動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗，關(guān)鍵在于細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種規(guī)模化培養(yǎng)細胞增殖的方法及其用于生產(chǎn)病毒的方法，以解決上述生產(chǎn)病毒時細胞系體積小，細胞密度也小，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗的要求的問題。
技術(shù)方案如下:
一種規(guī)?；囵B(yǎng) 細胞增殖的方法，包括:
將細胞經(jīng)過逐級放大懸浮培養(yǎng)，得到體積為100 200L的細胞系；
在微載體中加入DMEM培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)；
將預(yù)培養(yǎng)后的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，懸浮培養(yǎng)后，得到目標細胞系。
進一步，所述體積為100 200L的細胞系的培養(yǎng)過程中，先將細胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，得到初級細胞；再將初級細胞經(jīng)逐級放大懸浮培養(yǎng)，加入微載體和培養(yǎng)液，待微載體上的細胞長滿單層后，對微載體進行消化，收獲細胞，得到所述體積為100 200L的細胞系。
進一步，所述微載體的預(yù)培養(yǎng)過程中，先用PBS液對所述微載體洗滌三次，浸泡4h，去掉上清后進行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)至少三次；加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)至少12h，去掉上清；再加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次預(yù)培養(yǎng)至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)至少6h后打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中。
進一步，所述第一次預(yù)培養(yǎng)加入8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)13h ;所述第二次預(yù)培養(yǎng)加入8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)13h ;所述第三次預(yù)培養(yǎng)加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7h。
進一步，所述目標細胞系的培養(yǎng)過程包括:
I)將預(yù)培養(yǎng)后的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進行懸浮培養(yǎng)，加入含5 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，攪拌速度為35 55 轉(zhuǎn) /min ；
2)懸浮培養(yǎng)的前5 IOh中，每隔半小時停止攪拌10分鐘；
3)培養(yǎng)20 30h后，去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；
4)培養(yǎng)至40 50h時，加入含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500 600L，繼續(xù)培養(yǎng)至70 80h。
進一步，所述步驟I)中，細胞培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)的初始培養(yǎng)體積為150 250L。
進一步，所述步驟I)中，所述DMEM培養(yǎng)基中胎牛血清的含量為10%，所述初始培養(yǎng)體積為200L，所述攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min ；
所述步驟2)中，懸浮培養(yǎng)的前6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘；
所述步驟3)中，24h后去掉150L上清，所述DMEM培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，加入量為250L ；
所述步驟4)中，培養(yǎng)至48h時，所述DMEM培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，加入所述DMEM培養(yǎng)基至反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)體積為550L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。
進一步，所述細胞為犬腎細胞MDCK細胞。
—種以上述規(guī)?；囵B(yǎng)的細胞系為基質(zhì)生產(chǎn)病毒的方法，包括:根據(jù)MOI值,在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8,DO值為30%_50%，增殖48_72h后，取其上清液，收獲病毒液。
進一步，所述病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明培養(yǎng)的細胞系細胞密度>4X106Cells/ml，是滾瓶細胞培養(yǎng)密度的10倍以上，且細胞系的形態(tài)好，質(zhì)量高，培養(yǎng)體積為650L以上。
2、本發(fā)明實施例以MDCK細胞為基質(zhì)，增殖重組H5N1亞型禽流感病毒，具有無外源因子污染、易于規(guī)?；a(chǎn)、生產(chǎn)線占用空間小、生產(chǎn)效率高、成本低、能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定等優(yōu)點。
3、本發(fā)明生產(chǎn)的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價不低于1:2048。


圖1實施例中重組病毒增殖生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實施方式
下面參考附圖并結(jié)合實施例，進一步詳細說明本發(fā)明。
實施例中優(yōu)選，MDCK細胞為普通MDCK細胞，H5N1亞型禽流感病毒為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供的 重組H5N1亞型禽流感病毒(Re-4、Re-5, Re-6株)，細胞培養(yǎng)反應(yīng)器為Applikon公司生產(chǎn)，微載體為GE公司的Cytodexl球狀微載體。本發(fā)明規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其包括如下步驟:S1:種細胞培養(yǎng):將細胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，得到初級細胞；本實施例優(yōu)選，將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。S2:細胞的逐級放大:將初級細胞接種于細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進行懸浮培養(yǎng)，加入微載體和培養(yǎng)液，待微載體上的細胞長滿單層后，加入消化細胞胰酶，對細胞和微載體消化分離，經(jīng)細胞收獲、細胞液濃縮，得到濃縮細胞；將濃縮細胞接種于較大細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，重復(fù)上述細胞培養(yǎng)過程，逐級放大培養(yǎng)，最后得到目標細胞系。優(yōu)選地，如圖1中S21所示，S21:長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的 種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為40 60轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。如圖1中S22所示，S22:將7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為40 60轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。如圖1中S23所示，S23:將30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為35 55轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)40 50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0 2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述S21 S23步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度35-38 °C、PH值7.2-7.4、溶解氧(dissolved oxygen, DO)為30%_50%，微載體用量為3_5g/L，增殖48_72h，消化細胞胰酶為乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, EDTA)-胰酶,堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eaglemedium, DMEM)和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗漆微載體三次,浸泡4h,然后去掉上清,加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)至少12h，去掉上清，再加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至少6h后，打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。預(yù)培養(yǎng)指微載體在培養(yǎng)基中浸泡的過程。②如圖1中S24所示，S24包括:I)將130L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮
培養(yǎng)；2)加入堿和糖，添加含5 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在150 250L，攪拌速度為35 55轉(zhuǎn)/min ；3)最初培養(yǎng)的5 IOh,每隔半小時停止攪拌10分鐘；4)20 30h后去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；
5)培養(yǎng)至40 50h時，補加含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500 600L，繼續(xù)培養(yǎng)至70 80h，最后得到細胞密度彡4X106cells/ml的第二細胞系。
上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度35-38 °C、PH值7.2-7.4、DO值為30%_50%，微載體用量為3-5g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
本發(fā)明還涉及通過大規(guī)模培養(yǎng)基質(zhì)細胞以生產(chǎn)病毒的方法。可在本發(fā)明實施例中的MDCK細胞中生長的病毒包括所有對MDCK細胞敏感的病毒，其包括但不限于:流感病毒，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV),副流感病毒,乳多空病毒,水泡性口膜炎病毒，痘苗病毒，柯薩奇病毒，呼腸弧病毒，細小病毒，腺病毒，骨髓灰質(zhì)炎病毒，麻疫病毒，狂犬病病毒皰疹病毒。優(yōu)選為H5N1亞型禽流感病毒。
一種通過規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖以生產(chǎn)病毒的方法，包括:
如圖1中S25所示，S25:根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI),在上述實施例中得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8、DO值為30%-50%，增殖48_72h后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。
參照《中國獸藥典》(2010版)描述的病毒血凝效價的測定方法，測得本發(fā)明所得重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價不低于1:2048。
其中，MOI =有感染力的病毒量/細胞總量。
上述的方法實施例中，改變細胞的培養(yǎng)工藝，會得到不同細胞密度的細胞系，不同質(zhì)量的病毒，下面通過以下的各個實施例詳細說明。
實施例1
將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為5升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)40h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將5升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到25升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min,加入微載體、 培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)40h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將25升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到100升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為35轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)40h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度35°C、PH值7.2、DO值為30%，微載體用量為3g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。
在100L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)12h，去掉上清，再加入8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣12h，去掉上清，再加入含5%胎牛血清的8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后，打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。②100L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在150L，攪拌速度為35轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的5h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。20h后去掉100L上清，加入200L含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至40h時，補加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500L，繼續(xù)培養(yǎng)至70h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度35°C、PH值7.2、D0值為30%，微載體用量為3g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為32°C、PH值7.2、DO值為30%，增殖48h后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4X106cells/ml，細胞的形態(tài)好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。實施例2將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。長滿單層的6個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為10升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為60`轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。將10升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到35升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。將35升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到200升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為55轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)50h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積2.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度38°C、PH值7.4、DO值為50%，微載體用量為4g/L，增殖72h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。在200L-800L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入9000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)14h，去掉上清，再加入9000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣14h，去掉上清，再加入含20%胎牛血清的9000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)8h后，打入800L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。
②200L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入800L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在250L，攪拌速度為55轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的10h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。30h后去掉200L上清，加入300L含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至50h時，補加含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至600L，繼續(xù)培養(yǎng)至80h，得到目標細胞系。
上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度38°C、PH值7.4,DO值為50%，微載體用量為4g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為38 °C、PH值7.8、DO值為50%，增殖60后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。
本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.5X106cells/ml，細胞的形態(tài)好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。
實施例3
將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的5個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為50轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為50轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)48h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，加入微載體、 培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.3、DO值為40%，微載體用量為5g/L，增殖60h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。
在130L-700L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入8500ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)13h，去掉上清，再加入8500ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣13h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)7h后，打入700L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入700L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在200L，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h后去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至550L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.3,DO值為40%，微載體用量為5g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為35°C、PH值7.5、DO值為40%，增殖72后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.7X106cells/ml，細胞的形態(tài)好，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:2048。實施例4將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為70轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)45h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。將7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為70轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)45h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。將30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為30轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)45h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積3.0倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度36°C、PH值7.3、DO值為35%，微載體用量為6g/L，增殖55h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入6000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)10h，去掉上清，再加入6000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣10h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的6000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后，打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。②130L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在200L，攪拌速度為30轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。15h后去掉50L上清，加入100L含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至40h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至600L，繼續(xù)培養(yǎng)至60h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度36°C、PH值7.3,DO值為35%，微載體用量為6g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為35 °C、PH值7.5、DO值為50%，增殖72后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為3.2X106cells/ml，細胞的形態(tài)較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。實施例5將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)48h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮；收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，重復(fù)上述步驟，收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進行放大懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，其他步驟同上，得到第一細胞系。上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.2-7.4、DO值為50%，微載體用量為5g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入5000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)10h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的5000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后，打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。②130L細胞培養(yǎng) 反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在200L，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h后去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.2,DO值為50%，微載體用量為5g/
L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述方法得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為 ο μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為35°C、PH值
7.5、DO值為50%，增殖72h后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為3.lX106cells/ml，細胞的形態(tài)較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。實施例6將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。長滿單層的4個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)48h,待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮；收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，重復(fù)上述步驟，收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進行放大懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，其他步驟同上，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度38°C、PH值7.2、DO值為50%，微載體用量為5g/L，增殖48h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。
在130L-650L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，加入8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)12h，去掉上清，再加入8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次培養(yǎng)，同樣12h，去掉上清，再加入含10%胎牛血清的8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后，打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入650L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在200L，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min。24h后補加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。
上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度38°C、PH值7.4、D0值為50%，微載體用量為5g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。
根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述方法得到的MDCK第二細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為 ο μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為35°C、PH值7.5、DO值為50%，增殖72h后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。
本實施例得到的目標細胞系細胞密度為4.0X 106cells/ml，細胞的形態(tài)較差，得到的重組H5N1亞型禽流感病毒的血凝效價為1:1024。
實施例7
將MDCK細胞經(jīng)滾瓶培養(yǎng)，長滿單層后，得到初級MDCK細胞。
長滿單層的5個15000ml的初級MDCK細胞，消化下來作為7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器的種子細胞進行懸浮培養(yǎng)，攪拌速度為50轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將7升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為50轉(zhuǎn)/min,加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖,培養(yǎng)48h,待微載體上的細胞長滿單層,去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮。
將30升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲到的細胞放大到130升細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，加入微載體、培養(yǎng)液以及堿和糖，培養(yǎng)48h，待微載體上的細胞長滿單層，去掉上清，加入反應(yīng)器內(nèi)剩余液體體積1.5倍的消化細胞胰酶，進行微載體的消化分離，再進行細胞收獲、細胞液濃縮，得到第一細胞系。
上述第一細胞系培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.3、DO值為40%，微載體用量為5g/L，增殖60h，消化細胞胰酶為EDTA-胰酶，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖，培養(yǎng)液主要包括DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清。
在130L-700L放大過程中，其工藝過程具體操作如下:
①用PBS液洗滌微載體三次，浸泡4h，然后去掉上清，打入700L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，上述操作均無菌操作。
②130L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中收獲的第一細胞系打入700L細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，加入堿和糖，添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，控制初始培養(yǎng)體積在200L，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min，最初培養(yǎng)的6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘。24h后去掉150L上清，加入250L含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至48h時，補加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至550L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，得到目標細胞系。上述步驟中，細胞培養(yǎng)條件為溫度37°C、PH值7.3,DO值為40%，微載體用量為5g/L，堿為碳酸氫鈉，糖為葡萄糖。根據(jù)H5N1亞型禽流感病毒的MOI值，在上述實施例中得到的MDCK目標細胞系中接種H5N1亞型禽流感病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為35 °C、PH值7.5、DO值為40%，增殖72后，取其上清液，收獲病毒液，微載體回收重復(fù)利用。本實施例得到的目標細胞系細胞密度為2.0X 106cells/ml，細胞的形態(tài)較差，得到的重組H5N1亞型禽 流感病毒的血凝效價為1:512。
權(quán)利要求
1.一種規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，包括: 將細胞經(jīng)過逐級放大懸浮培養(yǎng)，得到體積為100 200L的細胞系； 在微載體中加入DMEM培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)； 將預(yù)培養(yǎng)后的微載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，懸浮培養(yǎng)后，得到目標細胞系。
2.如權(quán)利要求1所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述體積為100 200L的細胞系的培養(yǎng)過程中，先將細胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，得到初級細胞；再將初級細胞經(jīng)逐級放大懸浮培養(yǎng)，加入微載體和培養(yǎng)液，待微載體上的細胞長滿單層后，對微載體進行消化，收獲細胞，得到所述體積為100 200L的細胞系。
3.如權(quán)利要求1所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述微載體的預(yù)培養(yǎng)過程中，先用PBS液對所述微載體洗滌三次，浸泡4h，去掉上清后進行預(yù)培養(yǎng)，所述預(yù)培養(yǎng)至少三次；加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第一次預(yù)培養(yǎng)至少12h，去掉上清；再加入至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第二次預(yù)培養(yǎng)至少12h，去掉上清，再加入含5 20%胎牛血清的至少8000ml DMEM培養(yǎng)基進行第三次預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)至少6h后打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中。
4.如權(quán)利要求3所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述第一次預(yù)培養(yǎng)加入8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)13h ;所述第二次預(yù)培養(yǎng)加入8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)13h ；所述第三次預(yù)培養(yǎng)加入含10%胎牛血清的8500ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7h。
5.如權(quán)利要求1所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述目標細胞系的培養(yǎng)過程包括: 1)將預(yù)培養(yǎng)后的微 載體和所述體積為100 200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中進行懸浮培養(yǎng)，加入含5 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，攪拌速度為35 55 轉(zhuǎn) /min ； 2)懸浮培養(yǎng)的前5 IOh中，每隔半小時停止攪拌10分鐘； 3)培養(yǎng)20 30h后，去掉100 200L上清，加入200 300L含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)； 4)培養(yǎng)至40 50h時，加入含5 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基至500 600L，繼續(xù)培養(yǎng)至70 80h。
6.如權(quán)利要求5所述的規(guī)模化培養(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述步驟I)中，細胞培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)的初始培養(yǎng)體積為150 250L。
7.如權(quán)利要求6所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于: 所述步驟I)中，所述DMEM培養(yǎng)基中胎牛血清的含量為10%，所述初始培養(yǎng)體積為200L，所述攪拌速度為40轉(zhuǎn)/min ； 所述步驟2)中，懸浮培養(yǎng)的前6h，每隔半小時停止攪拌10分鐘； 所述步驟3)中，24h后去掉150L上清，所述DMEM培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，加入量為250L ； 所述步驟4)中，培養(yǎng)至48h時，所述DMEM培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，加入所述DMEM培養(yǎng)基至反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)體積為550L，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。
8.如權(quán)利要求1 7任一項權(quán)利要求所述的規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，其特征在于:所述細胞為犬腎細胞MDCK細胞。
9.一種以如權(quán)利要求1所述的規(guī)模化培養(yǎng)細胞增殖的方法培養(yǎng)的細胞系為基質(zhì)生產(chǎn)病毒的方法，其特征在于:根據(jù)MOI值，在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入濃度為10 μ g/mL的TPCK-胰酶，培養(yǎng)溫度為32 38°C、PH值7.2 7.8、DO值為30%-50%，增殖48-72h后，取其上清液，收獲病毒液。
10.如權(quán)利要求9所 述的方法，其特征在于:所述病毒為H5N1亞型禽流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法及其將增殖細胞用于生產(chǎn)病毒的方法，規(guī)?；囵B(yǎng)細胞增殖的方法，包括將細胞經(jīng)過逐級放大懸浮培養(yǎng)，得到體積為100～200L的細胞系；在微載體中加入DMEM培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)；將預(yù)培養(yǎng)后的微載體和所述體積為100～200L的細胞系打入體積為650L以上的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，懸浮培養(yǎng)后，得到目標細胞系。在所述目標細胞系中接種病毒增殖培養(yǎng)，得到病毒液。本發(fā)明培養(yǎng)的細胞系細胞密度≥4×106cells/ml，培養(yǎng)體積為650L以上，且細胞系的形態(tài)好，質(zhì)量高。
文檔編號C12N7/00GK103160457SQ201310127308
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者李朝陽, 劉延麟, 李明義, 喬彥良 申請人:山東信得動物疫苗有限公司