專利名稱：轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米是我國重要的飼料加工原料，其所含總磷的50%以上是以植酸形式存在，動物幾乎不能消化利用，同時，植酸是抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響動物對鈣、鎂、鐵、鋅等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，能水解植酸最終釋放出無機(jī)磷。在動物飼料中添加外源植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用度，消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，不僅能減少磷在環(huán)境中的排泄，降低農(nóng)業(yè)生態(tài)的負(fù)擔(dān)，同時也能減少動物飼料中無機(jī)磷的添加，緩解我國磷資源匱乏的局面。利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)植酸酶的研究由來已久，比如來源于WT煙曲霉的植酸酶和經(jīng)過改造的熱穩(wěn)定植酸酶已經(jīng)在小麥和大麥中成功表達(dá)；來源于無花果曲霉的植酸酶也已在煙草，苜蓿和馬鈴薯葉片中成功表達(dá)。我國科學(xué)家通過分離來自黑曲霉的植酸酶基因phyA2并構(gòu)建到玉米特異表達(dá)載體上，得到了 27個表達(dá)植酸酶并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因玉米純合系。其種子中植酸酶活性均在1000U / kg以上，最高達(dá)到120000U / kg，完全達(dá)到中國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Ikg玉米添加IOOOu植酸酶)的要求，可以替代傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)的植酸酶添加劑。以玉米為載體生產(chǎn)的植酸酶直接用于飼料加工，實(shí)現(xiàn)了以環(huán)保、節(jié)能的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式生產(chǎn)“綠色磷”的夢想，具有巨大的產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢和應(yīng)用前景。我國將轉(zhuǎn)基因植物的研究分為五個階段:實(shí)驗(yàn)研究階段、中間試驗(yàn)階段、環(huán)境釋放階段、生產(chǎn)性試驗(yàn)階段、申請安全證書與商業(yè)化生產(chǎn)階段。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米是我國自主研發(fā)，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的玉米品系，目前，該轉(zhuǎn)基因玉米于2009年11月獲得農(nóng)業(yè)部正式頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，成為我國首例獲得安全證書的糧食作物，也是國際上首例研制成功的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米，標(biāo)志著轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米在我國即將進(jìn)入大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)階段。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》規(guī)定，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識管理，因而需要加強(qiáng)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米相關(guān)的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:—種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物，正向、反向引物序列分別為:phyA2-lF:5’ -CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示，phyA2-2R: 5’ -GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’，如 SEQ ID N0.2 所示。一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉 米phyA2基因特異性探針，序列為:
phyA2-P:FAM-5’ -CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3' -Eclipse,如 SEQ ID N0.3所示。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物在定性檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用，方法如下:(I)提取待檢測樣品基因組DNA，并以此為模板，利用phyA2_lF和phyA2_2R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品為含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或其相關(guān)產(chǎn)品；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分。步驟(I)所述的PCR 擴(kuò)增為:95°C 5min 預(yù)變性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35個循環(huán)；72°C延伸7min。所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物在SYBR Green I實(shí)時熒光定量檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用，方法如下:(I)建立植酸酶玉米phyA2基因和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線:①提取轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)提取待檢測樣品 基因組DNA,得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之t匕，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。步驟(I)和(2)中，zSSIIb引物序列(國家標(biāo)準(zhǔn))如下:zSSIIb-lF:5’ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’，SEQ ID N0.4 所示，zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ；SEQ ID N0.5 所示，植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物序列如下:phyA2-lF:5，-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3，，SEQ ID N0.1 所示，phyA2-2R:5，-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3，，SEQ ID N0.2 所示，植酸酶玉米phyA2基因特異性引物擴(kuò)增序列如下:CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACC,如 SEQ ID N0.6所示。所述步驟(I)和(2)中，擴(kuò)增的參數(shù)均如下:擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL，2XPremixEx Taq(Rox)IOuL,濃度為 10umol/L 的 Forward primer0.4uL,濃度為 10umol/L 的Reverse primer0.4uL, ddH208.2uL, DNA 模板 IuL.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 °C IOmin 預(yù)變性；95°C 15s, 60°C 30s,在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。
所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物和探針在TaqMan探針實(shí)時熒光定量檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用，方法如下: (I)建立轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線:①提取轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。所述步驟(I)①和(2)中，zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針如下:zSSIIb-lF: 5，-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3，，如 SEQ ID N0.4 所示，zSSIIb-2R: 5，-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3，，如 SEQ ID N0.5 所示，zSSIIb-P:FAM-5，-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3，-TAMRA，如 SEQ ID N0.7 所示；植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針序列如下:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’phyA2-P:FAM-5，-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3，-Eclipse，如 SEQ ID N0.1, SEQID N0.2，SEQ ID N0.3 所示。植酸酶玉米phyA2基因特異性引物和探針擴(kuò)增序列如下:CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACC，如 SEQ ID N0.6。所述步驟(I)①和(2)中，擴(kuò)增的參數(shù)均如下:擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L，2 X PremixEx Taq(Rox) 12.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primerl μ L,濃度為 10ymol/L 的Reverse primerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqMan probe0.5 μ L, ddH204 μ L, DNA 模板I μ L.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s, 60°C 30s,在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:利用本發(fā)明設(shè)計的引物與探針序列，建立了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性定性PCR檢測方法、SYBR Gree n I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法和TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，這三種檢測方法靈敏，準(zhǔn)確，簡單，可靠，具有廣闊的應(yīng)用價值與市場前景。


圖1為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性定性PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳示意圖。圖2為實(shí)施例2中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為實(shí)施例2中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為實(shí)施例3中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為實(shí)施例3中轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性定性PCR檢測方法:引物由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的引物序列如下:phyA2-lF:5’ -CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示，phyA2-2R: 5’ -GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’，如 SEQ ID N0.2 所示，

分別提取轉(zhuǎn)植酸酶玉米、轉(zhuǎn)基因玉米Btll、Btl76、GA21、M0N810,轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788、A2704-12，轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1，轉(zhuǎn)基因油菜MS1、MS8和非轉(zhuǎn)基因玉米，分別用phyA2-lF和phyA2-2R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?95 °C 5min預(yù)變性；940C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35個循環(huán)；72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果:利用所設(shè)計的引物以提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，由圖可見，只有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因組成功擴(kuò)增出131bp特異性產(chǎn)物，而其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品模板都沒有可觀察到的擴(kuò)增產(chǎn)物。由此證明，該引物具有良好的特異性，適合于轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性的定性檢測。實(shí)施例2轉(zhuǎn)植酸酶玉米基因特異性SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法提取轉(zhuǎn)植酸酶玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至62500、12500、2500、500和IOOcopies/μ L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，檢測擴(kuò)增的重復(fù)性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的轉(zhuǎn)植酸酶玉米基因特異性引物序列如下:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'玉米內(nèi)標(biāo)引物(zSSIIb)采用國家標(biāo)準(zhǔn)引物，其序列如下:zSSIIb-F: 5’ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’，如 SEQ ID N0.4 所示，zSSIIb-R: 5，-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3，，如 SEQ ID N0.5 所示，擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL, 2 X Premix Ex Taq(Rox)IOuL,濃度為 10umol/L 的 Forwardprimer0.4uL,濃度為 10umol/L 的 Reverse primer0.4uL, ddH208.2uL, DNA 模板 IuL.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s, 60°C 30s,在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。結(jié)果:通過對不同植酸酶玉米標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為62500、12500、2500、500、100的DNA進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，計算機(jī)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為Ct，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的植酸酶玉米標(biāo)準(zhǔn)品(3%，1%, 0.5%, 0.1%)、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)植酸酶玉米的基因特異性引物對同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，分別得至IJ PCR擴(kuò)增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2示，該曲線的斜率為-3.351，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3示，該曲線的斜率為-3.447，相關(guān)系數(shù)R2為0.998.因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米含量=(phyA2基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb拷貝數(shù))X100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。實(shí)施例3轉(zhuǎn)植酸酶玉米基因特異性TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測方法提取轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA，按5倍倍比分別稀釋至62500、12500、2500,500和IOOcopies/μ L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，檢測擴(kuò)增的重復(fù)性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的轉(zhuǎn)植酸酶玉米基因特異性引物與探針序列如下:phyA2-lF:5，-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’

phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'phyA2-P:FAM-5，-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3，-Eclipse ;如 SEQ ID N0.1，SEQID N0.2，SEQ ID N0.3 所示；玉米內(nèi)標(biāo)引物與探針(zSSIIb)采用國家標(biāo)準(zhǔn)引物與探針，其序列如下:zSSIIb-F:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’zSSIIb-R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’zSSIIb-P:FAM-5，-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA ;如 SEQ ID N0.4，SEQID N0.5，SEQ ID N0.7 所示。擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L，擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L, 2 X Premix Ex Taq (Rox) 12.5μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverse primerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqMan probe0.5 μ L, ddH204 μ L, DNA 模板 I μ L.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s, 60°C 30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán).每個試樣重復(fù)3次，同時設(shè)立無菌雙蒸水(ddH20，空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品對照。結(jié)果:通過對不同植酸酶玉米標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為62500、12500、2500、500、100的DNA進(jìn)行TaqMan實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，計算機(jī)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為Ct，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計算公式，通過對不同轉(zhuǎn)基因含量的植酸酶玉米標(biāo)準(zhǔn)品(3%，1%, 0.5%, 0.1%)、陽性樣品、陰性樣品及空白對照的測定，將樣品的Ct值代入公式，即可得到待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)植酸酶玉米的基因特異性引物對同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行TaqMan實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，分別得到PCR擴(kuò)增曲線，并由系統(tǒng)軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2示，該曲線的斜率為-3.415，相關(guān)系數(shù)R2為0.998。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米基因特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3示，該曲線的斜率為-3.396，相關(guān)系數(shù)R2為0.999.因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米含量=(phyA2基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb拷貝數(shù))X100%可以計算出待測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。以上結(jié)果可以證明，本發(fā)明為轉(zhuǎn)植酸酶玉米的定性PCR、SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR和TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測提供了簡單、可靠的測定方法，為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識提供了一種強(qiáng)有力的技術(shù)支撐 ，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的手段。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物，其特征是，正向、反向引物序列分別為:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ 。
2.一種轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性探針，其特征是，序列為: phyA2-P:FAM-5’-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3’-Eclipse。
3.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物在定性檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征，步驟為: (1)提取待檢測樣品基因組DNA，并以此為模板，利用phyA2-lF和phyA2_2R引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物；若存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品為含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米或其相關(guān)產(chǎn)品；若不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，則待檢測樣品中不含轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分。
5.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物在SYBRGreen I實(shí)時熒光定量檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征，步驟為: (1)建立植酸酶玉米phyA2基因的SYBRGreen I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的SYBR Green I 探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線: ①提取轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增； ②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物序列如下: zSSIIb-lF:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ； 植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物序列如下: phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ ； 植酸酶玉米phyA2基因特異性引物擴(kuò)增序列如下:CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACC ； (2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征，步驟(I)和(2)中所述的擴(kuò)增的參數(shù)均如下:擴(kuò)增反應(yīng)體積為20uL, 2XPremix Ex TaqlOuL,濃度為10umol/L的正向引物0.4uL,濃度為10umol/L的反向引物0.4uL，ddH208.2uL，DNA模板luL，擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性；95°C 15s,60°C 30s，在60°C收集熒光信號，共計40個循環(huán)。
8.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物與權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性探針在TaqMan探針實(shí)時熒光定量檢測玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米成分中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用方法，其特征是，步驟為: (1)建立轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線: ①提取轉(zhuǎn)植酸酶基因 玉米標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)弓I物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增； ②擴(kuò)增后，測定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，該Ct值與拷貝數(shù)的自然對數(shù)呈線性關(guān)系，據(jù)此繪制植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針，以及zSSIIb基因的國家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后，測定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值，然后根據(jù)上述繪制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的拷貝數(shù)，則轉(zhuǎn)植酸酶玉米phyA2基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比，即為待檢測樣品中轉(zhuǎn)植酸酶玉米的百分含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性引物、探針及其在PCR檢測中的應(yīng)用，正向、反向引物序列分別為phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'，phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'。探針序列為phyA2-P:FAM-5'-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3'-Eclipse。利用本發(fā)明設(shè)計的引物與探針序列，建立了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米phyA2基因特異性定性PCR檢測方法、SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法和TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，這三種檢測方法靈敏，準(zhǔn)確，簡單，可靠，具有廣闊的應(yīng)用價值與市場前景。
文檔編號C12N15/11GK103215261SQ20131012200
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者孫紅煒, 張廣遠(yuǎn), 楊淑珂, 李凡, 徐曉輝, 高瑞, 路興波 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所