專利名稱：一種從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的提取方法，具體涉及一種從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的提取石蠟組織切片核酸的方法，先采用石蠟切片機(jī)對(duì)石蠟組織塊切片(又稱切白片或切卷片)中包含的菲薄組織細(xì)胞脫蠟，酒精溶解至水，然后進(jìn)行蛋白酶消化，冷凍離心純化后用酚氯法或試劑盒提取核酸。由于切片組織中共同生長(zhǎng)不同良惡性質(zhì)的組織細(xì)胞以不同成份比例存在并各有差異，導(dǎo)致所提取的細(xì)胞總核酸成份是上述不同性質(zhì)組織細(xì)胞的混合體，影響實(shí)現(xiàn)目標(biāo)數(shù)據(jù)的真實(shí)性。為達(dá)到實(shí)驗(yàn)觀察準(zhǔn)確反應(yīng)目標(biāo)組織細(xì)胞核酸的目的，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)反應(yīng)目標(biāo)核酸數(shù)據(jù)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性、重復(fù)性，對(duì)目標(biāo)核酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用到醫(yī)學(xué)基因檢測(cè)應(yīng)用，在提取核酸前分離富集目標(biāo)核酸，然后提取，可以真實(shí)反應(yīng)白片中全部細(xì)胞中的靶細(xì)胞核酸質(zhì)量，具有重要的臨床評(píng)估意義，產(chǎn)生關(guān)鍵臨床診療應(yīng)用價(jià)值。如，肺癌白片中由不同比例的肺組織和癌組織共同存在，肺組織細(xì)胞核中只具有沒(méi)有EGFR基因突變的野生型細(xì)胞，亞洲人癌組織中約60%以上是同樣EGFE野生型細(xì)胞。如果不在提取總核酸前去除肺組織野生型細(xì)胞，他們與癌組織中60%以上的野生型細(xì)胞混在一起提取核酸，將大大增加EGFR野生型核酸數(shù)量和比例，導(dǎo)致突變型肺癌細(xì)胞含量可能下降到25%比例以下，這時(shí)有些基因檢測(cè)方法和技術(shù)很難檢測(cè)出該白片組織中有EGFR突變的肺癌細(xì)胞，導(dǎo)致臨床醫(yī)師依據(jù)EGFR基因突變假陰性結(jié)果制定不采用靶向治療方案，患者失去對(duì)存在少量突變型肺癌細(xì)胞治療而獲益的機(jī)會(huì)。反之，如果先將正常肺組織EGFR野生型細(xì)胞剔除只剩下肺癌組織，其中EGFR突變型癌細(xì)胞所含核酸濃度比例上升易于檢出。目前國(guó)內(nèi)少數(shù)提取石蠟組織核酸的技術(shù)，基本沒(méi)有應(yīng)用切白片并經(jīng)HE染色對(duì)照富集并保護(hù)脫蠟切片后核酸再提取，而是未經(jīng)HE染色病理觀察標(biāo)本靶細(xì)胞區(qū)域，用囫圇機(jī)械破碎或沸水煮化石蠟組織或卷片后，在離心管內(nèi)直接脫蠟的方法。例如常明等，腎穿刺活檢石蠟組織切片DNA的提取和PCR擴(kuò)增[J]，中華腎臟病雜志，2007，23 (11) =740-743 ；王麗江等，石蠟組織提取DNA4種方法的比較[J]，診斷病理學(xué)雜志，2004，11 (I) :57_58。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，該方法以HE染色片為模板，將白片上的靶細(xì)胞經(jīng)光鏡下富集并提取靶細(xì)胞核酸。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種從 標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，將手術(shù)或活檢標(biāo)本用中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切5-15張白片，選擇其中一張白片行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色片的腫瘤組織細(xì)胞分布，并標(biāo)記出靶細(xì)胞的分布區(qū)域。白片烤片后二甲苯脫蠟，然后對(duì)照標(biāo)記好的HE染色片將白片上富含靶細(xì)胞的組織刮下以富集靶細(xì)胞，最后對(duì)富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取即可。上述從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，具體步驟包括(I)將手術(shù)或活檢標(biāo)本用中性福爾馬林固定。巨大器官組織要切開固定8 24h，小塊組織的固定時(shí)間約4h左右。(2)組織脫水。由低濃度逐級(jí)上行至高濃度乙醇脫水(一般70 100%的濃度)，逐步置換組織內(nèi)的水份。(3)浸蠟。用于浸蠟的石蠟最好是熔點(diǎn)稍低(56 58°C)。根據(jù)脫水機(jī)配有的蠟缸數(shù)量，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)浸蠟程序，浸蠟采用二級(jí)至四級(jí)。不同大小和厚薄的組織浸蠟時(shí)間有所不同，一般為I 3h。(4)石蠟包埋。組織經(jīng)浸蠟后即進(jìn)行包埋。包埋時(shí)把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對(duì)皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。(5)切片。切片的厚度應(yīng)為4-10 μ m。(6)烤片。切出的蠟片標(biāo)號(hào)后放入約60 95°C的烤箱內(nèi)或65°C以上恒溫?zé)岚迳峡竞?5 60分鐘，使蠟片牢固地粘附在玻片上?？竞媲衅臏囟纫话惚劝袷灥娜埸c(diǎn)聞5 C左右ο(7)切片脫蠟脫蠟一般用分析純或三級(jí)脫蠟劑如二甲苯，時(shí)間為O. 5_12h。如果脫蠟劑使用多次或室溫較低，或組織致密均需延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間。(8)選擇一張切片行病理標(biāo)準(zhǔn)程序上的HE染色。并在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下觀察，用標(biāo)記筆畫出靶細(xì)胞分布范圍,耗時(shí)在2min之內(nèi)。(9)其他白片用乙醇由高濃度逐級(jí)下行至低濃度乙醇清洗二甲苯(一般70% 100%的濃度)。接著將片子置于清水中清洗掉乙醇。(10)對(duì)照標(biāo)記好的HE染色片，將剩余白片上富含靶細(xì)胞的組織用干凈的刀片刮下以富集靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞成份比例達(dá)到白片總組織細(xì)胞成份40 60%以上，并立即轉(zhuǎn)到
離心管內(nèi)。(11)按說(shuō)明書提取靶細(xì)胞核酸即可。操作全過(guò)程中，禁止細(xì)胞片裸露在空氣中。所述的HE染色片為從手術(shù)病理石蠟包埋組織、穿刺組織、胃腸鏡活檢以及細(xì)胞涂片中通過(guò)正常病理步驟切片、染色得到的HE染色片。所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。步驟(11)中，采用常規(guī)方法或采用常規(guī)試劑盒進(jìn)行核酸提取。近年來(lái)，隨著核酸提取技術(shù)方法及試劑盒質(zhì)量的進(jìn)步，對(duì)石蠟殘微核酸的提取純化有了極大地進(jìn)步，但還不能滿足靶細(xì)胞石蠟白片提取靶細(xì)胞目標(biāo)核酸的需求。本發(fā)明通過(guò)創(chuàng)造，根據(jù)HE染色片的組織分布情況富集石蠟白片的靶細(xì)胞，然后再?gòu)母患陌屑?xì)胞中提取高濃度腫瘤細(xì)胞成份核酸，能夠獲得臨床真正需要的，有針對(duì)性突變的核酸等，可以極大地減少或消除基因檢測(cè)假陰性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床應(yīng)用提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。有益效果 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，先對(duì)手術(shù)標(biāo)本的常規(guī)HE染色片進(jìn)行靶細(xì)胞范圍標(biāo)記，然后再根據(jù)標(biāo)記范圍刮取石蠟白片上的靶細(xì)胞，對(duì)富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸的提取，能夠提高靶細(xì)胞的核酸濃度，達(dá)到40%至60%以上，從而提高分子病理檢測(cè)陽(yáng)性率，減少假陰性率，不需要昂貴的儀器設(shè)備和專門復(fù)雜的技術(shù)，幾乎無(wú)明顯的時(shí)間消耗，適宜在所有檢驗(yàn)病理科和生物實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，對(duì)臨床診斷治療提供更為準(zhǔn)確的分子診斷，能夠產(chǎn)生很好的社會(huì)效應(yīng)。


圖I是未作鏡檢富集選擇靶區(qū)大腸癌組織細(xì)胞提取核酸進(jìn)行敏感度參比測(cè)序圖；圖2是作鏡檢富集選擇靶區(qū)大腸癌組織細(xì)胞提取核酸進(jìn)行敏感度參比測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例所使用的材料為從各種手術(shù)獲取的細(xì)胞學(xué)和病理石蠟包埋組織(FFPE)、穿刺組織、胃腸鏡活檢標(biāo)本，通過(guò)正常病理步驟切片、染色得到的HE染色片。各材料的正常病理步驟切片、染色可以為(I)手術(shù)石蠟組織切片染色各種組織標(biāo)本經(jīng)大體觀察，取材，記錄登記后，針對(duì)病理部位切取的小于2cm邊長(zhǎng)及2mm厚組織塊，進(jìn)入甲醛類固定，順序酒精脫水和二甲苯一石蠟浸蠟流程，按包埋成石蠟組織塊，用切片機(jī)切成4-10um厚白片，烤化lh，脫蠟至水后進(jìn)入HE染色流程(蘇木素染色 ，水洗后鹽酸分化，熱水和自來(lái)水流水漂洗，酒精二甲苯順序脫水)，中性樹膠封片，鏡檢病理診斷后，HE切片歸檔保存及二次會(huì)診分子病理檢測(cè)應(yīng)用。(2)穿刺或內(nèi)鏡活檢染色各種組織標(biāo)本經(jīng)大體觀察，取材，記錄登記后，進(jìn)入甲醛類固定，順序脫水和二甲苯一石蠟浸蠟流程，按記錄單包埋成石蠟組織塊，用切片機(jī)切成
4-10um厚白片，烤化lh，脫蠟至水后進(jìn)入HE染色流程(蘇木素染色，水洗后鹽酸分化，熱水和自來(lái)水流水漂洗，酒精二甲苯順序脫水)，中性樹膠封片，鏡檢病理診斷，HE切片歸檔保存或二次會(huì)診分子病理檢測(cè)應(yīng)用。實(shí)施例I白片的脫蠟將白片視標(biāo)本大小選擇數(shù)張(2-15張)浸入二甲苯浸泡8 12h，充分溶解石蠟；更換新的二甲苯溶解石臘，浸泡15 20min ;再次更換二甲苯,浸泡15min ;取出白片立即用無(wú)水乙醇浸泡IOmin以上,充分溶解二甲苯；更換入新的無(wú)水乙醇，浸泡IOmin,然后依次進(jìn)行95%乙醇浸泡5min ；80%乙醇浸泡5min ；70%乙醇浸泡2min ；自來(lái)水稍洗2min,蒸懼水洗2min，吸干，然后滴加核酸保護(hù)液50uL。顯微鏡下將HE染色片上靶細(xì)胞用記號(hào)筆圈選出來(lái)，并在HE片的指導(dǎo)下在白片的相同位置也將靶細(xì)胞用記號(hào)筆圈選出來(lái)，將靶細(xì)胞刮下富集并立即轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)。細(xì)胞刮片的全過(guò)程中，禁止細(xì)胞刮片裸露在空氣中。脫蠟前白片要經(jīng)60°C以上烘烤，這樣使組織與玻璃片粘貼牢固。組織切片脫蠟應(yīng)徹底，脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時(shí)間，所有的時(shí)間都是指新的二甲苯在室溫25°C以下時(shí)，如果二甲苯是用過(guò)一段時(shí)間，切片又比較厚，室溫低應(yīng)增加脫蠟時(shí)間。實(shí)施例2大腸癌(病理號(hào)082379) HE染色片指導(dǎo)下的靶細(xì)胞的挑選HE染色切片在提取核酸前必須經(jīng)過(guò)病理或細(xì)胞學(xué)醫(yī)師復(fù)檢診斷，明確含有靶細(xì)胞成分，在玻片上標(biāo)示出靶細(xì)胞位置。用實(shí)施例I的方法，提取DNA模板，用K-ras-2基因的弓丨物(K-ras-2-U :-aggcctgctgaatttgactg_,K-ras_2_L :_catgattttggtcagagaaacc_ ；)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(QIAGEN HotStar Taq DNA polymerase KitlOX 擴(kuò)增緩沖液 2uL，dNTP2U，上下游引物各IOpmol,模板DNAO. I 2ug Taq DNA聚合酶2. 5u, Mg2+L 5mmol/L加雙蒸水至20ul。PCR 熱循環(huán)條件95V 10min,95°C 40s, 60°C lmin,72°C 45s，30 個(gè)循環(huán)，72°C 45min,4°C保溫)后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化并測(cè)序(常規(guī)方法)，結(jié)果如圖I和圖2所示，發(fā)現(xiàn)通過(guò)鏡檢選擇靶區(qū)大腸癌組織細(xì)胞提取核酸，可以明顯提高k-ras基因突變率和基因檢測(cè)準(zhǔn)確性。圖I為正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混合的DNA測(cè)序結(jié)果，其中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)k-ras基因的突變，圖2為在鏡下選取腫瘤細(xì)胞后提取的DNA測(cè)序結(jié)果，其中檢測(cè)出30%比例的k-ras基因突變，說(shuō)明通過(guò)鏡檢選擇靶區(qū)大腸癌組織細(xì)胞提取核酸，可以明顯提高k-ras基因突變率和基因檢測(cè)準(zhǔn)確性。實(shí)施例2(I)目標(biāo)核酸稀釋比例變異與測(cè)序檢測(cè)敏感度關(guān)系。以人類大腸癌SW480K_ras G12V突變系與人大腸癌SW116K_ras G12T野生細(xì)胞系為目標(biāo)核酸以梯度稀釋比例變異作為敏感度觀察對(duì)象，二種細(xì)胞系混合成25uL DNA模板體系，其中SW480K-ras G12V突變株細(xì)胞系分別以20%、15%、10%,5%和0%梯度比例遞減與SWllO株混合，每梯度設(shè)5個(gè)復(fù)孔混合，按相同常規(guī)方法進(jìn)行PCR和正反向基因測(cè)序，以AB3100-avant測(cè)序儀記錄突變狀況(GGT>GTT)和突變峰高值，見(jiàn)下表I?？梢?jiàn)，目標(biāo)核酸需要達(dá)到一定量比濃度才能在腫瘤和正常組織突變與野生環(huán)境下的共生狀態(tài)下被檢測(cè)出來(lái)。表ΙΚ-ras G12V與K_ras G12T梯度稀釋測(cè)序敏感度峰高比
權(quán)利要求
1.一種從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于將手術(shù)或活檢標(biāo)本用中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切多張白片，選擇其中一張白片行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色片的腫瘤組織細(xì)胞分布，并標(biāo)記出靶細(xì)胞的分布區(qū)域；剩余白片經(jīng)烤片后再進(jìn)行二甲苯脫蠟，然后對(duì)照標(biāo)記好的HE染色片將白片上富含靶細(xì)胞的組織刮下富集靶細(xì)胞，最后對(duì)富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將手術(shù)或活檢標(biāo)本先用中性福爾馬林固定，然后進(jìn)行組織脫水、浸蠟、石蠟包埋和切片； (2)控溫60 95°C，考片15飛Omin，使蠟片牢固地粘附在玻片上； (3)用二甲苯對(duì)切片脫蠟； (4)選擇其中一張切片行病理標(biāo)準(zhǔn)程序上的HE染色，并在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下觀察，標(biāo)記出靶細(xì)胞分布范圍； (5)剩余白片用乙醇水溶液由高濃度逐級(jí)下行至低濃度乙醇水溶液清洗二甲苯，接著將白片置于清水中清洗掉乙醇； (6)對(duì)照標(biāo)記好的HE染色片，將清洗掉乙醇的剩余白片上富含靶細(xì)胞的組織用刀片刮下，富集靶細(xì)胞，并立即轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)； (7)按常規(guī)方法提取靶細(xì)胞核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，巨大器官組織要切開固定8 24h，小塊組織的固定時(shí)間3. 5^4. 5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，由低濃度逐級(jí)上行至高濃度乙醇水溶液脫水，乙醇水溶液的濃度為70 100%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為56 58°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，石蠟包埋時(shí)，把組織最大最平切面或所需的病灶切面向下，對(duì)皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，步驟(I)中，切片的厚度為4-10 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，所有操作步驟，禁止細(xì)胞片裸露在空氣中。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，所述的HE染色片為從手術(shù)病理石蠟包埋組織、穿刺組織、胃腸鏡活檢以及細(xì)胞涂片中通過(guò)正常病理步驟切片、染色得到的HE染色片。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，其特征在于，所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從標(biāo)本中快速富集并提取靶細(xì)胞核酸的方法，將手術(shù)或活檢標(biāo)本用中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切多張白片，選擇其中一張白片行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色片的腫瘤組織細(xì)胞分布，并標(biāo)記出靶細(xì)胞的分布區(qū)域；剩余白片經(jīng)烤片后再進(jìn)行二甲苯脫蠟，然后對(duì)照標(biāo)記好的HE染色片將白片上富含靶細(xì)胞的組織刮下富集靶細(xì)胞，最后對(duì)富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取。該方法能夠提高靶細(xì)胞的核酸濃度，達(dá)到40%至60%以上，從而提高分子病理檢測(cè)陽(yáng)性率，減少假陰性率，不需要昂貴的儀器設(shè)備和專門復(fù)雜的技術(shù)，幾乎無(wú)明顯的時(shí)間消耗，適宜在所有檢驗(yàn)病理科和生物實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，對(duì)臨床診斷治療提供更為準(zhǔn)確的分子診斷。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103224929SQ201310121200
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者賴仁勝, 吳曉斌, 謝玲, 陳劼, 余波, 趙明, 孫軍華, 張樹鵬 申請(qǐng)人:南京紫霄科技有限公司, 賴仁勝, 吳曉斌