專利名稱：成纖維細胞生長因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及成纖維細胞生長因子-21成熟肽的一種新用途，即成纖維細胞生長因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應用。
背景技術：
近年來，隨著我國經濟的飛速發(fā)展，人們生活水平的快速提高和生活方式的改變，高血壓的發(fā)病率逐年提升的。高血壓是一種以動脈壓升高為特征，并伴有心臟、血管、腦和腎等器官功能或器質性改變的全身性疾病。高血壓是最常見的心血管疾病，是全球范圍內的重大公共衛(wèi)生問題。目前我國18歲及以上居民高血壓患病率約19%。目前治療高血壓的藥物多為化學制劑，包括利尿劑、中樞神經和交感神經抑制劑、腎上腺素受體阻滯劑等。這些藥物雖然起效較快，但持續(xù)時間不長，需要長期多次服用，容易使人形成藥物依賴性，并且長期服用會造成嚴重的副作用。2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分離出FGF家族中的一個新成員并將其命名為成纖維細胞生長因子-21 (FGF-21)。FGF-21是成纖維細胞生長因子家族的一名新成員，主要在肝臟中表達，蛋白N端前28個氨基酸為信號肽(去除信號肽后的多肽為成熟肽)，因此FGF21可以分泌到細胞外。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供成纖維細胞生長因子-21成熟肽的一種新用途，即成纖維細胞生長因子-21在制備治療高血壓的藥物中的應用。本發(fā)明還保護一種治療高血壓的藥物`，其活性成分為成纖維細胞生長因子-21成熟肽。所述藥物還包括其它藥學上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了所述活性成分夕卜，可以添加藥學上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態(tài)可為針劑(如粉劑、水劑、油劑)。所述制劑都可采用本領域技術人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。以上任一所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療高血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質。以上任一所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽具體可采用包括如下步驟的方法制備:(I)表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽。
所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。所述“表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實現方法如下:將所述成纖維細胞生長因子-21的編碼基因插入原核表達載體pSUMO，得到重組質粒；將所述重組質粒導入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進行誘導，得到所述融合蛋白。所述“切除所述分子伴侶”的實現方式如下:所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶KSUMO蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比具體可為1:50)和DTT (所述DTT的初始濃度可為2mmol/L)切割(切割條件具體可為4°C切割過夜)。所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明還保護一種制備所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽的方法，包括如下步驟:(I)表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白；(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽。所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。所述“表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實現方法如下:將所述成纖維細胞生長因子-21的編碼基因插入原核表達載體pSUMO，得到重組質粒；將所述重組質粒導入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進行誘導，得到所述融合蛋白。所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；
3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明發(fā)現成纖維細胞生長因子-21成熟肽能夠有效調控動物體內的血壓水平，具有藥效持續(xù)時間長的優(yōu)點，可作為藥物治療高血壓及心血管病變等疾病。


圖1為實施例1中FGF-21成熟肽溶液的電泳圖。圖2為實驗4周過程中，各組小鼠每周的血壓對比。圖3為停藥后，各組小鼠24小時監(jiān)測血壓的結果對比。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。FGF-21蛋白的成熟肽，簡稱FGF-21成熟肽，如序列表的序列I所示。FGF-21成熟肽的編碼基因如序列表的序列2所示。原核表達載體pSUMO (在文獻中被稱為“pHisSUMO”):參考文獻:姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達可溶性重組蛋白的研究.東北農業(yè)大學學報，2008, 39(10):57-62 ;李璐，尹成凱，李德山.高效表達可溶性重組蛋白表達載體——pHisSUM0.生物技術，2009, 19(3):11-14.。大腸桿菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技術有限公司，目錄號:0)801。SUMO蛋白酶I (具有His標簽):制備方法見文獻:傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文兵，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒定.生物工程學報，2010，26 (6):837-842.。雄性wistar大鼠:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗動物中心。實施例1、FGF-21成熟肽的制備一、重組質粒的構建1、提取離體的人肝臟的總RNA。2、采用M-MLV反轉錄酶將步驟I得到的總RNA反轉錄為cDNA。3、以步驟2得到的cDNA為模板，采用Pl和P2組成的引物對，采用rTaq酶，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。Pl:5/ -GGTCTCTAGGT CACCCCATCCCTGACTCCAGT-3'；P2:5， -CGCGGATCCTTA GGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG-3。PCR 擴增程序:95°C預變性 5min ；95°C 30s、56°C 30s,72°C 45s, 25 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin04、用限制性內切酶BsaI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。5、用限制性內切酶BsaI和BamHI雙酶切原核表達載體pSUMO，回收約5700bp的載體骨架。
6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pSUMO-FGF-21。重組質粒pSUMO-FGF-21中，FGF-21成熟肽的編碼基因和載體骨架上的分子伴侶SUMO的編碼序列、以及載體骨架上的His標簽的編碼序列(位于SUMO的編碼序列的上游，由6個組氨酸殘基組成)融合，形成融合基因，表達融合蛋白(融合蛋白自N端至C端依次為His標簽、分子伴侶SUMO和FGF-21成熟肽)。FGF-21成熟肽的預期分子量為21KD(推算分子量為21KD，SDS-PAGE電泳顯示分子量為25KD左右)，分子伴侶SUMO的預期分子量為12KD (推算分子量為12KD，SDS-PAGE電泳顯不分子量為18KD左右)。二、FGF-21成熟肽的制備和純化1、將重組質粒pSUMO-FGF-21導入大腸桿菌Rossetta(DE3)，得到重組菌。2、將步驟I得到的重組菌的單菌落接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37°C、120rpm振蕩培養(yǎng)10h，然后取菌液，以1:100的體積比接種于500mL含50mg/mL青霉素的LB培養(yǎng)基中，370C、120rpm 振蕩培養(yǎng) 2h，此時 OD6tltlnm 為 0.35 左右。3、向步驟2得到的菌液中加入IPTG并使其濃度為0.25mmol/L以進行誘導(30°C、70rpm振蕩培養(yǎng)4h),然后4°C、4000rpm離心30min,收集菌體。4、取步驟3得到的菌體，進行超聲破碎(AMP35%，8-12min，工作Is停ls)，4°C、12000rpm離心,分別收集上清液和沉淀。分別將上清液和沉淀進行12%SDS_PAGE電泳分析。結果表明，可溶性表達的目的蛋白占菌體總目的蛋白的90 %以上。5、取步驟4得到的上清液,進行HisTrapTM FF crude colum親和層析。柱子型號為:柱長0.7cm,柱高2.5cm。上樣量為10ml。洗脫過程:先用5倍柱體積的雜蛋白洗脫液(溶劑為水，含有如下濃度的各個溶質:40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 50mmol/L Na3PO4 ；pH7.4)洗脫以去除雜蛋白，流速為lml/min ;然后用3倍柱體積的目的蛋白洗脫液(溶劑為水,含有如下濃度的各個溶質:500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7.4)洗脫,流速為 lml/min, 280nm波長監(jiān)測，收集目標峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即為融合蛋白溶液。6、采用HiPr印TM26/10Desalting將步驟5得到的融合蛋白溶液進行脫鹽。7、取步驟6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I (SUM0蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比為1:50)和終濃度為2mmol/L的DTT4°C切割過夜。8、取步驟7得到的溶液,進行HisTrapTM FF crude colum親和層析。柱子型號為:柱長0.7cm,柱高2.5cm。上樣量為15ml，280nm波長監(jiān)測，收集目標峰(即峰值高于30mAU的峰)，即為FGF-21成熟肽溶液。FGF-21成熟肽溶液的聚丙烯凝膠電泳圖見圖1?；厥漳康膸Р⑦M行N端測序，結果表明，N端前15個氨基酸殘基如序列表的序列I自N末端第I至15位氨基酸殘基所示。實施例2、FGF-21成熟肽溶液對高血壓的治療作用實驗動物為六周齡清潔 劑雄性wistar大鼠。實驗動物飲用10g/100mL果糖水溶液，正常飼喂，12h晝夜周期喂養(yǎng)，4周后選取收縮壓大于140mm Hg的大鼠，即為成模大鼠。將成膜大鼠分為兩組，每組5只，分別進行如下平行處理:
FGF21治療組:每天的7 =00-8:00時段內注射一次實施例1制備的FGF-21成熟肽
溶液，連續(xù)注射28天；每天每只大鼠注射Img FGF-21成熟肽(以總蛋白計)，用生理鹽水調
整注射體積為0.5mL。生理鹽水組:每天的7:00-8:00時段內注射一次生理鹽水，連續(xù)注射28天；每天
每只大鼠注射0.5mL。設置正常對照組，即5只正常雄性wistar大鼠，每天的7 =00-8:00時段內注射一
次生理鹽水,連續(xù)注射28天；每天每只大鼠注射0.5mL。每周(第I周即實驗第7天、第2周即實驗第14天、第3周實驗第21天，第4周即
實驗第28天)檢測一次血壓，三次試驗的結果見表I至表3，三次試驗的平均值結果見圖2。
O周即第一次注射前。FGF21治療組的血壓相對于生理鹽水組顯著下降，與正常對照組無差異。
表I第一次試驗中各組小鼠的血壓(mm Hg)
權利要求
1.成纖維細胞生長因子-21成熟肽在制備治療高血壓的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為權利要求7至10中任 一所述方法制備得到的成纖維細胞生長因子-21成熟肽。
4.一種治療高血壓的藥物，其活性成分為成纖維細胞生長因子-21成熟肽。
5.如權利要求4所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質。
6.如權利要求5所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為權利要求7至10中任一所述方法制備得到的成纖維細胞生長因子-21成熟肽。
7.一種制備成纖維細胞生長因子-21成熟肽的方法，包括如下步驟: (1)表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白； (2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽； 所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽為如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療聞血壓的功能的由序列I衍生的蛋白質。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于:所述分子伴侶為分子泛素樣修飾蛋白。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于:所述“表達所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白”的實現方法如下:將所述成纖維細胞生長因子-21的編碼基因插入原核表達載體pSUMO,得到重組質粒；將所述重組質粒導入大腸桿菌Rosetta (DE3),得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進行誘導，得到所述融合蛋白。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于:所述成纖維細胞生長因子-21成熟肽的編碼基因為如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了成纖維細胞生長因子-21在制備治療高血壓的藥物中的應用。本發(fā)明還保護一種治療高血壓的藥物，其活性成分為成纖維細胞生長因子-21成熟肽。本發(fā)明發(fā)現成纖維細胞生長因子-21成熟肽能夠有效調控動物體內的血壓水平，具有藥效持續(xù)時間長的優(yōu)點，可作為藥物治療高血壓及心血管病變等疾病。
文檔編號C12N15/70GK103191415SQ20131011527
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權日2013年4月3日
發(fā)明者李德山, 王文飛, 朱升龍, 張振宇, 任桂萍, 劉銘瑤 申請人:哈爾濱博翱生物醫(yī)藥技術開發(fā)有限公司