專利名稱：布萊凱特黑牛h-fabp基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測，特別涉及一種布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
布萊凱特黑牛是在現(xiàn)代生物技術(shù)和常規(guī)育成雜交方法的基礎(chǔ)上，通過引進日本和牛，對魯西黃牛和渤海黑牛進行遺傳物質(zhì)改良獲得的優(yōu)良肉牛種質(zhì)資源(李興芳，2010)。其以肉質(zhì)細嫩，大理石花紋豐富而著稱。肌內(nèi)脂肪(Intramuscular Fat, IMF)含量是影響牛肉嫩度、風味、多汁性和口感等食用價值的重要指標(孫好學等，2006，朱奇等，2005)。10%左右的MF含量可產(chǎn)生理想的大理石花紋，形成高檔牛肉(ZHU⑶0-li，et al，2005)。豐富的大理石花紋不僅可以減少牛肉在烹調(diào)過程中嫩度的變化，而且也是評價牛肉質(zhì)量和等級的重要參考。脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid-binding proteins,FABPs)在心肌細胞和脂肪細胞中參與脂肪酸運輸 、調(diào)節(jié)脂肪酸濃度，促進甘油三酯的沉積，有增加MF含量的作用(Veerkamp JH,1993 ；Veerkamp JH, et al, 1995 ；Cameron N D, et al,1991)。Gerbens 等(1999)對心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart fatty acid-binding protein, H-FABP)基因研究發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因可作為影響MF含量的候選基因。李興芳等(2010)對布萊凱特黑牛H-FABP基因的序列做了測定。鑒于以上研究結(jié)果，本試驗研究以H-FABP基因intron2的變異位點為研究對象，采用PCR-SSCP法，結(jié)合最小二乘線性模型對不同基因型效應值間肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋等級評分差異顯著性檢驗，為布萊凱特黑牛新品種的培育提供參考。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點，是一種進行分子遺傳育種的優(yōu)良手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，尋找到與布萊凱特黑牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP，為其分子標記育種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列，是在布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子第872位為C或G的堿基多態(tài)性序列。布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法包括以下步驟:以包含H-FABP基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子；對PCR產(chǎn)物進行SSCP檢測并對基因分型；對基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列。所述的引物對P為:上游引物:5’-TTCCTCCAGCAGCACCTTTC-3’ ；
下游引物:5’ -CCTCCTCATTCCCATTCCTC-3 ’。所述PCR 反應體系為:10XBuffer2.0μ L，20ymol/L 上、下游引物各 0.15 μ L,2mmol/LdNTPs2 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 0.2 μ L，50ng/L 的模版 DNAl μ L, 25mmol/L 的 Mg2+2 μ L，超純水12.5 μ L，總計20 μ L0所述PCR擴增程序為:95 V預變性5min，95 V變性30s，62 V退火30s，72 V延伸30s，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，最后降至4°C。所述SSCP檢測應用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括對多態(tài)性位點等位基因的基因頻率和基因型頻率的檢測。所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列及檢測方法還可以包括H-FABP基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析，優(yōu)選SPSS17.0統(tǒng)計軟件。本發(fā)明的有益效果是:首次在布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子第872bp發(fā)現(xiàn)C — G的堿基突變，AA(CC純合子)基因型與AB (CG雜合子)、BB (GG純合子)基因型相比在肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋豐富程度上差異顯著(P〈0.05)，而AB、BB基因型之間差異不顯著(P>0.05)，即AA基因型的肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋豐富程度顯著優(yōu)于AB基因型和BB基因型。由此可知，H-FABP基因第2內(nèi)含子位點的變異影響牛肉嫩度，該變異位點對肉質(zhì)有較顯著的影響，因此在布萊凱特黑牛育種中，可通過選擇AA基因型作為提高肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋風度程度的輔助選擇依據(jù)。針對上述布萊凱特黑牛H-FABP基因SNP多態(tài)性，本發(fā)明提供的檢測方法簡單、快速、成本低廉、精確度高。


圖1是布萊凱特黑牛全基因組DNA瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果(最左邊泳道為DL15000DNA Marker)；圖2是H-FABP基因第2內(nèi)含子部分片段擴增結(jié)果(最左邊泳道為DL100DNAMarker)；圖3是H-FABP基因第2內(nèi)含子PCR-SSCP多態(tài)性檢測結(jié)果；圖4a和圖4b分別是布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子擴增片段AA和BB基因型測序峰圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明。1.基因組DNA提取分別采取35頭成年布萊凱特黑牛耳樣，使用天根生化科技(北京)有限公司的組織基因組DNA提取試劑盒從布萊凱特黑牛耳組織中提取基因組DNA，具體步驟如下:(I)稱取IOmg布萊凱特黑牛耳樣組織放于1.5mL離心管內(nèi)，用消毒后的手術(shù)剪盡量剪碎，取200 μ L緩沖液 GA加入其中，震蕩，使其徹底懸浮。(2)加入20yL的蛋白酶K溶液，混勻。放入水浴鍋內(nèi)56°C水浴1.5h，期間顛倒混勻樣品2-3次，至完全消化，然后簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠。(3)加入200 μ L緩沖液GB，顛倒混勻，70°C水浴鍋內(nèi)放置lOmin，溶液變清亮，簡短
離心除去管蓋內(nèi)水珠。(4)取200 μ L無水乙醇加入上述溶液，振蕩器上振蕩混勻15sec，簡短離心除去管蓋內(nèi)水珠。(5)將上一步所得溶液和絮狀物全部都加入到一個吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，于離心機12000rpm離心30sec，倒掉廢液后將吸附柱再放回收集管中。(6)向吸附柱中加入500 μ L已加了無水乙醇的緩沖液⑶，12000rpm離心30sec，棄廢液后吸附柱放于收集管中。(7)加入700 μ L已加了無水乙醇的漂洗液PW進行漂洗，12000rpm離心30sec，棄廢液后吸附柱再放入收集管中。(8)重復操作步驟7，再漂洗一遍。(9)吸附柱放于收集管中后，12000rpm離心2min，倒掉廢液后，將吸附柱放于室溫10分鐘，徹底晾干材料中殘余的漂洗液，聞一下無乙醇的氣味。(10)將上述吸附柱放入一個干凈的剪去上蓋的離心管中，懸空向吸附柱吸附膜中間部位滴加100 μ L洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min。(11)為增加基因組DNA的得率，將上述得到的溶液再次懸空加入到吸附柱吸附膜上，室溫放置2min, 12000rpm離心2min。(12)將得到的基因 組DNA溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管內(nèi)，取2μ L該溶液以
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及濃度，剩下的放于_20°C冰箱中保存。部分基因組DNA電泳結(jié)果如圖1所示，可知所提取基因組DNA條帶清晰，無嚴重拖尾現(xiàn)象，說明DNA完整性較好，濃度較高，可以作為PCR的模版使用，符合后續(xù)試驗要求。2.引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的普通牛H-FABP基因的序列(Acc.N0.:NW_001494693.2)，使用Primer Premier5.0對H-FABP基因第2內(nèi)含子部分序列進行引物設(shè)計，目的片段總長為333bp，并由上海生工生物工程有限公司進行引物的合成。引物序列為:上游引物(SEQID N0.1):5’ -TTCCTCCAGCAGCACCTTTC-3’下游引物(SEQID N0.2):5，-CCTCCTCATTCCCATTCCTC-3，3.PCR 擴增PCR 反應體系為:10XBuffer2.0yL，20ymol/L 上、下游引物各 0.15μ L,2mmol/L dNTPs2 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 0.2 μ L，50ng/L 的模版 DNAl μ L, 25mmol/L 的 Mg2+2 μ L,超純水12.5 μ L,總計 20 μ L。PCR擴增程序為:95°C預變性5min，95°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，最后降至4°C。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物特異性，部分擴增結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物大小與預計片段大小一致，且無非特異條帶，可以用于后續(xù)試驗。4.PCR-SSCP 分析將上述PCR擴增產(chǎn)物按照體積比1:1比例加入變性上樣緩沖液，變性后產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠中進行單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(SSCP)。并進行條帶統(tǒng)計，進而對其基因分型，挑選其中純合子進行克隆測序。4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳(I)玻璃板處理:將配套的玻璃板、梳子及邊條洗凈晾干，用酒精棉球擦一遍，晾干后，吸取少量(約1000 μ L)剝離硅烷于吸水紙上，迅速全面的擦拭凹板(上玻璃板)，室溫放置5-10min ;然后吸取少量稀釋親和硅烷溶液于吸水紙上，迅速全面的擦拭平板(下玻璃板)一遍，待2-3min，再吸取少量擦拭一遍，室溫放置5_10min。(2)組裝玻璃板:將平板平放于高于桌面的一水平介質(zhì)上，平板兩邊放好邊條，蓋上凹板，板兩邊用12個夾子對稱固定好。(3)聚丙酰胺凝膠的配制 從4°C冰箱中拿出已配好的30%丙烯酰胺、10%過硫酸銨和TEMED，用移液管移取10mL30%丙烯酰胺、10mL5XTBE、30mL蒸餾水，在用移液器移取350 μ L10%過硫酸銨、20 μ L TEMED,迅速攪拌混勻。注意:丙烯酰胺、過硫酸銨和TEMED均有神經(jīng)毒性，取用時要佩戴手套和口罩。(4)灌膠:用移液管吸取上述凝膠液，從玻璃板凹口一端緩慢注入，同時用洗耳球輕輕敲擊板上表面，使膠液在板內(nèi)移動迅速且均勻，直至板內(nèi)充滿膠液。(5)插入梳子:從凹口端慢慢插入梳子平頭端，要盡量避免氣泡產(chǎn)生，如若產(chǎn)生氣泡，則要拿掉有氣泡一邊的幾個夾子，用小鐵鏟慢慢撬起玻璃板，直至氣泡消失，再輕輕放下玻璃板，夾好夾子，從另凹口另一端加入缺少的膠液。待膠液充滿板內(nèi)且沒有氣泡時，室溫水平放置待膠凝固。(6)預電泳:待膠凝好后，將梳子平頭端慢慢拔出，迅速插入梳齒端，梳齒插入膠中約l_2mm。取下板兩邊夾子，將玻璃板移至垂直電泳槽內(nèi)，兩邊固定好，然后在上下電泳槽內(nèi)倒入適量的IXTBE緩沖液，用注射器吸取電泳液清洗點樣孔，以除去其中的氣泡及碎膠，最后插好電極，300V電泳30min。(7) PCR產(chǎn)物處理:向PCR產(chǎn)物中按照體積比1:1比例加入變性上樣緩沖液(去離子甲酰胺 98mL、EDTA (0.5M，pH 為 8.0) 2mL、溴酚藍 0.25g、二甲苯氰 0.25g，混勻)，PCR 儀中98°C變性lOmin，然后迅速插入冰中冰浴lOmin。(8)點樣:用移液器吸取2.5 μ L變性后PCR產(chǎn)物，依次點入點樣孔中。(9)電泳:4°C，300V 電泳 5min，而后改為 200V 電泳 10h。(10)結(jié)束電泳:關(guān)閉電泳儀，回收電泳緩沖液，擰開電泳槽兩邊固定玻璃板的螺絲，取下玻璃板放于桌面水平介質(zhì)上，拔掉梳子和兩邊的邊條，用小鐵鏟從玻璃板平口底端一邊小心撬起凹板，準備銀染。4.2聚丙烯酰胺凝膠銀染(I)固定:將除去上邊凹板的玻璃板放于盛有2L固定/終止液的水槽中，固定lOmin，期間輕輕來回振蕩幾次。然后取出玻璃板放于盛有2L蒸餾水的水槽中，輕輕沖洗玻璃板兩次，沖洗掉多余固定液及未固定住的DNA。(2)染色:將玻璃板放于盛有2L染色液的水槽中染色20min，期間輕輕來回振蕩幾次。然后在蒸餾水中迅速清洗兩次，沖掉膠表面多余染色液。(3)顯色:將玻璃板迅速放入盛有2L顯色液(臨用前現(xiàn)加入3mL甲醛)的水槽內(nèi)顯色，期間不斷輕輕振蕩， 直至出現(xiàn)清晰地條帶。一般5-10min，時間不宜過長，防止顯色背景過深。(4)終止:將出現(xiàn)清晰條帶的玻璃板迅速放到第一步固定用的固定/終止液中終止顯色。(5)回收各銀染試劑，并將玻璃板從固定/終止液中撈出，放于水平面上自然晾干。(6)標記好樣本序號，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染后呈現(xiàn)不同的條帶，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，H-FABP基因第一外顯子內(nèi)檢測到兩個等位基因(A和B)，3種基因型(AA、BB和AB)。4.3條帶統(tǒng)計根據(jù)銀染結(jié)果分析各樣本的條帶數(shù)量及位置，確立各樣本的基因型，及各基因型的樣本數(shù)目。5.純合子克隆測序5.1PCR 擴增各引物擴增片段經(jīng)SSCP分析后，挑選兩個純合子基因型樣本，每個基因型挑選兩個個體重復，按照上述PCR擴增反應體系和反應程序，進行PCR擴增。取3 μ L擴增產(chǎn)物，力口I μ L6 X Loading buffer混勻，點樣于2%的瓊脂糖凝膠中，120V電泳25min。5.2PCR產(chǎn)物切膠回收使用天根生化科技(北京)有限公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收純化，步驟如下:(1)每個引物取上述4個2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果較好的PCR擴增產(chǎn)物，加入到一個新的小離心管中，加入15 μ L6XLoading buffer,混勻，加入點樣孔寬度為2cm的
1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。放入EB溶液中染色18min。(2)離心管稱重后，標上標簽，在紫外燈下，切取目的DNA片段條帶，盡量切掉不含DNA條帶的凝膠，放入干凈離心管中，稱重。(3)向離心管中加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin，期間不斷翻轉(zhuǎn)離心管幾次，確保凝膠全部溶解。(4)吸附柱的平衡:將吸附柱放入收集管中，加入500 μ L平衡液BL，12000rpm離心lmin，倒掉廢液后，再將吸附柱放回收集管中。(5)將步驟(2)所得溶液冷卻至室溫后，加入到平衡好的吸附柱中，室溫放置2min，然后12000rpm離心60sec，倒掉廢液，再將吸附柱放回收集管中。(6)向吸附柱中加入60(^1^已加入無水乙醇的漂洗液？1，靜置31^11后，12000印111離心60sec，倒掉廢液，再將吸附柱放回收集管中。(7)重復操作步驟5。(8)將吸附柱放回收集管后，12000rpm離心2min。將吸附柱放置于室溫1Omin左右，徹底晾干，以防止殘留漂洗液影響后續(xù)試驗。(9)將晾干的吸附柱放入到一個剪掉上蓋的離心管中，向吸附膜中央位置懸空滴加40 μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到目的DNA溶液。(10)將上步離心得到的目的DNA溶液重新滴加到吸附膜上，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，將目的DNA溶液收集到一個新的離心管內(nèi)。
(11)取上述目的DNA溶液5 μ L，加入I μ L6 X Loading buffer，上樣于L 5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，剩下的目的DNA溶液放于_20°C保存?zhèn)溆谩?.3目的DNA與T-載體的連接、轉(zhuǎn)化(I)超凈工作臺滅菌:先用75%的酒精將工作臺臺面及要用到的儀器擦拭一遍，將滅菌的槍頭、離心管、離心管架等物品放入超凈工作臺中，然后打開紫外燈照射20min，再打開風機吹5min即可。(2)從_20°C冰箱中取出T-載體連接試劑盒，放于冰上溶解。在滅菌后的超凈工作臺上，向200μ L離心管內(nèi)依次加入以下連接體系:Solution I 2.5 μ L，PCR純化產(chǎn)物
2.0μ L (50ng/y L),pMD19-T Vector (50ng/μ L)0.5 μ L，總量為 5 μ L?；靹?，16°C 靜置反應 30min。(3)從_80°C冰箱中拿出T0P10感受態(tài)細胞放在冰上，待其剛好解凍時(約5-10min)，將上述連接體系全量5 μ L加入到50 μ L感受態(tài)細胞中混勻后將樣品轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管內(nèi)，然后迅速放于冰中冰浴30min。(4)打開水浴鍋，溫度設(shè)置為42°C，同時提前打開恒溫培養(yǎng)箱和恒溫搖床，溫度設(shè)定為37°C。(5)冰浴結(jié)束后迅速放入42°C水浴鍋內(nèi)熱激45sec，再迅速放入冰中冰浴2min，期間不要搖晃樣品，要輕拿輕放。(6) 4°C冰箱中取出未加氨節(jié)青霉素(Amp)的LB液態(tài)培養(yǎng)基,并向從冰中取出的樣品中加入450 μ L不含Amp的液態(tài)LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)90min。(7)重復操作步驟I。
`
(8)取100 μ L上述培養(yǎng)物用涂布器均勻涂布于倒好的固態(tài)LB培養(yǎng)基上(加有Amp+、ITPG和X-gal)，剩余的培養(yǎng)物可以保存在4°C冰箱中，以備涂板效果不好時再次使用。(9)涂好的板正放于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后倒置培養(yǎng)過夜(約14-16h)。5.4重組質(zhì)粒的鑒定(I)取出培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿，觀察平板上細菌的生長狀況。如生長密度，可根據(jù)需要調(diào)整下次涂板的菌液量；細菌分布情況，可據(jù)此判斷涂板時是否涂布的均勻；陽性菌落，陽性菌落為白斑，陰性菌落為藍斑；菌落大小，可據(jù)此調(diào)整平板培養(yǎng)時間。(2)將培養(yǎng)好的平板用封口膜封口，并放于4°C冰箱中保存8小時，待藍白斑更為明顯時挑菌。(3)在滅菌后的超凈工作臺中，從培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)皿上挑取白色單個菌落接種于盛有500 μ L37°C預熱的液態(tài)LB/Amp+培養(yǎng)基的1.5mL離心管中，用封口膜封口后放于37°C搖床中200rpm/min培養(yǎng)過夜。(4)將平板封口后放于4°C冰箱中保存，以備測序失敗再次挑菌。(5)菌液PCR檢測:在滅菌的超凈工作臺中進行操作，PCR反應體系為:10XBuffer2.0μ L，20ymol/L 上、下游引物各 0.15μ L，2mmol/L dNTPs2 μ L，5U/μ LTaq 酶0.2 μ L，菌液 I μ L, 25mmol/L 的 Mg2+2 μ L,超純水 12.5 μ L,總計 20 μ L。PCR擴增程序為:95°C預變性5min，95°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，最后降至4°C。
(3)結(jié)果鑒定:菌液PCR結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)擴增片段有無和大小，鑒定外源目的DNA是否插入質(zhì)粒中。
5.5克隆片段序列測定將上述陽性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進行測序，每個樣本送測3個重復，以確保測序準確性。AA和BB兩種純合型PCR產(chǎn)物克隆測序結(jié)果如圖4a和4b，發(fā)現(xiàn)B等位基因在H-FABP基因第2內(nèi)含子第872bp處發(fā)生C — G的突變，AA基因型為CC純合子，BB基因型為GG純合子。AA基因型的序列如SEQ ID N0.3所示，BB基因型的序列如SEQ ID N0.4所6.肉質(zhì)性狀測定屠宰時選取胴體第12 13肋骨間背最長肌為測量部位，供MF的測定和大理石花紋等級評分。MF含量的測定采用索式提取法，參照GB/T9695.7-2008進行測定。大理石花紋等級評分參照NY/T676-2003(中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)評定標準大理石花紋7級評分)評定。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)合SSCP圖譜及測序結(jié)果，對基因型頻率和基因頻率進行統(tǒng)計計算。由于樣本個體選自同一品種、同一養(yǎng)殖場、同一育肥批次，所以按Yi=U +gi+ei模型進行基因型效應值的分析，Yi為第i種基因型個體肉質(zhì)性狀的測定值，μ為肉質(zhì)性狀的最小二乘均值，gi為第i種基因型對肉質(zhì)性狀的效應值，ei為測定值的隨機殘差效應。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析H-FABP基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。表I布萊凱特黑牛H-FABP基因型頻率及基因頻率的分布
權(quán)利要求
1.一種布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列，其特征在于，是布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子第872位為C或G的堿基多態(tài)性序列。
2.—種布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 以包含H-FABP基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子；對PCR產(chǎn)物進行SSCP檢測并對基因分型；對基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的引物對P為: 上游引物:5’ -TTCCTCCAGCAGCACCTTTC-3’ ； 下游引物:5’ -CCTCCTCATTC CCATTCCTC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應體系為:10XBuffer2.Ομ L，20ymol/L上、下游引物各0.15 μ L，2mmol/LdNTPs2 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 0.2 μ L，50ng/L 的模版 DNAl μ L, 25mmol/L 的 Mg2+2 μ L，超純水12.5 μ L，總計20 μ L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為:95°C預變性5min，95°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，最后降至4°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述SSCP檢測應用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，還包括對多態(tài)性位點等位基因的基因頻率和基因型頻率的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，還包括H-FABP基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述H-FABP基因遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。
全文摘要
本發(fā)明公開了布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子部分序列的多態(tài)位點及其檢測方法，以包含H-FABP基因的待測布萊凱特黑牛全基因組DNA序列為模板，以引物對P為引物，PCR擴增布萊凱特黑牛H-FABP基因第2內(nèi)含子；對PCR產(chǎn)物進行SSCP檢測并對基因分型；對基因分型的純合子測序得到布萊凱特黑牛H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性序列。根據(jù)PCR-SSCP及測序結(jié)果分析顯示，H-FABP基因第2內(nèi)含子第872位為C或G。H-FABP基因?qū)εＨ饽鄱染哂芯薮笥绊?，AA基因型的肌內(nèi)脂肪含量和大理石花紋豐富程度顯著優(yōu)于AB基因型和BB基因型，因此可將AA基因型作為優(yōu)質(zhì)肉牛品種選育的分子標記，為布萊凱特黑牛優(yōu)良種質(zhì)的選育提供重要技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/68GK103146697SQ201310100930
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者董雅娟, 趙仕全 申請人:董雅娟