專(zhuān)利名稱：栽培二粒小麥的低分子量麥谷蛋白亞基基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及栽培二粒小麥的低分子量麥谷蛋白亞基基因的核酸序列和其編碼的蛋白，以及該蛋白在改善面粉性能方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟显耘嗝娣e最大、種植最廣泛的三大主要糧食作物之一。小麥面粉所形成的面團(tuán)因其獨(dú)特的粘彈性和延展性可以被加工成各種面食，包括面包、蛋糕、面條和餅干等。而小麥面團(tuán)這種獨(dú)特的特性正是由于其種子中的儲(chǔ)藏蛋白所引起的。小麥中的儲(chǔ)藏蛋白主要分為麥谷蛋白和醇溶蛋白，而麥谷蛋白可以根據(jù)分子量大小進(jìn)一步分為兩類(lèi):高分子量麥谷蛋白亞基(high-molecular-weight glutenin subunits, HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(low-molecular-weight glutenin subunits, LMW-GS)。研究表明，LMW-GS對(duì)面團(tuán)的粘彈性起作用，并進(jìn)而影響到小麥的食品加工品質(zhì)，因此對(duì)這類(lèi)蛋白進(jìn)行基因克隆、多樣性研究、功能研究對(duì)改良小麥品質(zhì)具有重要意義。低分子量麥谷蛋白亞基基因位于小麥第一部分同源染色體短臂上的G1U-A3，Glu-B3，Glu-D3 位點(diǎn)上(DJ Ovidio and Masci2004 ；Dong et al.2010)，并且每個(gè)位點(diǎn)上所表達(dá)的基因不止一個(gè)。于是，盡管對(duì)于普通小麥中確切的LMW-GS基因數(shù)目并不清楚，研究者運(yùn)用多種技術(shù)估計(jì)小麥中LMW-GS數(shù)目約為10-20個(gè)到30-40個(gè)之間(Cassidy etal.1998 ；Huang and Cloutier2008 ；Zhang et al.2011) LMW-GS 的蛋白質(zhì)根據(jù)其成熟月太的首個(gè)氨基酸分類(lèi)，可以分為L(zhǎng)MW-m、LMW-1和LMW-s三類(lèi)，對(duì)應(yīng)的首個(gè)氨基酸分別是(甲硫氨酸、異亮氨酸和絲氨酸)(Shewry et al.2009)。而根據(jù)目前克隆到的超過(guò)300條LMW-GS的基因序列，其蛋白結(jié)構(gòu)上可以分為以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)域:由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽、13個(gè)氨基酸組成的N端保守區(qū)(i類(lèi)型的LMW-GS不含此區(qū)域)、N端重復(fù)區(qū)、C端半胱氨酸富集區(qū)、C端谷氨酰胺富集區(qū)和C端保守區(qū)(D’ Ovid io and Masci2004)。前人研究表明，多數(shù)LMW-GS蛋白家族成員對(duì)小麥面粉品質(zhì)的作用不大，少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上存在變異的LMW-GS家族成員(通常是由于基因突變導(dǎo)致LMW-GS蛋白序列中存在奇數(shù)個(gè)半胱氨酸殘基)能夠改善其小麥面粉的揉混特性(Xu et al.2006 ；Chen et al.2010)。這樣的LMW-GS基因?qū)π←溍娣燮焚|(zhì)改良用重要意義，其蛋白質(zhì)可做為面粉添加劑應(yīng)用于小麥面粉工業(yè)。栽培二粒小麥(Triticumturgidum ssp.dicoccum, 2n = 4x = 28, AABB)與六倍體普通小麥的親緣關(guān)系較近，其具有與普通小麥高度同源的AABB染色體組。而目前LMW-GS的克隆主要集中在普通小麥的不同品種中，近年來(lái)一些LMW-GS基因克隆的研究拓展到小麥的一類(lèi)近緣物種山羊草中，而對(duì)于栽培二粒小麥中的LMW-GS變異研究和新基因克隆并不多見(jiàn)。栽培二粒小麥?zhǔn)切←溄壩锓N中重要的遺傳資源，栽培二粒小麥的LMW-GS基因克隆和蛋白質(zhì)功能研究對(duì)尋找小麥面粉改良的有用基因和蛋白具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種DNA分子及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)任務(wù)是提供該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體及工程菌，用以獲得本發(fā)明提供的這種DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案是:本發(fā)明提供的這種DNA分子，由序列表中序列I所示的核苷酸序列或與序列表中序列I所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成。本發(fā)明提供的這種DNA分子，是利用PCR方法從栽培二粒小麥品種XM6 (Triticumturgidum ssp.dicoccum)中克隆到的一個(gè)低分子量麥谷蛋白亞基基因,命名為T(mén)dLMW_ml,其中“Td”為物種名縮寫(xiě)，“LMW”為基因家族縮寫(xiě)，“m”表示該基因?qū)儆贚MW-GS家族m類(lèi)基因，“ I”為研究組從栽培二粒小麥中克隆到的第一條LMW-GS基因，故此命名。本發(fā)明提供的這種DNA分子編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。由序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸所形成的且具有同等活性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體，由含有上述的本發(fā)明提供的DNA分子的表達(dá)載體構(gòu)成，所述的表達(dá)載體為能夠在大腸桿菌或酵母菌中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體，具體可以是PET、pCold或pEASY，其中所述的表達(dá)載體pET具體可以是pET32。本發(fā)明提供的工程菌，由含有上述本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體的宿主菌構(gòu)成，所 述的宿主菌為大腸桿菌或酵母菌，所述的作為宿主菌大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的實(shí)施例中構(gòu)建了該基因的大腸桿菌表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá)并純化出來(lái)的該由該基因編碼的蛋白質(zhì)摻入面粉可明顯改善其揉混品質(zhì)，有改善面粉筋度的應(yīng)用價(jià)值。利用TdLMW-ml基因的大腸桿菌表達(dá)載體可以大量生產(chǎn)該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，提純的該蛋白摻入面粉中可以顯著改善面粉的揉混特性，增加面粉揉混時(shí)間和揉混曲線帶寬，提高面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和抗拉伸特性，從而改良面粉的面食加工品質(zhì)。本發(fā)明以栽培二粒小麥XM6總DNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide/)中已知的低分子量麥谷蛋白亞基(1w-moIecuIar-weightglutenin subunits, LMW-GS)編碼基因5’和3’端的保守片段設(shè)計(jì)引物，利用PCR和分子克隆技術(shù)分離栽培二粒小麥中的低分子量麥谷蛋白亞基基因，得到核苷酸序列如SEQID N0.1的基因。將該基因序列與NCBI上已知的低分子量麥谷蛋白亞基基因序列進(jìn)行序列比對(duì)并分析其序列差異，結(jié)果表明我們克隆到一個(gè)新的低分子量麥谷蛋白亞基基因，命名為T(mén)dLMW-ml。該基因全長(zhǎng)885bp，不含內(nèi)含子。編碼294個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量為31.lkDa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。TdLMW-ml所編碼的蛋白質(zhì)具有典型的m類(lèi)低分子量麥谷蛋白亞基家族的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征，即蛋白質(zhì)的N端保守區(qū)氨基酸序列為“MDTSCIPGLERPW-”。TdLMW-ml編碼蛋白由以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成:20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽(signal peptide), 13個(gè)氨基酸組成的N端保守區(qū)(N-conserved region),79個(gè)氨基酸組成的N端重復(fù)區(qū)(N-repetitive region), 75個(gè)氨基酸組成的C端半胱氨酸富集區(qū)(Cysteine-rich region), 59個(gè)氨基酸組成的C端谷氨酰胺富集區(qū)(Glutamine-richregion) ,48個(gè)氨基酸組成的C端保守區(qū)(C-conserved region)。TdLMW-ml基因所編碼的蛋白含有9個(gè)半胱氨酸，其中N端保守區(qū)I個(gè)，C端半胱氨酸富集區(qū)6個(gè)，C端谷氨酰胺富集區(qū)I個(gè)，C端保守區(qū)I個(gè)。通過(guò)將該蛋白與文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)小麥面粉揉混特性有作用的LMW-GS (NCBI 編號(hào)為 AY263369 和 EU822823，Xu et al.2006 ；Chen et al.2010)和無(wú)作用的LMW-GS(NCBI編號(hào)為EU292737和EU292738，Chen et al.2011)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)TdLMW-ml所編碼的蛋白與AY263369和EU822823 —樣序列中都含有奇數(shù)個(gè)半光氨酸殘基，且C端谷氨酰胺富集區(qū)不含β-strand結(jié)構(gòu)(對(duì)面粉揉混特性無(wú)作用的EU292737和EU292738含有該結(jié)構(gòu))，因此序列分析表明該蛋白具有對(duì)提高面粉揉混特性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。應(yīng)該明確的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，在不影響其蛋白生物活性的前提下，對(duì)其實(shí)施取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)序列比對(duì)同源性在98%以上，所得到所述蛋白的突變體序列。因此，本發(fā)明，還包括對(duì)SEQ ID N0.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，得到的高同源性且具有生物活性的衍生蛋白。此外，應(yīng)當(dāng)理解，鑒于密碼子兼并性及物種具有密碼子偏好性的特點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)既可以從栽培二粒小麥品種XM6中克隆或分離得到，或者通過(guò)序列化學(xué)合成方法得到。本發(fā)明的另一方面涉及重組表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體含有本發(fā)明所述TdLMW-ml基因的核苷酸序列，所述重組表達(dá)載體可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)將上述核苷酸序列插入表達(dá)載體而得到。本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在大腸桿菌和酵母菌中進(jìn)行表達(dá)的任何載體，適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如:pET、pCold、pEASY等。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的表達(dá)載體優(yōu)選pET32-tdLMW表達(dá)載體?？蓪⒈景l(fā)明基因連接至表達(dá)載體啟動(dòng)子下游，構(gòu)建能夠表達(dá)該蛋白的重組表達(dá)載體，進(jìn)而可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化的方法，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌或酵母菌中，得到轉(zhuǎn)TdLMW-ml基因的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，可在大腸桿菌或酵母菌中大量表達(dá)、純化TdLMW-ml基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白摻入面粉可以提高面粉的揉混品質(zhì)，主要體現(xiàn)在提高面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和抗拉伸特性，從而改良面粉的面食加工品質(zhì)。將本發(fā)明所述TdLMW-ml基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體大量表達(dá)TdLMW-ml基因所編碼的蛋白質(zhì)，純化的TdLMW-ml蛋白摻入面粉后，經(jīng)揉混儀檢測(cè)(小麥面粉加工品質(zhì)領(lǐng)域檢測(cè)儀器，Mixograph)，面粉的揉混時(shí)間和面粉揉混曲線帶寬較摻粉前顯著增加，面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和抗拉伸特性明顯提高，且與對(duì)小麥面粉品質(zhì)有明顯作用的HMW-GS蛋白添加面粉效果類(lèi)似(Xu et al.2006 ；Chen et al.2010)。這說(shuō)明本發(fā)明所述蛋白對(duì)小麥面粉揉混品質(zhì)改良有應(yīng)用價(jià)值。


圖1:栽培二粒小麥中TdLMW-ml基因的PCR擴(kuò)增。該圖說(shuō)明通過(guò)引物(見(jiàn)實(shí)施例1)可以成功從栽培二粒小麥的基因組DNA中克隆得到TdLMW-ml基因。泳道M為MarkerIII (具體條帶大小參見(jiàn)圖1);泳道I為以栽培二粒小麥基因組DNA為模板的PCR結(jié)果；泳道2為陰性對(duì)照。圖2:TdLMW-ml基因所編碼的蛋白質(zhì)與其他m類(lèi)低分子量麥谷蛋白亞基家族成員的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，該圖說(shuō)明TdLMW-ml基因所編碼的蛋白質(zhì)與其他已知的m類(lèi)低分子量麥谷蛋白亞基家族中的蛋白質(zhì)有高度的 同源性。用來(lái)與TdLMW-ml所編碼的蛋白進(jìn)行序列比對(duì)的m類(lèi)低分子量麥谷蛋白亞基基因的NCBI登錄號(hào)為AJ519835、AY263369、AY299485、AY585350 和 X13306。圖3:對(duì)TdLMW-ml基因編碼蛋白的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(詳見(jiàn)實(shí)施例1)。本圖結(jié)果表明該蛋白與兩個(gè)已知的LMW-GS蛋白——AY263369和EU822823 (經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道已證實(shí)了這兩個(gè)蛋白摻入面粉能夠顯著增強(qiáng)面粉的揉混特性)具有相似的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖中，用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的序列包括本發(fā)明所述蛋白(由TdLMW-ml基因所編碼)、兩個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)小麥面粉揉混特性沒(méi)有顯著貢獻(xiàn)的LMW-GS蛋白(EU292737和EU292738)以及兩個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)面粉揉混特性有顯著貢獻(xiàn)的LMW-GS蛋白(AY263369和EU822823)。圖中采用不同灰度表示不同的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，白色表示無(wú)規(guī)卷曲(coil)，淺灰色表示α -螺旋(a-helix),深灰色表示β-股(β-strand)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析由RaptorX在線蛋白質(zhì)分析網(wǎng)站完成(http://raptorx.uchicag0.edu/;Kallberg et al.2012)。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，LMW-GS蛋白是否能夠增強(qiáng)小麥面粉揉混特性需要其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上滿足兩個(gè)特性:①在蛋白的半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich region)含有額外的半胱氨酸殘基(在圖中用加粗斜體數(shù)字標(biāo)注)，并且LMW-GS蛋白中總半胱氨酸殘基數(shù)需為奇數(shù)個(gè)(LMW-GS蛋白家族成員的半胱氨酸殘基數(shù)標(biāo)注在對(duì)應(yīng)編碼基因后的括號(hào)內(nèi))；②在蛋白的谷氨酰胺富集區(qū)(glutamine-rich region)中除半胱氨酸殘基處無(wú)β-股結(jié)構(gòu)(在圖中有箭頭指示)。綜上所述，圖3顯示TdLMW-ml基因所編碼的蛋白質(zhì)均滿足以上兩點(diǎn)，具有增強(qiáng)面粉揉混特性的LMW-GS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。圖4:TdLMW-ml基因大腸桿菌表達(dá)載體(即pET32_tdLMW)酶切鑒定結(jié)果，該結(jié)果顯示我們成功通過(guò)分子克隆技術(shù)將TdLMW-ml基因連入pET32-tdLMW載體中(詳見(jiàn)實(shí)施例2)。泳道Ml為Marker II (具體條帶大小參見(jiàn)圖5);泳道I為大腸桿菌表達(dá)載體pET32-tdLMW的BamH I單酶切結(jié)果；泳道2為pET32_tdLMW的BamH I和HindIII雙酶切結(jié)果；泳道3為pET32-tdLMW的未酶切對(duì)照；泳道4為大腸桿菌載體pET_32a (不含TdLMW-ml基因)的BamH I單酶切結(jié)果；泳道5為pET_32a的BamH I和HindIII雙酶切結(jié)果；泳道6為pET-32a的未酶切對(duì)照；泳道M2為MarkerIV (具體條帶大小參見(jiàn)圖4)。圖5:大腸桿菌菌株B L21表達(dá)TdLMW-ml重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果，該結(jié)果顯示通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法將pET32-tdLMW載體導(dǎo)入大腸桿菌后，在IPTG誘導(dǎo)下，大腸桿菌菌株BL21可以大量表達(dá)TdLMW-ml重組蛋白(由TdLMW-ml基因所編碼，另含有載體編碼的HIS-Tag氨基酸標(biāo)簽，便于提純，TdLMW-ml重組蛋白大小約為51kDa)(詳見(jiàn)實(shí)施例3)。圖中，泳道M為蛋白質(zhì)分子量Marker (不同分子量大小的蛋白質(zhì)見(jiàn)泳道M旁標(biāo)注)；泳道I為轉(zhuǎn)pET_32a載體的大腸桿菌未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)所表達(dá)的蛋白質(zhì)；泳道2為轉(zhuǎn)pET-32a載體的大腸桿菌經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)所表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中可見(jiàn)在約20kDa處有一條帶對(duì)應(yīng)HIS-Tag氨基酸標(biāo)簽；泳道3為轉(zhuǎn)pET32-tdLMW載體的大腸桿菌未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)所表達(dá)的蛋白質(zhì)；泳道4為轉(zhuǎn)pET32-tdLMW載體的大腸桿菌經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)所表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中在約為51kDa處表達(dá)的蛋白條帶是TdLMW-ml重組蛋白(如箭頭所示)。圖6:該圖顯示的是經(jīng)過(guò)純化的TdLMW-ml蛋白摻入面粉后,揉混儀(Mixograph)所檢測(cè)的揉混時(shí)間(mixing time, MT)、揉混曲線峰值帶寬(peak width, PW)和揉混曲線8分鐘帶寬(time X = 8min wdith，TxW)均有顯著提高，說(shuō)明TdLMW-ml基因編碼蛋白通過(guò)摻入面粉的方式可以增強(qiáng)小麥面粉的揉混特性，增強(qiáng)面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和抗延展特性(詳見(jiàn)實(shí)施例4)。圖中，對(duì)照(control)用白色柱表示，為不添加任何蛋白質(zhì)的面粉的揉混儀檢測(cè)參數(shù)；公認(rèn)的對(duì)面粉揉混特性貢獻(xiàn)較小的蛋白——高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)家族成員Dx2用作負(fù)對(duì)照(每IOg面粉中添加50mg)，用中灰色柱表示；公認(rèn)的對(duì)面粉揉混特性貢獻(xiàn)較大的蛋白——高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)家族成員Bxl4用作正對(duì)照(每IOg面粉中添加50mg)，用黑色柱表示；TdLMW-ml基因編碼蛋白添加面粉后的揉混儀檢測(cè)參數(shù)分別用淺灰色(每IOg面粉中添加50mg)和深灰色柱(每IOg面粉中添加IOOmg)表示。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1栽培二粒小麥TdLMW-ml基因的分離和序列分析1、提取基因組DNA采用以CTAB法為原理的植物基因組DNA提取試劑盒(來(lái)自天根生化科技(北京)有限公司)，從小麥葉片(IOOmg新鮮葉片組織)中提取基因組DNA，所有操作均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2、PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增:根據(jù)已知的來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的低分子量麥谷蛋白亞基基因序列，分析其編碼基因的5’和3’的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了以下引物:上游引物:AT GAAGACCTTCCTCGTCTTTGCCCT下游引物:TCAGTAGACACCAACTCCGATG以基因組DNA為模板擴(kuò)增栽培二粒小麥中的低分子量麥谷蛋白亞基基因的PCR反
應(yīng)體系如下:
DNA100 ng
dNTPs100 μΜ
引物IDpM 引物25ρΜ Taq酶(高保真) IU IOxPCR 緩沖液 2.5 μ ddH20 加至終體積25μΕPCR反應(yīng)程序:(I) 94°C 5分鐘(2) 94 0C I 分鐘(3) 60 0C I 分鐘
(4) 72°C 1.5 分鐘(5)重復(fù)⑵至(4)步35個(gè)循環(huán)；(6) 72 0C 10 分鐘PCR反應(yīng)程序在Tl型PCR儀(Biometra，德國(guó))中進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠上分離，120V電壓恒壓電泳30分鐘，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并保存圖像。3、PCR產(chǎn)物回收和純化從凝膠中回收PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)完成，所有操作均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR結(jié)果見(jiàn)附圖1。4、連接和轉(zhuǎn)化將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到測(cè)序載體上的過(guò)程采用PCR產(chǎn)物克隆專(zhuān)用載體和配套試劑盒(PMD-18T載體和配套試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司)完成，連接反應(yīng)在16°C下進(jìn)行16小時(shí)。反應(yīng)體系如下:pMD-18T 載體 0.5 μ LSolution I 7 μ LPCR 回收產(chǎn)物 7.5yL完成連接反應(yīng)后將整個(gè)連接體系(15 μ L)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Τ0Ρ10菌株的感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)中，轉(zhuǎn)化方法按照感受態(tài)細(xì)胞生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。5、陽(yáng)性克隆的篩選挑取平板上生長(zhǎng)良好的白色菌落，在含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，并從混濁的菌液中抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒抽提采用質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以抽提的質(zhì)粒為PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下:
權(quán)利要求
1.一段DNA分子，由序列表中序列I所示的核苷酸序列或與序列表中序列I所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的上游和下游還分別包括一個(gè)酶切位點(diǎn)，所述DNA分子上游的酶切位點(diǎn)為BamH I酶切位點(diǎn)，所述DNA分子下游的酶切位點(diǎn)為Hind III酶切位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1所述的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。
4.一種蛋白質(zhì)，由序列表中序列2所示的氨基酸序列構(gòu)成，或由序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸所形成的且具有同等活性的氨基酸序列構(gòu)成。
5.—種重組表達(dá)載體，由含有權(quán)利要求1或2所述的DNA分子的表達(dá)載體構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體為能夠在大腸桿菌或酵母菌中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體是pET、pCold或pEASY。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體pET是pET32。
9.一種工程菌，由含有權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體的宿主菌構(gòu)成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所 述的工程菌，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌或酵母菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述的作為宿主菌大腸桿菌為大腸桿菌BL21。
12.權(quán)利要求3或4所述的蛋白質(zhì)在增強(qiáng)面粉的揉混性、提高面筋強(qiáng)度和/或提高面團(tuán)的抗拉伸性中的應(yīng)用。
13.含有權(quán)利要求3或4所述的蛋白質(zhì)的面粉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來(lái)自栽培二粒小麥的低分子量麥谷蛋白亞基基因(名為T(mén)dLMW-ml)及其編碼的蛋白質(zhì)，構(gòu)建了含TdLMW-ml基因的大腸桿菌表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)純化，獲得由TdLMW-ml基因編碼的蛋白，將該蛋白添加到面粉中，能夠增強(qiáng)面粉的揉混特性，提高面筋強(qiáng)度和面團(tuán)的抗拉伸特性。
文檔編號(hào)A21D2/26GK103233015SQ20131010099
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者何光源, 楊廣笑, 李引, 王瓊, 李小燕, 肖欣, 孫福生 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)