專利名稱：特異性結(jié)合cd154 的包括抗體、抗體衍生物和抗體片段在內(nèi)的結(jié)合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供特異性結(jié)合⑶154 (⑶40L)蛋白的結(jié)合蛋白，包括抗體、抗體衍生物和抗體片段。本發(fā)明還提供與表位特異性結(jié)合的嵌合、人源化或全人抗體、抗體衍生物或抗體片段，含SEQ ID NO:1的可變重鏈序列且含SEQ ID NO:2的可變輕鏈序列的人源化Fab片段與所述表位特異性結(jié)合。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白可引發(fā)相對于第二種抗CD154抗體減少的效應(yīng)子功能。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白在診斷和治療方法中有用，例如在治療和預(yù)防疾病中，包括涉及由⑶154-⑶40相互作用介導(dǎo)的不希望有的免疫應(yīng)答的疾病中。
背景技術(shù)：
體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的產(chǎn)生由活化的輔助T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(“APC”)和效應(yīng)T細(xì)胞的相互作用配合。輔助T細(xì)胞的活化不僅依賴抗原特異性T細(xì)胞受體(“TCR”)與其同源肽-MHC配體的相互作用，還需要由許多細(xì)胞粘附和共刺激分子的協(xié)調(diào)結(jié)合和活化。參見例如，Salazar-Fontana, L.1.and B.E.Bierer (2001) Curr.0pin.Hemat.8:5。一種關(guān)鍵的共刺激分子是⑶154，以活化依賴性、暫時限制方式在⑶4+T細(xì)胞的表面上表達的II型跨膜蛋白。在活化后，CD154也在CD8+T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血小板的子集上表達。⑶154反受體CD40是在包括APC在內(nèi)的許多細(xì)胞類型表面上組成型且廣泛表達的I型膜蛋白。參見例如，F(xiàn)oy, T.M.et al., (1996) Ann.Rev.1mmunol.14:5910通過⑶40經(jīng)由⑶154信號起始事件級聯(lián)，這導(dǎo)致具有⑶40受體的細(xì)胞的活化和最佳的CD4+T細(xì)胞引發(fā)。更具體而言，CD154與CD40的結(jié)合促進B細(xì)胞分化成抗體分泌細(xì)胞和記憶 B 細(xì)胞。參見例如，Burkly, L.C.(2001)In Adv.Exp.Med.Bi0.,第 489 卷.D.M.Monroeet al.,編輯 Kluwer Academic/Plenum Publishers,第 135 頁(以下簡稱“上述 Burkly 的文章”)。此外，⑶154-⑶40相互作用通過巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的活化以及天然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生來促進細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。參見例如，上述Burkly的文章。CD 154在調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的功能中的中樞作用已引起將此通路的抑制劑用于治療性免疫調(diào)節(jié)的用途中的極大興趣。像這樣，抗⑶154抗體已顯示在針對其他治療性蛋白或基因療法、變應(yīng)原、自身免疫和移植的廣泛多樣的免疫應(yīng)答模型中是有利的。參見例如，US5, 474，771 ;上述Burkly的文章。
⑶40-⑶154相互作用已顯示在幾種實驗誘導(dǎo)的自身免疫疾病中是重要的，在其中已顯示疾病誘導(dǎo)可在抗原施用時用⑶154拮抗劑阻斷(上述Burkly的文章)。使用抗⑶154拮抗劑的疾病阻斷已見于自發(fā)性自身免疫疾病的動物模型中。參見例如，上述Burkly的文.1V.早。目前存在對具有更高結(jié)合親和力和更少不需要的副作用的改良的抗CD154抗體的需求。增加的“效應(yīng)子功能”例如直接的細(xì)胞毒性、補體依賴性細(xì)胞毒性(“CDC”)、抗體依賴性細(xì)胞毒性(“ADCC”)和異常抗體產(chǎn)生，是可能與治療抗體有關(guān)的不需要的副作用。幾種抗體效應(yīng)子功能至少部分由Fe受體(FcR)介導(dǎo)，所述Fe受體結(jié)合一般免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域中的抗體Fe區(qū)。存在對不同免疫球蛋白類別特異的許多Fe受體。免疫球蛋白類別包括IgG、IgE、IgA、IgM和IgD。免疫球蛋白類別進一步分成亞類:IgG分成4個亞類(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)，而IgA分成2個亞類(IgAl和IgA2)。有IgG的3種已知受體:Fe Y RI (CD64)、FcyRII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16))。每個 Fe Y R 亞類由 2 種或3種基因編碼，并且可變RNA剪接導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄物和Fe Y R同種型的廣泛多樣性。一般地，免疫球蛋白是含2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈的Y型分子。二硫鍵使重鏈和輕鏈對以及2條重鏈連接在一起。每條鏈由在序列方面不同且負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的I個可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥劓満洼p鏈分別稱為Vh和'結(jié)構(gòu)域。在輕鏈中存在單個恒定結(jié)構(gòu)域(Clj),并且在重鏈中存在3個恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)。含所有可變和恒定結(jié)構(gòu)域的分子可稱為完整抗體?？贵w可變結(jié)構(gòu)域中的殘基通常根據(jù)由Kabat等人設(shè)計的系統(tǒng)進行編號。這個系統(tǒng)在 Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, USDepartment of Health and Human Services, NIH, USA (以下簡稱“上述 Kabat 等人的文章”)中闡述。除非另有說明，在本說明書中使用這個編號系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)指出Kabat殘基命名不一定直接對應(yīng)氨基酸殘基的線性編號。實際線性氨基酸序列可能含與嚴(yán)格Kabat編號中不同的更少或附加的氨基酸，對應(yīng)于無論是基本可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)還是互補決定區(qū)(CDR)的結(jié)構(gòu)組分的縮短或插入。給定抗體的殘基的正確Kabat編號可通過使抗體序列中的同源性殘基與“標(biāo)準(zhǔn)” Kabat編號序列比對予以測定。

可變結(jié)構(gòu)域有3個序列組高度可變的區(qū)域位于4個更高度保守的構(gòu)架區(qū)之間。這些高度可變的CDR主要負(fù)責(zé)抗原識別。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR位于殘基 31-35 (CDR-Hl)、殘基 50-65 (CDR-H2)和殘基 95-102 (CDR-H3)處。然而，根據(jù) Chothia(Chothia, C.and Lesk, A.M.J.Mol.Biol.，1987，196:901_917)，等價于 CDR-Hl 的環(huán)從殘基26延長至殘基32。因此,根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)和Chothia的拓?fù)洵h(huán)定義的組合描述,本文所述’⑶R-ΗΓ還包括位于殘基26-35處的⑶R。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR 位于殘基 24-34 (CDR-Ll )、殘基 50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)處。盡管天然存在的抗體(如完整抗體或如保留特異性結(jié)合性質(zhì)的片段)最初源自單個物種，但經(jīng)改造抗體(例如嵌合抗體)可源自超過一個動物物種。迄今為止，已主要產(chǎn)生小鼠(鼠類)/人嵌合抗體和鼠類/非人靈長類抗體，盡管其他嫁接物種組合(hybrid speciescombinations)也是可能的。目前已知天然存在的和經(jīng)改造抗體多肽、及其衍生物和片段的許多不同構(gòu)型。所有共同的特征是一種以上的所述多肽保留通過一個以上的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合特異性。除表位結(jié)合外，抗體多肽的功能性質(zhì)可依賴于存在何種其他序列而不同，例如Fe結(jié)構(gòu)域或活化效應(yīng)子功能和/或與其他細(xì)胞通路相互作用的其他序列。含摻入非免疫球蛋白支架或構(gòu)架內(nèi)的表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如CDR或可變結(jié)構(gòu)域)的 CD154 結(jié)合蛋白(參見例如，Binz et al., 2005Nat Biotech 23:1257_1268 ;Hosse etal., 2006Protein Sciencel5:14-27)可顯示出減少的效應(yīng)子功能。希望具有特異性拮抗⑶154與⑶40結(jié)合且減少或消除⑶154-⑶40復(fù)合物的下游功能的新結(jié)合蛋白。還希望具有與已知抗CD154抗體相比具有減少的效應(yīng)子功能的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供特異性結(jié)合⑶154蛋白(其可為人⑶154蛋白)的結(jié)合蛋白(例如分離的、重組的或合成的抗體、或其片段或衍生物)來提供對于這些和其他問題的解決方案。本發(fā)明的抗CD154抗體，包括其片段和衍生物，可為單克隆的、多克隆的、鼠類的、嵌合的、靈長類化的、人源化的或全人抗體。本發(fā)明的抗CD154抗體可為多聚、異二聚、半二聚(hemidimeric)、單價、二價、四價、雙特異性的，并且可包括單鏈抗體；及這些的衍生物。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)具有對于⑶154的高選擇性，并且在一些實施方案中，還相比例如抗⑶154抗體5c8 (如在US5，474，771中所述由保藏號為ATCCN0.HB10916的雜交瘤產(chǎn)生；或人源化5c8)具有一種以上的減少的效應(yīng)子功能。本發(fā)明的某些CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)對于CD 154結(jié)合是單價的。本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體(包括抗體片段和衍生物)對于抑制⑶154與⑶40的結(jié)合有用且特異性高，例如具有20pM — 1.5 μ M (包括端點)的IC50。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)可具有20pm — 500pm、50pm —500pm或IOOpm — 500pm的IC50。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體(包括抗體片段和衍生物)基本上不拮抗CD40活性。本發(fā)明的某些實 施方案涉及對于人⑶154顯示出高親和力的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)。例如，在某些實施方案中，如由表面等離子體共振(例如，Biacore )測得CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)以50nM — IpM (包括端點)的Kd與人CD 154 (人CD40L)解離。例如，人⑶154 的 Kd 可為 50pm — lpm、20pm — Ipm 或甚至 10pm— lpm。在一些實施方案中，人⑶154的Kd小于20pM。在其他實施方案中，人⑶154的Kd小于ΙΟρΜ。在某些實施方案中，本發(fā)明提供如下CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體):其當(dāng)基于其結(jié)合親和力以用于CD154結(jié)合的飽和濃度存在或超過用于CD154結(jié)合的飽和濃度存在時，當(dāng)首先加入⑶154中時，能夠阻斷抗體5c8與⑶154的結(jié)合，并且當(dāng)在將抗體5c8加入⑶154之后加入時，也能夠取代與⑶154結(jié)合的抗體5c8。在某些實施方案中，本發(fā)明提供如下結(jié)合蛋白(例如抗體):其特異性結(jié)合CD154蛋白，并且含一個以上的如下⑶R重鏈(H)序列或由一個以上的如下⑶R重鏈(H)序列構(gòu)成，所述序列選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR_H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)。在進一步實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗體含選自⑶R-Hl (SEQ ID NO:3)、⑶R-H2 (SEQID N0:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR-H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)中的至少 2 個 CDR 構(gòu)成。在更進一步實施方案中，結(jié)合蛋白或抗體含所有3個如下CDR H序列或由所有3個如下CDR H序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID N0:3)、CDR_H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供如下結(jié)合蛋白(例如抗體):其特異性結(jié)合CD154蛋白，并且含一個以上的如下⑶R輕鏈(L)序列或由一個以上的如下⑶R輕鏈(L)序列構(gòu)成，所述序列選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR_L2 (SEQ ID NO:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)。在進一步實施方案中，CD154結(jié)合蛋白或抗體含選自CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR_L2 (SEQID N0:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR-L2 (SEQ ID NO:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)中的至少 2 個 CDR 構(gòu)成。在更進一步實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗體含所有3個如下⑶R L序列或由所有3個如下⑶R L序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR_L2 (SEQ ID NO:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供如下結(jié)合蛋白(例如抗體):其特異性結(jié)合CD154蛋白，并且含 CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR_L2 (SEQ ID NO:7)和 CDR-L3 (SEQ ID N0:8)，或由CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR_L2 (SEQ ID NO:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)構(gòu)成，并且其中所述結(jié)合蛋白或抗體進一步含 CDR-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR-H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3(SEQ ID NO:5)，或由 CDR-Hl (SEQ ID N0:3)、CDR_H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ IDNO:5)構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述CD154結(jié)合蛋白或抗體含選自SEQ ID NO:USEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10和SEQID NO:11 的 Vh 序列，或由選自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10 和 SEQ IDNO:11的％序列構(gòu)成。在某些其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述CD154結(jié)合蛋白或抗體含選自SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:13的重鏈序列，或由選自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的重鏈序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗體含選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14的'序列，或由選自SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:14的 '序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合⑶154蛋白的結(jié)合蛋白(例如 抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗體含SEQ ID NO:15的輕鏈序列，或由SEQ ID NO:15的輕鏈序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗體含選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14的Vl序列以及選自SEQ ID NO:U SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10 和 SEQ ID NO:11 的 Vh 序列，或由選自 SEQ IDNO:2 和 SEQ ID NO:14 的 Vl 序列以及選自 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 和SEQ ID N0:11的乂11序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述CD154結(jié)合蛋白或抗體含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列以及選自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的重鏈序列，或由SEQ ID NO:15的輕鏈序列以及選自SEQID N0:12和SEQ ID NO:13的重鏈序列構(gòu)成。在其他實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗體含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列和SEQ ID NO: 13的重鏈序列，或由SEQ ID N0:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:13的重鏈序列構(gòu)成。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及如下結(jié)合蛋白(例如抗體):其特異性結(jié)合CD154，并且含一個以上的如下重鏈(H)⑶R序列或由一個以上的如下重鏈(H)⑶R序列構(gòu)成，所述序列選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)。在進一步實施方案中，結(jié)合蛋白或抗體含選自⑶R-Hl (SEQ ID N0:42)、⑶R-H2 (SEQ IDNO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)中的至少 2 個 CDR 構(gòu)成。在更進一步實施方案中，結(jié)合蛋白或抗體含所有3個如下CDR H序列或由所有3個如下CDR H序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR_H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:
44)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的結(jié)合蛋白(例如抗體)，其中所述結(jié)合蛋白或抗體含一個以上的如下CDR輕鏈(L)序列或由一個以上的如下CDR輕鏈(L)序列構(gòu)成，所述序列選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR_L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3(SEQ ID N0:47)。在進一步實施方案中，結(jié)合蛋白或抗體含選自CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:47)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Ll(SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:47)中的至少 2 個 CDR構(gòu)成。在更進一步實施方案中，結(jié)合蛋白或抗體含所有3個如下CDR L序列或由所有3個如下 CDR L 序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和CDR-L3 (SEQ ID NO:47)。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體分別含如下互補序列，所述互補序列含上述⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中一個以上的輕鏈⑶R，或由上述⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中一個以上的輕鏈⑶R構(gòu)成；或如下互補序列，所述互補序列含上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一個以上的重鏈CDR，或由上述CDR-H1、CDR_H2和CDR-H3中一個以上的重鏈⑶R構(gòu)成。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白或抗體含⑶R-Hl(SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID NO:43)或 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)和 CDR-Ll (SEQ IDNO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)或 CDR-L3 (SEQ ID NO: 47)，或由 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID NO:43)或 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)和 CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)或 CDR-L3 (SEQ ID NO:47)構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其中結(jié)合蛋白或抗體含如下3個⑶R L序列或由如下3個⑶R L序列構(gòu)成KDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和CDR-L3 (SEQ ID NO:47)，并且其中結(jié)合蛋白或抗體進一步含如下 3 個 CDR H 序列或由如下 3 個 CDR H 序列構(gòu)成:CDR_H1 (SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)。在進一步實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白(例如抗體):其特異性結(jié)合CD154，并且含SEQ ID NO:54的可變輕鏈(')序列或由SEQ ID NO:54的可變輕鏈(')序列構(gòu)成。本發(fā)明還涉及⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體，其含SEQ ID NO:56的可變重鏈(Vh)序列或由SEQ ID NO:56的可變重鏈(Vh)序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白或抗CD154抗體可含SEQ ID NO:54的\序列和SEQ ID NO:56的Vh序列，或由SEQ ID NO:54的Vl序列和SEQ ID NO:56的Vh序列構(gòu)成。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合⑶154的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體含一個以上的如下重鏈(H)⑶R序列或由一個以上的如下重鏈(H)⑶R序列構(gòu)成，所述序列選自⑶R-HKSEQ ID NO:48)、⑶R-H2(SEQ ID NO:49)和CDR-H3 (SEQ ID NO:50)。在進一步實施方案中，CD154結(jié)合蛋白或抗CD 154 抗體含選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ IDNO:50)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Hl (SEQ ID NO: 48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和⑶R-H3 (SEQ ID NO:50)中的至少2個⑶R構(gòu)成。在更進一步實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體含所有3個如下⑶R H序列或由所有3個如下⑶R H序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:50)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD 154蛋白的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體含一個以上的如下⑶R輕鏈(L)序列或由一個以上的如下CDR輕鏈(L)序列構(gòu)成，所述序列選自CDR-LKSEQ ID NO:51)、CDR_L2(SEQ ID NO:52)和CDR-L3 (SEQ ID NO:53)。在進一步實施方案中，CD154結(jié)合蛋白或抗CD154 抗體含選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ IDNO:53)中的至少 2 個 CDR，或由選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR_L2 (SEQ ID N0:52)和⑶R-L3 (SEQ ID NO:53)中的至少2個⑶R構(gòu)成。在更進一步實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體含所有3個如下⑶R L序列或由所有3個如下⑶R L序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)含如下互補序列，所述互補序列分別含上述⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中一個以上的輕鏈⑶R，或由上述⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中一個以上的輕鏈⑶R構(gòu)成；或如下互補序列，所述互補序列分別含上述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中一個以上的重鏈CDR，或由上述CDR-H1、CDR-H2和⑶R-H3中一個以上的重鏈⑶R構(gòu)成。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體含選自⑶R-Hl(SEQ ID NO:48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:50)的 CDR H，或選自CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)的 CDR L，或者由選自 CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR_H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:50)的CDR H，或選自 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)的CDR L構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明提供⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其中所述⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體含所有3個如下⑶R L序列或由所有3個如下⑶R L序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR_L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)，并且其中結(jié)合蛋白(例如抗體)進一步含所有3個如下CDR H序列或由所有3個如下CDR H 序列構(gòu)成，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR_H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3(SEQ ID NO:50)。在進一步實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合⑶154的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)，其中所述CD154結(jié)合蛋白或抗CD154抗體含SEQ ID NO:58的'序列或由SEQID NO:58的Vl序列構(gòu)成。在另外的實施方案中，抗體含SEQ ID NO:60的Vh序列或由SEQID NO:60的乂11序列構(gòu)成。在進一步實施方案中，抗體含SEQ ID NO:60的Vh序列和SEQ IDNO:58的Vl序列，或由SEQ ID NO:60的Vh序列和SEQ ID NO:58的Vl序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:62的輕鏈序列和SEQID N0:65的重鏈序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:63的輕鏈序列和SEQ IDNO:66的重鏈序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:68的輕鏈序列和SEQID N0:71的重鏈序列。在 其他實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:69的輕鏈序列和SEQ IDNO:72的重鏈序列。在其他實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白含SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72 中的至少一個序列。SEQ ID NO:3 — 8的⑶R序列源自大鼠單克隆抗體342。在本發(fā)明的一個備選實施方案中，抗CD154抗體是含SEQ ID NO:29的Vh結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO:30的八結(jié)構(gòu)域序列的大鼠342抗體。本發(fā)明還提供分離的、重組的或合成的DNA分子，其含選自SEQID NO:31和SEQ ID NO:32中的至少一個序列，或由選自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中的至少一個序列構(gòu)成。另外提供含選自SEQ ID N0:33和SEQ ID NO:34中的至少一個序列的載體。本發(fā)明還提供⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其與本文公開的任一個抗CD154抗體(例如，342、381和338抗體及其表位結(jié)合序列)選擇性結(jié)合相同表位。尤其是如本文所述當(dāng)在與抗CD154抗體5c8的競爭測定法中用作第一抗體或第二抗體時，本發(fā)明的抗體342和338顯示出相似的⑶154結(jié)合性質(zhì)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供如下⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體，其與如下人源化抗體結(jié)合相同表位，所述人源化抗體含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的重鏈序列，并且含SEQ ID NO:15的輕鏈序列(342Fab和Fab’片段)，并且如本文所述當(dāng)在與抗CD154抗體5c8的競爭測定法中用作第一抗體或第二抗體時，其顯示出相似的CD154結(jié)合性質(zhì)。在其他實施方案中，本發(fā)明提供如下CD154結(jié)合蛋白和抗CD154抗體，其與如下人源化抗體結(jié)合相同表位，所述人源化抗體含SEQ ID NO:58的Vl結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO:60的Vh結(jié)構(gòu)域序列(338抗體可變序列)，并且如本文所述在與抗CD154抗體5c8的競爭測定法中顯示出相似的CD154結(jié)合性質(zhì)。在涉及本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白的任何上述實施方案中，結(jié)合蛋白可經(jīng)PEG化。在CD 154結(jié)合蛋白是抗CD154抗體、抗體多肽或其片段或衍生物的實施方案中，其中抗體可在重鏈、輕鏈或兩條鏈上經(jīng)PEG化。

本發(fā)明還提供分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自SEQ ID NO:16、SEQID NO:17, SEQ ID N0:18 和 SEQ ID NO:25 中的至少一個序列，或由選自 SEQ ID NO:16,SEQ ID NO: 17, SEQ ID N0:18 和 SEQ ID NO:25 中的至少一個序列構(gòu)成。在某些實施方案中，本發(fā)明還提供分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自 SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70 和 SEQ ID NO:73 中的至少一個序列，或由選自 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73中的至少一個序列構(gòu)成。在其他實施方案中，本發(fā)明提供分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自SEQ ID N0:28 和 SEQ ID NO:41 中的至少一個序列，或由選自 SEQ ID N0:28 和 SEQ ID NO:41中的至少一個序列構(gòu)成。本發(fā)明還提供含本發(fā)明的分離的、重組的和/或合成的DNA分子中的任一種的載體。在一個實施方案中，載體含選自 SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:41中的至少一個序列。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57中的至少一個序列，或由選自SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:57中的至少一個序列構(gòu)成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供分離的、重組的和/或合成的 DNA 分子，其含 SEQ ID NO:55 和 SEQ ID NO:57，或由 SEQ IDNO:55 和 SEQ ID NO:57 構(gòu)成。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61中的至少一個序列，或由選自SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:61中的至少一個序列構(gòu)成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供分離的、重組的和/或合成的 DNA 分子，其含 SEQ ID N0:59 和 SEQ ID N0:61，或由 SEQ ID N0:59 和 SEQ ID NO:61 構(gòu)成。如本文其他處所述，在本發(fā)明涉及含參與效應(yīng)子功能的序列的CD154結(jié)合蛋白和抗CD 154抗體的任何實施方案中，所述結(jié)合蛋白或抗CD 154抗體可另外經(jīng)選擇或改造，以引發(fā)與具有Fe區(qū)的抗CD154抗體相比減少的效應(yīng)子功能。例如，可在本發(fā)明中選用如下CD154結(jié)合蛋白和抗CD154抗體:其無Fe區(qū)或恒定區(qū)序列，或缺乏功能Fe區(qū)或恒定區(qū)序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體對于與⑶154結(jié)合是單價的，并且優(yōu)選當(dāng)施用于受試者時，相對于可比較的CD154結(jié)合蛋白(例如二價抗CD 154抗體)，引發(fā)減少的效應(yīng)子功能。在某些其他實施方案中 ，如果Fe或恒定區(qū)序列存在于CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)多肽中時，則可對所述Fe或恒定區(qū)序列進行選擇或改造，以含一種以上的修飾(例如，氨基酸置換、插入、加合或缺失)，相對于含天然、親本或未經(jīng)修飾的Fe或恒定區(qū)序列的對照抗CD154抗體，所述修飾減少或消除一種以上的效應(yīng)子功能。在本發(fā)明的一些實施方案中，F(xiàn)e區(qū)(當(dāng)存在時)是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fe區(qū)，或者源自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施方案中，可使用嫁接(hybrid)Fe區(qū)，即IgGl/IgG4嫁接Fe序列。在具體實施方案中，F(xiàn)e區(qū)含IgG4Fc序列或源自IgG4抗體。應(yīng)知可根據(jù)本發(fā)明在減少一種以上的效應(yīng)子功能的不同F(xiàn)e區(qū)之間使用任意嫁接組合。如本文進一步描述，在某些其他實施方案中，抗體的Fe部分的糖基化經(jīng)減少或消除，或抗體的糖基化特征被改變。在某些實施方案中，CD 154結(jié)合蛋白或抗CD 154抗體多肽含具有Fe區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域，所述Fe區(qū)具有在保守的N聯(lián)糖基化位點處或附近修飾。在保守的N聯(lián)糖基化位點處的修飾可含在重鏈糖基化位點中或附近的突變，其中突變減少、改變或阻止在該位點處的糖基化，在進一步實施方案中，修飾含突變N298Q(使用EU Kabat編號的N297)。在某些實施方案中，修飾含Ch2結(jié)構(gòu)域聚糖或其部分的去除。在某些備選實施方案中，修飾阻止在糖基化位點處的成熟N-聚糖的形成。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其含選自SEQ ID NO:5、44和50的重鏈⑶R3序列，和變體Fe區(qū)，所述變體Fe區(qū)含第一個氨基酸殘基和N糖基化位點，所述第一個氨基酸殘基經(jīng)側(cè)鏈化學(xué)作用或氨基酸置換修飾，以達到與未經(jīng)修飾的第一個氨基酸殘基相比增加的空間位阻或增加的靜電電荷，從而減少在N糖基化位點處的糖基化水平或以其他方式改變在N糖基化位點處的糖基化。在某些這些實施方案中，與對照、非變體Fe區(qū)相比，變體Fe區(qū)賦予減少的效應(yīng)子功能。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，其含選自SEQ ID NO:5、44和50的重鏈⑶R3序列，和變體Fe區(qū)，所述變體Fe區(qū)含第一個氨基酸殘基和N糖基化位點，所述第一個氨基酸殘基含半胱氨酸硫醇，從而減少在N糖基化位點處的糖基化水平或改變在N糖基化位點處的糖基化，其中變體Fe區(qū)賦予減少的效應(yīng)子功能。在某些實施方案中，上述含變體Fe區(qū)的抗⑶154抗體的第一個氨基酸殘基和N糖基化位點在N聯(lián)糖基化基序附近或其內(nèi)。在進一步實施方案中，N聯(lián)糖基化基序含氨基酸序列NXT或NXS。在某些實施方案中，N聯(lián)糖基化基序含氨基酸序列NXT。在某些實施方案中，N糖基化位點位于根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的氨基酸297處。在另外的實施方案中，經(jīng)修飾的第一個氨基酸殘基是根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的氨基酸299。在某些上述實施方案中，由任一種含本文所述結(jié)合蛋白的抗體或抗體片段顯示出的減少的效應(yīng)子功能是與Fe受體(FcR)減少的結(jié)合。在某些實施方案中，F(xiàn)e受體(FcR)選自FcyR1、Fe Y RII和Fe Y RIII，及其一種以上的亞型，例如Fe Y Rlla。在一些實施方案中，F(xiàn)cR結(jié)合減少至少約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、約10倍以上、約15倍以上、約50倍以上、或約100倍以上。在某些實施方案中，如本文所述具有一種以上的減少的效應(yīng)子功能的本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)不與特定效應(yīng)子受體或效應(yīng)子受體亞型結(jié)合。在某些這些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)不與Fe Y RIIa結(jié)合。在某些實施方案中，由本文所述任一種抗體顯示出的減少的效應(yīng)子功能是與補體蛋白減少的結(jié)合。在一些實施方案中，補體蛋白是Clq。在某些實施方案中，與補體蛋白的結(jié)合減少約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、約10倍以上、約15倍以上。在本發(fā)明的進一步實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)含在Fe區(qū)中的一種以上的修飾或變化，是未糖基化的，并且當(dāng)施用于受試者時，引發(fā)一種以上的減少的效應(yīng)子功能。 在某些實施方案中，當(dāng)施用于受試者時，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)引起相比抗CD154抗體5c8的施用更少的血栓栓塞效應(yīng)。在本發(fā)明的某些實施方案中，上述含變體Fe區(qū)的⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體的經(jīng)修飾的第一個氨基酸殘基與功能部分連接。在進一步實施方案中，功能部分是阻斷部分、可檢測部分、診斷部分或治療部分、或其組合。在某些實施方案中，阻斷部分可為例如半胱氨酸加合物、混合的二硫化物、聚乙二醇或聚乙二醇馬來酰亞胺。在某些實施方案中，可檢測部分可為例如熒光部分、發(fā)光部分或同位素部分。使用了診斷部分的實施方案中，診斷部分可能能夠揭示病狀、疾病或病癥的存在。在其他實施方案中，可使用治療部分，例如抗炎劑、抗癌劑、抗神經(jīng)變性劑、對于除CD154外的分子選擇的抗體、或抗感染劑。在本發(fā)明的某些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)含經(jīng)修飾的氨基酸殘基，該修飾允許蛋白或抗體與功能部分的定點綴合，例如用于定點聚乙二醇化。在某些實施方案中，經(jīng)修飾的氨基酸殘基是經(jīng)半胱氨酸或混合的二硫化物加合物修飾的半胱氨酸殘基。因此，在某些實施方案中，CD154結(jié)合蛋白是在經(jīng)修飾的氨基酸殘基(例如在半胱氨酸或賴氨酸殘基)處聚乙二醇化的抗CD154抗體多肽。在某些實施方案中，抗CD154抗體是用PEG-馬來酰亞胺聚乙二醇化的Fab或Fab’片段。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)的核酸，例如DNA序列。本發(fā)明的DNA序列可含例如通過化學(xué)處理產(chǎn)生的合成DNA、cDNA、基因組DNA或其任何組合。本發(fā)明進一步提供含本發(fā)明的一種以上的核酸(例如DNA序列)的克隆或表達載體。在一些實施方案中，本發(fā)明還涉及含上述任何合成的、分離的和/或重組的核酸的載體。本發(fā)明還提供含本發(fā)明的DNA序列或載體的宿主細(xì)胞。在某些方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)的方法，其包括在適合于由宿主細(xì)胞產(chǎn)生CD 154結(jié)合蛋白或抗CD154抗體的條件下，培養(yǎng)含上述任何載體的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，該方法包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收CD154結(jié)合蛋白或抗CD154抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體或核酸經(jīng)可檢測標(biāo)記進行標(biāo)記，所述可檢測標(biāo)記可為放射性同位素、酶、染料或生物素。在某些其他實施方案中，本發(fā)明的抗體與至少一種其他治療劑綴合，所述治療劑可為放射性同位素、放射性核酸、毒素、類毒素、非CD154特異性抗體多肽或片段(S卩，產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體的)、或例如化學(xué)治療劑。在另外其他的實施方案中，本發(fā)明的抗體與可為標(biāo)記部分的顯像劑綴合。標(biāo)記劑可為生物素、熒光或發(fā)光部分、放射性部分、組氨酸標(biāo)簽或肽標(biāo)簽。本發(fā)明還涉及本文所述⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)、以及編碼其的核酸序列的序列變體。本發(fā)明的序列變體優(yōu)選與本發(fā)明的多肽或編碼其的核酸序列享有至少90%、91%、92%、93%或94%同一性。序列變體在氨基酸或核酸水平上更優(yōu)選享有至少95%、96%,97%或98%同一性。序列變體與本發(fā)明的多肽或編碼其的核酸序列最優(yōu)選享有至少99%,99.5%,99.9% 或更多同一性。因此，本發(fā)明提供含如下序列的分離蛋白，所述序列與下述序列具有至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%, 99.9% 或 100% 的同一,性:SEQ ID NO:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43,SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:45,SEQ ID NO: 46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQID NO:71 或 SEQ ID NO:72。在某些實施方案中，本發(fā)明的嵌合、人源化或人抗CD154抗體多肽是例如dAb、Fab、Fab’、scFv、Fv、二硫鍵合的Fv,或含單免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域,例如Vh或\結(jié)構(gòu)域，其對于CD154結(jié)合特異且是單價的。本發(fā)明的某些CD154結(jié)合蛋白(例如嵌合、人源化或人抗CD 154抗體)多肽含本發(fā)明的I個、2個或更多本發(fā)明的CDR和備選的支架或通用構(gòu)架序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白和抗CD 154抗體含選自可變重鏈(Vh)和可變輕鏈(')的單可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供CD154結(jié)合蛋白(例如嵌合、人源化或人抗CD154抗體)多肽，其對于與CD154結(jié)合是單價的，所述CD154與功能部分綴合，相對于缺乏功能部分的相同多肽，所述功能部分增加其體內(nèi)半衰期。在某些實施方案中，功能部分含聚乙二醇或由聚乙二醇構(gòu)成。在某些實施方案中，功能部分含白蛋白分子或由白蛋白分子構(gòu)成，所述白蛋白分子例如人血清白蛋白。因此，本發(fā)明提供PEG連接的CD 154結(jié)合蛋白(例如PEG連接的嵌合、人源化或人抗⑶154抗體)多肽，其與⑶154特異性且單價結(jié)合，并且相對于缺乏連接的聚乙二醇的相同多肽具有增加的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明還提供含本發(fā)明的至少一種⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)的藥物組合物，在一些實施方案中，其可進一步含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可任選地進一步含另外的生物活性劑或治療劑(例如免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物或制劑)；或診斷齊U。在某些實施方案中，組合物含治療有效量的本文所述的聚乙二醇化的、抗CD154Fab’抗體，其具有抗CD154抗體342或338的表位特異性。本發(fā)明進一步提供用于治療或預(yù)防完全或部分由CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的人病狀、病癥、疾病或任何前述的癥狀的方法，該方法包括給有此需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物含本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)，從而使得達到病狀、疾病或病癥的治療或預(yù)防。本發(fā)明還提供用于抑制或預(yù)防完全或部分由⑶40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種以上的免疫、自身免疫或炎癥應(yīng)答，或任何前述的癥狀的方法，該方法包括給有此需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物含本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)，從而使得達到治療或預(yù)防應(yīng)答。在某些實施方案中，該方法用于治療呈現(xiàn)全身性紅斑狼瘡(SLE)的體征或診斷出具有全身性紅斑狼瘡(SLE)的受試者。在其他實施方案中，該方法用于治療呈現(xiàn)類風(fēng)濕性病狀的體征或診斷出具有類風(fēng)濕性病狀的受試者，所述類風(fēng)濕性病狀例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。本發(fā)明提供對于與CD154結(jié)合單價的人抗體多肽。在某些實施方案中，對于與CD154結(jié)合單價的人抗體多肽，當(dāng)基于其結(jié)合親和力以用于CD154結(jié)合的飽和濃度存在或超過用于⑶154結(jié)合的飽和濃度存在時，當(dāng)首先加入⑶154中時，能夠阻斷抗體5c8與⑶154的結(jié)合，并且當(dāng)在加入抗體5c8后加入時，取代與⑶154結(jié)合的抗體5c8。在某些實施方案中，人抗體多肽是PEG連接的。在某些實施方案中，人抗體多肽無Fe結(jié)構(gòu)域。在某些上述實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或人抗體多肽不取代與⑶40結(jié)合的⑶154。在某些實施方案中，本發(fā)明提供對于CD154結(jié)合單價的聚乙二醇化的抗CD154Fab’抗體，并且進一 步提供用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或全身性紅斑狼瘡(SLE)中一種以上的癥狀的方法，其包括給有此需要的受試者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物含聚乙二醇化的、抗⑶154Fab’抗體,從而使得達到治療或預(yù)防應(yīng)答。附圖簡述

圖1是顯示抗⑶154抗體342、381和338的互補決定區(qū)(⑶R)的氨基酸序列的表。圖2是顯示大鼠抗⑶154抗體342的Vh和\結(jié)構(gòu)域的氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列的表。加有下劃線的序列相應(yīng)于編碼前導(dǎo)(即信號)肽的核苷酸序列。圖3是顯示用于產(chǎn)生實施例中的人源化抗CD154抗體的人受體構(gòu)架的氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列的表。圖4是顯示已將342⑶R移植到圖3中所示的構(gòu)架內(nèi)的Vh和'結(jié)構(gòu)域的氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列的表。圖5是顯示抗體342的Vh結(jié)構(gòu)域(VH3gHl和VH4gHl)的氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列的表，其中342CDR已被移植到人受體構(gòu)架內(nèi)，并且其中某些關(guān)鍵供體殘基被保留。
圖6是顯示抗體342的Vl結(jié)構(gòu)域(VKlgL4)的氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列的表，其中342CDR已被移植到人受體構(gòu)架內(nèi)，并且其中某些關(guān)鍵供體殘基被保留。圖7是顯示抗體342的完整輕鏈(可變和恒定輕鏈區(qū))和重鏈區(qū)的序列。相應(yīng)于信號/前導(dǎo)肽的序列加有下劃線。圖8顯示用于制備Fab (SEQ ID N0:28)和Fab’ (SEQ ID N0:41)形式的移植物342gL4gHl的表達插入物的核苷酸序列。信號/前導(dǎo)序列加有下劃線，并且限制位點(用于如實施例2中所述克隆到大腸桿菌(E.coli)表達載體內(nèi))用大寫字母書寫、且以粗體顯示。圖9顯示大鼠342抗⑶154抗體(供體)氨基酸序列的輕鏈和重鏈與在342抗體的人源化中使用的人種系(受體)構(gòu)架的比對。“輕342”是大鼠'結(jié)構(gòu)域序列?！爸?42”是大鼠Vh結(jié)構(gòu)域序列。⑶R殘基以粗體顯示且加有下劃線。顯示了受體構(gòu)架輕((211012;SEQ ID NO:35)和重(1-13-66 ;SEQ ID NO:37 和 1-14-59 ;SEQ ID NO:39)鏈。也顯示了僅移植到人種系受體構(gòu)架的⑶R (VKlgL3、VH3gH7和VH4gH6)。在某些人源化重鏈和輕鏈中，342抗體的供體殘基保留在構(gòu)架區(qū)內(nèi)，并且這些關(guān)鍵供體構(gòu)架殘基以粗斜體顯示且突出顯示。VKlgL4供體內(nèi)容物是R38、Y71和S85。VH3gHl供體內(nèi)容物是V24、M48、G49、T73和V78。VH4gHl供體內(nèi)容物是M48、R71和V78。顯示了輕鏈的SEQ ID NO，從上至下依次是 SEQ ID NO:30 (〃342〃)、SEQ ID NO:35 ("211012")、SEQ ID NO:14 (〃342gL3〃)和 SEQ ID NO:2 ("342gL4")。顯示了關(guān)于重鏈的SEQ ID NO (VH3移植物)，從上至下依次是SEQ ID NO:29 ("342")、SEQ ID NO:37 ("1-13-66")、SEQ ID NO:10 ("342gH7")和 SEQ ID NO:1("342gHl")。顯示了重鏈的SEQ ID NO (VH4移植物)，從上至下依次是SEQ ID NO:29 (〃342〃)、SEQ ID NO:39 (〃1_14_59〃)、SEQ ID NO:9 的變體(〃VH4gH6〃)和 SEQ ID NO:11 的變體("VH4gHl")。顯示于圖9中的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11變體始于氨基酸〃E〃(代替分別如在圖4和5中的〃Q")，用于在大腸桿菌中表達。因此，相應(yīng)于這些變體SEQ ID N0:9和11的核苷酸序列不同于SEQ ID N0:19和SEQ ID NO:21中所示的核苷酸序列，因為它們始于核苷酸"g"而不是"C"。圖10顯示抗⑶154抗體381的\和Vh氨基酸以及相應(yīng)核苷酸序列。⑶R氨基酸序列加有下劃線。圖11顯示抗⑶154抗體338的\和Vh氨基酸以及相應(yīng)核苷酸序列。⑶R氨基酸序列加有下劃線。圖12是列出通過選擇淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM)分離的大鼠抗人⑶154抗體的表。該表顯示用這些抗體在Biacore 、⑶40結(jié)合測定法和icam-1上調(diào)測定法中獲得的Kd和IC5tl值。用抗體342獲得的數(shù)據(jù)是突出顯示的。圖13顯示無糖基化抗⑶154抗體hu5c8 (hu5c8 aglyP_huIgG4)的κ輕鏈氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列。圖14顯不無糖基化抗⑶154抗體hu5c8 (hu5c8 aglyP_huIgG4)的重鏈氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列。為賦予變體無糖基化(在Kabat EU命名法中的S228P/T299A;殘基226和297 )進行的突變在成熟蛋白序列中顯不為有下劃線和粗體的。圖15顯示無糖基化抗CD154抗體hu342 (hu342 aglyP_huIgG4)的κ輕鏈氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列。圖16顯示無糖基化抗CD154抗體hu342 (hu342 aglyP_huIgG4)的重鏈氨基酸和相應(yīng)核苷酸序列。為賦予變體無糖基化(在Kabat EU命名法中的S228P/T299A;殘基226和297 )進行的突變在成熟蛋白序列中顯不為有下劃線和粗體的。圖17顯示了示例性Fab’片段和顯示抗⑶154抗體的Fab’片段的位點特異性PEG化的凝膠。通過使PEG-馬來酰亞胺與在鉸鏈處的單個半胱氨酸殘基反應(yīng)而將Fab’聚乙二醇化。圖18是顯示人源化342gL4gHl抗體(包括Fab’片段和抗體-PEG綴合物)的不同實施方案，在Biacore 、⑶40結(jié)合測定法、I cam-1上調(diào)測定法和⑶40L競爭結(jié)合測定法中獲得的Kd和IC5tl值的表。圖19顯示在接受鹽水對照或各種劑量的抗⑶154抗體的食蟹猴中作為時間函數(shù)的抗TT (破傷風(fēng)類毒素)IgG滴度值的2個坐標(biāo)圖。上坐標(biāo)圖顯示在抗體處理和TT攻擊(初次免疫應(yīng)答)后第O — 20天的IgG滴度值，而下坐標(biāo)圖顯示在抗體處理后和在第30天時的第二次TT攻擊后第30 - 50天的值。圖20是在接受單劑量(hu5c8、無糖基化5c8和無糖基化34220為mg/kg，而342Fab’ -PEG和342DFM-PEG為40mg/kg)的各種形式的抗CD154抗體的食蟹猴中作為時間函數(shù)的抗TT (破傷風(fēng)類毒素)IgG滴度值的坐標(biāo)圖。DFM-PEG是其中2個Fab’片段由PEG化的二馬來酰亞胺橋交聯(lián)的抗體片段。圖21是在接受鹽水對照或各種劑量的抗CD154抗體的食蟹猴中作為時間函數(shù)的抗TT (破傷風(fēng)類毒素)IgG滴度值的坐標(biāo)圖。該坐標(biāo)圖顯示在用TT攻擊(初次免疫應(yīng)答)后第O — 20天的IgM滴度值。圖22是比較342Fab ’ -PEG抗體和hu5c8抗體在食蟹猴中的藥代動力學(xué)的坐標(biāo)圖。圖23顯示經(jīng)標(biāo)記的342Fab’與表達CD154的Dl.1Jurkat細(xì)胞結(jié)合的交叉阻斷的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，所述Dl.1Jurkat細(xì)胞與未標(biāo)記的第一種抗⑶154Fab’預(yù)結(jié)合,如每個小圖(23A — A33 ；23B — 338 ；23C — 402 ；23D — 381 ；23E — 300 ；23F — 294 ；23G — 335 ；23H - 303)中顯示(參見實施例9)。A33是同種型匹配的對照抗體且確認(rèn)不存在非特異性交叉阻斷。圖24顯示經(jīng)標(biāo)記的Hu5c8Fab’與表達CD154的Dl.1Jurkat細(xì)胞的交叉阻斷的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)構(gòu)，所述Dl.1Jurkat細(xì)胞與未標(biāo)記的第一種抗⑶154Fab’預(yù)先結(jié)合,如每個小圖(24A — 338 ；24B — 402 ；24C — 381 ；24D — 303 ；24E — 335 ；24F — 300 ；24G — 294 ；24H - A33)中顯示(參見實施例9)。A33是同種型匹配的對照抗體且確認(rèn)不存在非特異性交叉阻斷。圖25A —F顯示各種形式的342和Hu5c8抗體與可溶性⑶154蛋白(ECT)或⑶40:⑶154復(fù)合物的競爭結(jié)合的Biacore⑧分析結(jié)果。FL-全長。⑶40hFc -人⑶40融
合蛋白。圖26是顯示實施例11中所述用Hu5c8抗CD154抗體、342Fab’ -PEG抗CD154抗體和對照抗體進行的血小板凝集測定法(測定法I)結(jié)果的坐標(biāo)圖。第一個小圖顯示用由完整IgG形成的⑶40L復(fù)合物獲得的結(jié)果，而第二個小圖顯示用Fab’ -PEG或二 Fab’ -PEG形成的復(fù)合物。第三個小圖顯示用三Fab’-PEG和無糖基化抗⑶154抗體hu342獲得的結(jié)
果O圖27是顯示實施例11中所述用陽性和陰性對照抗體進行的血小板凝集測定法(測定法2)結(jié)果的坐標(biāo)圖。結(jié)果證實血小板凝集通過陽性對照抗⑶154抗體和重組人可溶性⑶40L (s⑶154)的復(fù)合物特異性增強。圖28顯示人和小鼠可溶性⑶40L氨基酸序列的序列比對。人和小鼠序列之間的差異以紅色指出。Hu5c8表位序列以藍色指出。內(nèi)部殘基用〃 |〃標(biāo)記。選擇將人殘基引入可溶性小鼠⑶40L內(nèi)的序列的6個區(qū)域(I 一 6)。圖29顯示競爭ELISA測定法 結(jié)果，以證實342Fab’和hu5c8Fab’的交叉阻斷(參見實施例14)。圖29A顯示生物素342Fab’在⑶154上的滴定結(jié)果。InM濃度在曲線的線性部分上。圖29B顯示生物素hu5c8Fab’在⑶154上的滴定結(jié)果。0.3nM濃度在曲線的線性部分上。圖29C顯示生物素342和生物素5c8由未標(biāo)記的342Fab’的交叉阻斷。ch342Fab是嵌合342Fab’。圖29D顯示生物素342由未標(biāo)記的5c8Fab’的交叉阻斷。發(fā)明詳述為了可更充分理解本文所述本發(fā)明，提供以下詳述。除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。以下描述示例性方法和材料，盡管與本文所述方法和材料相似或等價的方法和材料也可在本發(fā)明的實踐中使用，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本申請自始至終，提及各種專利、出版物和參考文獻。這些專利、出版物和參考文獻的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的闡述重組DNA技術(shù)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻著作包括 Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York(1998and Supplements to2001) ；Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, NewYork(1989) ；Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Cellular MethodsIn Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995) ；McPherson, Ed., DirectedMutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford(1991)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的闡述免疫學(xué)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻著作包括:Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1999);和 Roitt et al., Immunology, 3dEd., Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的闡述醫(yī)學(xué)生理學(xué)和藥理學(xué)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻著作包括:Fauci et al.，Eds.，Harrison’ sPrinciples Of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-Hi11 Companies, Inc.(1998)。定義本文所述術(shù)語“⑶154結(jié)合蛋白”包括與⑶154特異性結(jié)合或拮抗⑶154的任何分子(包括抗體)。因此，本文所述抗CD154抗體是一類CD154特異性結(jié)合蛋白。本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白可含如本文公開的至少I個、優(yōu)選2個、3個或更多⑶R。⑶154結(jié)合蛋白或其他此CD154拮抗劑可含并非常規(guī)抗體片段或衍生物，但含賦予CD154表位結(jié)合特異性的氨基酸序列和/或化學(xué)結(jié)構(gòu)的種類。此CD154拮抗劑可例如由備選支架制成(參見例如，Binz et al., 2005Nat Biotech23:1257_1268 和 Hosse et al., 2006Protein Sciencel5:14-27)。此⑶154結(jié)合蛋白或拮抗劑可與功能上缺陷的抗體Fe區(qū)或與如本文所述異源功能部分融合，以改善CD154結(jié)合蛋白的半衰期和/或其他體內(nèi)性質(zhì)。⑶154結(jié)合蛋白可含摻入生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)內(nèi)的本文所述至少一個⑶R。在一個例子中，生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)含足以形成構(gòu)象上穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支持物、或構(gòu)架、或支架的多肽或其部分，其能夠顯示與局限性表面區(qū)域中的抗原(例如，CDR、可變結(jié)構(gòu)域等)結(jié)合的氨基酸的一種以上的序列。此結(jié)構(gòu)可為天然存在的多肽或多肽“折疊”(結(jié)構(gòu)基序)，或可相對于天然存在的多肽或折疊具有一種以上的修飾，(例如氨基酸添加、刪除或置換)。這些支架可源自任何物種(或超過一個物種)(例如人、其他哺乳動物、其他脊椎動物、無脊椎動物、植物、細(xì)菌或病毒)的多肽。一般情況下，生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)基于除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域外的蛋白支架或骨架。例如，可使用基于纖連蛋白、錨蛋白、脂質(zhì)運載蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、細(xì)胞色素b、CPl鋅指、PSTl、卷曲螺旋、LAC1-Dl、Z結(jié)構(gòu)域和tendramisat結(jié)構(gòu)域的生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)(參見例如，Nygren和Uhlen, 1997,Current Opinion in Structural Biology,7,463-469)o如本文就本發(fā)明而言所使用的術(shù)語“抗體”包括分離的、重組的或合成的抗體、抗體綴合物或抗體衍生物。術(shù)語“抗體”通常意欲包括抗體片段(包括抗原結(jié)合片段)，除非上下文另有說明或理解?？乖Y(jié)合片段與完整抗體競爭特異性結(jié)合。一般參見，F(xiàn)undamentalImmunology,第 7 章(Paul, W.,編輯，第 2 版.Raven Press, N.Y.(1989))?？乖Y(jié)合片段可通過重組DNA技術(shù)或者通過完整抗體的酶促或化學(xué)切割來產(chǎn)生。在一些實施方案中，抗原結(jié)合片段包括 Fab、F (ab)2、Fab’、F (ab，)2、F (ab’)3、Fd、Fv、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、其他單價和二價片段、互補決定區(qū)(⑶R)片段、單鏈抗體(例如scFv、scFab和scFabAC)、嵌合抗體、雙抗體、三抗體、小型抗體、納米抗體、和含足以賦予與多肽特異性抗原結(jié)合的至少部分抗體的多肽；以及前述的融合物和衍生物。參見例如，Holliger和Hudson, NatureBiotechnology23:1126-1136 (2005)和 Hust et al., BMC Biotech7:14 (2007)?！癋d片段”是由Vh和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體片段；“Fv片段”由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；“scFv片段”是含通過肽接頭連接的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')的單鏈抗體；“scFab片段”是含難以通過肽接頭與輕鏈連接的片段(Fd)的單鏈抗體；“scFabAC”片段是無半胱氨酸的scFab變體(參見例如上述Hust等人的文章)； Ρ "dAb片段”(單結(jié)構(gòu)域抗體)含單個可變結(jié)構(gòu)域(例如Vh或Vl結(jié)構(gòu)域)(Ward et al.，Nature341:544_546(1989))。此外，還包括了雙抗體和三抗體。本發(fā)明的雙抗體和三抗體包括例如同二聚和異二聚的雙抗體以及三抗體。例如，在某些實施方案中，構(gòu)成三抗體的可變結(jié)構(gòu)域可與3個不同表位或相同表位結(jié)合。除非上下文另有說明或另有提示，本發(fā)明的“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段、抗體衍生物或可含一種以上的修飾(例如，氨基酸插入、刪除、置換、翻譯后修飾或其缺失等)的變體，包括抗體綴合物(g卩，與功能部分綴合或結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段)?？贵w衍生物(包括抗體綴合物)可基于本發(fā)明的抗原結(jié)合片段或可含本發(fā)明的抗原結(jié)合片段，所述本發(fā)明的抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合CD154。此外，上述抗體實施方案可為鼠類、倉鼠、山羊、兔、嵌合、人源化、或全人抗體、片段、衍生物或綴合物。應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的某些方面，術(shù)語“抗體”可排除上述一個以上的抗體實施方案；此條件對于技術(shù)人員將是顯而易見的。術(shù)語“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括聚亞烷基二醇化合物或其衍生物，連同或不連同偶聯(lián)劑或者用偶聯(lián)或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸鹽(triflate)、三氟乙磺酸鹽(tresylate)、氮丙唳、環(huán)氧乙燒,或優(yōu)選用馬來酰亞胺部分(例如PEG-馬來酰亞胺))的衍生化。其他合適的聚亞烷基二醇化合物包括但不限于，馬來酰亞胺單甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇、以及下述類型的帶電或中性聚合物:右旋糖、多聚乙酰神經(jīng)氨酸、或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、以及生物素和其他親和劑衍生物。術(shù)語“效應(yīng)子功能”指抗體的Fe或恒定區(qū)與蛋白和/或免疫系統(tǒng)的細(xì)胞結(jié)合的功能性能力。具有減少的效應(yīng)子功能的抗體和用于改造此抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，W005/18572、W005/03175和US6，242，195)，并且在本文中進一步詳細(xì)描述。一般的效應(yīng)子功能包括結(jié)合補體蛋白(例如，補體蛋白Clq)和/或Fe受體(FcR)(例如，F(xiàn)e Y R1.Fc Y RI1.Fc y RIIa,Fe y RIII和/或FcyRII Ib)的能力。能夠與一種以上上述分子結(jié)合的功能結(jié)果包括但不限于，調(diào)理作用、噬菌作用、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和/或效應(yīng)子細(xì)胞調(diào)節(jié)。效應(yīng)子功能減少指至少部分通過Fe與其同源受體結(jié)合或與補體蛋白或效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)的一種以上的生物化學(xué)或細(xì)胞活性減少，同時維持抗體(或其片段)可變區(qū)的抗原結(jié)合活性，即使伴隨減少的、相似的、相同的還是增加的結(jié)合親和力。本發(fā)明的具體抗體顯示出減少的效應(yīng)子功能。效應(yīng)子功能(例如Fe與Fe受體或補體蛋白結(jié)合的減少，可以減少倍數(shù)(例如，減少1.5倍、2倍等)表示，并且可基于例如使用本領(lǐng)域已知的結(jié)合測定法測定的結(jié)合活性的減少百分比進行計算(參見例如，WO05/18572)。除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。本說明書和權(quán)利要 求自始至終，單詞“含”應(yīng)當(dāng)理解為默認(rèn)包括所言整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)組。CD 154⑶154在本領(lǐng)域中通過幾種其他名稱已知，例如⑶40配體(⑶40L)、⑶40反受體(CD40CR)、gp39、T-BAM、T細(xì)胞活化分子、TRAF, TNF相關(guān)活化蛋白(TRAP)、和腫瘤壞死因子配體超家族成員(TNFSF5) (Gauchat et al., 1993FEBS Lett.315:259-266 ；Grafet al.，1992，Europ.J.1mmun.22:3191_3194 ；Hollenbaugh et al.，1992EMB0 J.11:4313-4321)。這些術(shù)語在本申請自始至終可互換使用。本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(包括抗體)與人CD154特異性結(jié)合，并且可與其他物種的CD154交叉反應(yīng)且因此特異性結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(包括抗體)與人CD154、小鼠CD154或非人靈長類⑶154特異性結(jié)合。杭⑶154杭體和⑶154結(jié)合蛋白本文所述術(shù)語“抗CD154抗體”指能夠與CD154抗原上的表位特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。抗⑶154抗體可為源自天然來源或重組來源的完整免疫球蛋白，并且可為完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。抗體一般是免疫球蛋白分子的四聚體。因此，本發(fā)明的所有實施方案和方法中所述“抗CD154抗體”含(除非上下文另有說明或另有提示)單克隆抗體、多克隆抗體、鼠類抗體、倉鼠抗體、山羊抗體、兔抗體、嵌合抗體、靈長類源化抗體、人源化抗體、(全)人抗體、多聚抗體、異二聚抗體、半二聚抗體、二價、三價或四價抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體(例如，scFv、scFab和scFab Δ C))、二-scFv、雙抗體、三抗體或四抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、和經(jīng)修飾的Fab片段。在某些實施方案中，抗CD154抗體是僅含單個可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體。因此，單價抗體包括僅含一個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(即，單個輕或重可變鏈)且與CD154特異性結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明的抗⑶154抗體對于⑶154可為單價、二價或多價的。在某些實施方案中，具有減少的效應(yīng)子功能的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)含抗CD154抗體的任何部分，其足以維持與CD154抗原的特異性結(jié)合。例如，抗體可僅含單個可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域-Vh或'結(jié)構(gòu)域。因此，在某些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)是抗體片段?？贵w片段包括例如Fab片段、F (ab)2片段、Fab’片段、F (ab’)2片段、F (ab’)3片段、單鏈F (V)片段或F (V)片段及任何上述的表位結(jié)合片段(參見例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23 (9):1126_1136)。本發(fā)明的抗體片段在下文有更詳細(xì)描述。在一個例子中，⑶154結(jié)合蛋白或抗⑶154抗體是具有天然或經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)的抗體(例如，IgG4亞型的抗體)或片段(例如，F(xiàn)ab’片段)。許多經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)已得到描述，例如在US5，677，425、W099/15549和W098/25971中。在另一個例子中，本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)被修飾，如W005/003169、W005/003170和W005/003171中所述那些抗體。任何上述抗CD154抗體、抗體衍生物或抗體片段可用于形成本發(fā)明的抗體綴合物。任何上述抗體、片段和衍生物可引發(fā)與第二種抗CD154抗體相比減少的效應(yīng)子功能。本發(fā)明的抗體分子可為免疫球蛋白分子的任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類?？筛鶕?jù)所推薦的抗體分子功能選擇抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(如果存在)。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可為人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結(jié)構(gòu)域。尤其可使用人IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，特別是IgGl、IgG2、 IgG3和IgG4。IgG2和IgG4同種型可在某些實施方案中使用，其中抗體分子預(yù)期用于需要減少或消除抗體效應(yīng)子功能的治療用途。而當(dāng)抗體分子預(yù)期用于需要抗體效應(yīng)子功能的治療用途時，還可使用IgGl和IgG3同種型。在一些實施方案中，可將本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗體)的一個以上的CDR摻入一個以上的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、通用構(gòu)架、蛋白支架或者基于除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域外的蛋白支架或骨架的其他生物相容性構(gòu)架結(jié)構(gòu)內(nèi)(Nygren&Uhl6n, 1997，Curr.0pin.Strural Biol.7:463-469;Saragovi et al, 1992, Bio/TechnologylO:773-779;Skerra, 200O, J.Mol.Recognitionl3:167-187)。在某些實施方案中，將抗CD154抗體的CDR摻入通用構(gòu)架(即，可用于產(chǎn)生最初由不同構(gòu)架的大集合維持的功能、特異性或性質(zhì)的完全變異性的構(gòu)架，參見U.S.6，300，064)。在其他實施方案中，備選支架(參見例如，Binz et al., 2005NatBiotech23:1257-1268 和 Hosse et al., 2006Protein Sciencel5:14_27)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白。術(shù)語“抗⑶154抗體”還含合成抗體或使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的重組抗體，例如由噬菌體表達的抗體。術(shù)語“抗⑶154抗體”還應(yīng)解釋為包括已通過合成編碼抗體的DNA分子或確定抗體的氨基酸序列產(chǎn)生的抗體，所述DNA分子表達抗體蛋白、其中DNA或氨基酸序列已使用本領(lǐng)域可用且眾所周知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供是單克隆抗體的“抗CD154抗體”。單克隆抗體指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即構(gòu)成所述抗體群的單個抗體除可能的可少量存在的天然發(fā)生的突變外是相同的。修飾詞“單克隆”指得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體的特征，并且不解釋為需要通過任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過由Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤(鼠類或人的)方法制備，或可通過重組DNA方法(參見例如，US4, 816，567)制備?！皢慰寺】贵w”也可使用例如Clacksonet al.,Nature, 352:624-628 (1991 ^PMarks et al., J Mol.Biol.，222:581_597 (1991)中所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。還應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的某些實施方案涉及含一種以上的不同單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體特異性結(jié)合CD154，即含具有不同表位特異性的多種單克隆抗體的多克隆抗體組合物。在本發(fā)明的另一實施方案中，“抗CD154抗體”指是嵌合抗體的抗體、或其抗體衍生物或綴合物或抗原結(jié)合片段。嵌合抗體一般包括與另一個物種(一般是人)的恒定區(qū)融合的一個物種(一般是小鼠)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)(包括CDR和構(gòu)架殘基)。這些嵌合小鼠/人抗體含約75%人和2 5%小鼠氨基酸序列。人序列表示抗體的恒定區(qū)，而小鼠序列表示抗體的可變區(qū)(且因此含抗原結(jié)合位點)。在另一實施方案中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白、抗CD154抗體包括含可變結(jié)構(gòu)域的抗體、抗體衍生物和抗原結(jié)合片段，所述可變結(jié)構(gòu)域含來自一種抗體的構(gòu)架區(qū)和來自另一種抗體的⑶R區(qū)。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體包括含來自不同人抗體的構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)嵌合抗體。制備上述所有嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如，US5, 807, 715 ；Morrison et al., (1984)Proc.Natl.Acad.Sci USA81 (21):6851-5 ；Sharonet al., (1984) Nature309 (5966):364_7 ;Takeda et al., (1985) Nature314 (6010):452-4。在本發(fā)明的某些實施方案中，結(jié)合⑶154的抗⑶154抗體通過選擇淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM) (Babcook et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci，93，7843-7848 ；W092/02551 ；de Wildt et al., 1997, J.1mmunol.Methods, 207:61-67 和 Lagerkvist et al.，1995，BioTechniquesl8 =862-869)產(chǎn)生，所述方法使得能夠從任何種類中分離在體內(nèi)免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞。其他技術(shù)包括由de Wildt et al., 1997, J.1mmunol.Methods, 207:61_67 和 Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques 18 (5):862_869 所述的技術(shù)。上述方法依賴單個抗體產(chǎn)生細(xì)胞的分離，所述細(xì)胞隨后進行克隆擴增，隨后篩選產(chǎn)生抗⑶154抗體的克隆，隨后鑒定其可變重(Vh)和輕(')鏈基因的序列。具體篩選方法在W004/051268中詳述。因此，分離對于針對⑶154的抗體是陽性的B細(xì)胞。B細(xì)胞可來自人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、山羊或其他哺乳動物物種?？衫缤ㄟ^常規(guī)重組DNA技術(shù)將這些B細(xì)胞中的抗體基因進行克隆且在宿主細(xì)胞中表達。在某些實施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。其他宿主細(xì)胞將在下文詳述。在這些細(xì)胞中表達的抗體(其包括抗體片段(例如Fab’片段))可通過常規(guī)方法進行純化。如果抗體來自非人來源，則它們可通過常規(guī)方法(例如通過誘變其基因)進行人源化。隨后可在宿主細(xì)胞中表達所述人源化抗體，且對其進行純化。單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行制備，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler &Milstein，Nature, 1975, 256:495_497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozboret al., Immunology Today, 1983,4, 72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，"MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy〃，第 77-96 頁，Alan R.Liss, Inc.,1985)。用于產(chǎn)生和制備重組抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，US4，816，397 ；US6, 331，415 ；Simmonset al., 2002, Journal of Immunological Methods,263,133-147 ；W092/02551 ；0rlandiet al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86, 3833 ；Riechmann et al., 1988, Nature,322，323 ；US5, 585, 089 ；W091/09967 ;Mountain 和 Adair, 1992,Biotechnol Genet.Eng.Rev, 10,1-142 ；Verma et al., 1998, J.1mmunol.Methods, 216:165-181 ;Holliger 和 Hudson, 2005，Nature Biotech.23 (9):1126_1136)。本發(fā)明的抗體也可使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生，包括由下述文獻公開的方法:Brinkman et al., 1995, J.1mmunol.Methods, 182:41_50 ；Ameset al.,1995, J.1mmunol.Methods, 184,177-186 ；Kettleborough et al., 1994, Eur.J.1mmunol, 24,952-958 ；Persic et al.，1997, Gene, 187,9-18 ;和 Burton et al.，1994，Advances in Immunol,57,191-280 ；W090/02809 ；W091/10737 ；W092/01047 ；W092/18619 ；W093/11236 ；W095/15982 ；和 W095/20401 ；和 US5, 698，426 ；5, 223，409 ；5,403，484 ；5，580，717 ；5, 427，908 ；5, 750，753 ；5, 821，047 ；5, 571，698 ；5, 427，908 ；5, 516，637 ；5，780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743 ;和 5，969，108。此外，轉(zhuǎn)基因(例如經(jīng)遺傳改造的)小鼠或其他生物體(包括其他哺乳動物)可用于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合蛋白和抗體(參見例如US6，300, 129)。例如，已知可將把僅小鼠免疫基因座(重鏈V、D和J區(qū)段，以及輕鏈V和J區(qū)段)用相應(yīng)人可變序列替換的經(jīng)可變區(qū)改造的小鼠用于產(chǎn)生大量具有人可變序列的高親和力抗體(參見例如，US6, 586，251 ；US6, 596，541和 US.7，105，348)。在本發(fā)明的另一實施方案中，“抗CD154抗體”指靈長類源化或人源化的抗體、抗體衍生物或綴合物、或抗原結(jié)合片段。靈長類源化和人源化抗體一般包括來自移植到非人靈長類或人的抗體V區(qū)構(gòu)架上 的鼠類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR，通常進一步含人恒定區(qū)。參見例如，Riechmann et al., (1988)Nature332:323_327 ;US6, 054，297 ;5，821，337 ;5，770，196 ;5，766，886 ;5，821，123 ;5，869，619 ;6，180，377 ;6，013，256 ;5，693，761 ；和6，180，370。關(guān)于使用此靈長類源化或人源化抗體的原理是保留由小鼠CDR賦予的小鼠抗體的(人)抗原特異性，但通過使用盡可能多的人構(gòu)架序列減少小鼠抗體的免疫原性(小鼠抗體會在除小鼠外的物種中引起針對其的免疫應(yīng)答)。此抗體可在人治療中用于使不希望有的副作用(例如免疫應(yīng)答)降到最低或消除。已描述了含從抗原特異性非人抗體移植到在人中具有減少的免疫原性的同源非人靈長類受體構(gòu)架上的供體CDR的抗體(US2005/0208625 ；US2002/0062009 ；US7, 338，658)。因此，人源化形式的非人(例如鼠類)抗體是特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其含源自非人免疫球蛋白和人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體抗體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠或兔)CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)非人FR殘基替換。此外，人源化抗體可含不見于受體抗體、也不見于輸入的⑶R或FR序列的殘基。進行這些修飾以進一步改善和優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體可含基本上所有至少I個、和一般2個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有CDR區(qū)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且所有或基本上所有FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的FR殘基。人源化抗體任選還可含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)。人源化抗體(其包括例如抗體片段和抗體衍生物或綴合物)可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，其中將對于抗原結(jié)合不需要的人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的一些或全部氨基酸(例如，可變結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū))用于代替來自同源抗體、非人抗體的輕鏈或重鏈的相應(yīng)氨基酸。用于制備人源化抗體的方法是抗體領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如，EP239400;Jones et al., (1986) Nature321:522-525 ；Riechmann et al., (1988) Nature332:323-327 ；Verhoeyen et al., (1988)Science239:1534-1536 ;Queen et al., (1989)Proc.Nat.Acad.Sci USA86:10029 ；Orlandi et al., (1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA86:3833 ；US6, 180, 370和EP519596，其描述了表面殘基的抗體飾面(veneering)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，抗⑶154抗體指人源化抗體(其包括但不限于人源化抗原結(jié)合片段和人源化抗體衍生物或綴合物)，其通過將鼠類或大鼠(或其他非人)⑶R移植到人抗體上來產(chǎn)生。更具體而言,這種人源化如下達到:(I)從分泌抗體的雜交瘤或B細(xì)胞中分離編碼重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的cDNA ; (2)通過測序測定可變結(jié)構(gòu)域(包括OTR)的DNA序列；(3)通過定點誘變將編碼⑶R的DNA轉(zhuǎn)移到人抗體重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼序列的相應(yīng)區(qū)域；和(4)加入所需同種型(例如，對于CH為1，對于CL為k)的人恒定區(qū)基因區(qū)段。最后，在哺乳動物宿主細(xì)胞(例如，CHO或NSO細(xì)胞)中共表達人源化重鏈和輕鏈基因，以產(chǎn)生可溶性人源化抗體。有時，CDR直接轉(zhuǎn)移至人構(gòu)架導(dǎo)致所產(chǎn)生的結(jié)合蛋白或抗體的抗原結(jié)合親和力的喪失?？砂l(fā)生抗原結(jié)合親和力的喪失，因為在一些同源抗體中，構(gòu)架區(qū)內(nèi)的某些氨基酸與CDR相互作用，并且因此影響抗體的總體抗原結(jié)合親和力。在此情況下，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在受體抗體的構(gòu)架區(qū)中引入“回復(fù)突變”將是關(guān)鍵的，以便保留同源抗體的抗原結(jié)合活性。制備回復(fù)突變的一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如，Queen et al.，
(1989) Proc.Nat.Acad.Sci USA86: 10029 ；Co et al., 1991.Proc.Nat.Acad.Sci USA88:2869-2873 ；W090/07861 ；Tempestl991.Biotechnology9:266_271。本發(fā)明抗體的示例性回復(fù)突變包括在圖9中供體內(nèi)容下所示殘基。在某些實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白或抗體可含非駱駝科或鼠類免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的Vh結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，抗體多肽可含如下Vh結(jié)構(gòu)域，與人Vh結(jié)構(gòu)域相t匕，其不含對駱駝科免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域特異的一種以上的氨基酸。 在本發(fā)明的一個實施方案中，“抗CD154抗體”指全人的抗體(其包括抗原結(jié)合片段和抗體衍生物或綴合物)。全“人”抗體含具有源自人免疫球蛋白的序列(例如，得自人免疫球蛋白編碼序列)的抗體多肽或免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“人抗體”包括例如具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)的抗體。本文中將術(shù)語“人”應(yīng)用于抗體或片段(例如可變結(jié)構(gòu)域)時，不含已通過將人恒定區(qū)序列移植到抗體多肽(即，用人恒定區(qū)替換非人恒定區(qū))或通過將人V區(qū)構(gòu)架序列移植到來自非人哺乳動物的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(即用人構(gòu)架區(qū)替換V結(jié)構(gòu)域的非人構(gòu)架區(qū))而“人源化”的來自另一個物種(例如小鼠)的抗體。已描述了通過互補決定殘基的合理修飾使免疫球蛋白可變區(qū)人源化的方法(US2006/0258852)。在某些實施方案中，人抗體包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或定點誘變或者通過體內(nèi)體突變弓丨入的突變)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及含具有一個以上的構(gòu)架區(qū)(例如FW1、FW2、FW3和/或FW4)的可變結(jié)構(gòu)域的抗CD154抗體，其含與由人種系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或相對于由人種系抗體基因區(qū)段編碼的所述相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列，總共含多達5個氨基酸差異的一個以上的所述構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列。在進一步實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)(FW1、FW2、FW3和FW4)的氨基酸序列與由人種系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列相同，或相對于由人種系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)構(gòu)架區(qū)的序列，F(xiàn)ffUFff2, FW3和FW4的序列總共含多達10個氨基酸差異。示例性種系抗體基因區(qū)段包括例如DP47、DP45、DP48和DPK9 (US2006/0062784)、以及編碼實施例和附圖中所示受體構(gòu)架序列的區(qū)段。在一些實施方案中，人抗體(其包括抗體片段或可變結(jié)構(gòu)域序列)與天然存在的人抗體具有至少85%氨基酸序列同一性(包括例如，87%、90%、93%、95%、97%、99%或更高序列同一性)。全人抗體或人抗體可源自攜帶來自人細(xì)胞的人抗體基因(攜帶可變(V)、多樣性(D)、連接(J)、和恒定(C)外顯子)或人V、D和J區(qū)的轉(zhuǎn)基因(例如經(jīng)遺傳改造的(例如敲Λ (knock-1n)的))小鼠。例如，目前可產(chǎn)生經(jīng)遺傳改造的動物(例如小鼠)，其在無內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下，在免疫接種后能夠產(chǎn)生人抗體全庫(參見例如，Jakobovits etal., PNAS, 90:2551 (1993)； Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermannet al., Year in Immun0., 7:33 (1993);和 Duchosal et al.，Nature355:258 (1992))。可改造轉(zhuǎn)基因(例如經(jīng)遺傳改造(包括敲除、敲入、基因替換等)的)小鼠品系，使其含來自未重排的人免疫球蛋白基因的基因序列。人序列可編碼人抗體的重鏈和輕鏈并且將在小鼠中正確發(fā)揮作用，經(jīng)歷重排以提供類似于在人抗體庫的廣泛抗體庫。經(jīng)遺傳改造的小鼠可用靶蛋白(例如，CD154、其片段、或表達CD154的細(xì)胞)進行免疫接種，以產(chǎn)生特定抗體及其編碼RNA的不同陣列。編碼此抗體的抗體鏈組分的核酸隨后可從動物中克隆到展示載體內(nèi)。一般地，克隆編碼重鏈和輕鏈序列的核酸的分離群，并且隨后將通過將分離的群插入載體內(nèi)而進行重組，從而使得載體的任何給定拷貝接受重鏈和輕鏈的隨機組合。載體設(shè)計為表達抗體鏈，從而使得它們可在含載體的展示包的外表面上裝配和展示。例如，抗體鏈可作為與來自噬菌體的外表面的噬菌體外殼蛋白的融合蛋白進行表達。其后，展示包可就與靶結(jié)合的抗體的展示進行篩選。此外，人抗體可源自卩遼菌體展示文庫(Hoogenboom et al., J.Mol.Biol, 227:381 (1991) ；Marks et al., J.Mol.Biol, 222:581-597 (1991) ；Vaughan et al., NatureBiotechl4:309 (1996)，US6，300，064)。可產(chǎn)生使用合成人抗體V區(qū)的隨機組合的合成噬菌體文庫。通過在抗原上選擇，可制備V區(qū)在性質(zhì)方面非常象人的全人抗體。參見US6, 794，132，6，680，209，4，634，666 和 Ostberg et al.，(1983)，Hybridoma2:361_367。關(guān)于人抗體的產(chǎn)生， 還參見Mendezet al., Nature Geneticsl5:146_156( 1997),Green 和 Jakobovits J.Exp.Med.188:483_495 (1998)。人抗體在 U.S.5，939，598 和6，673，986 中進一步討論和描述。還參見 U.S.6，114，598、6，075，181 和 6，162，963。還參見 US6, 150，584、US6, 713，610、US6, 657，103、US2003/0229905A1、US2004/0010810A1、US2004/0093622A1、US2006/0040363A1、US2005/0054055A1、US2005/0076395A1 和US2005/0287630A1。還參見 EP0463151B1、TO94/02602、TO96/34096 和 TO98/24893。在備選方法中，其他人已利用“小型基因座”方法。在小型基因座方法中，通過包括來自Ig基因座的片段(單個基因)模擬外源Ig基因座。因此，將一種以上的VH基因、一種以上的DH基因、一種以上的JH基因、μ恒定區(qū)和第二個恒定區(qū)(優(yōu)選Y恒定區(qū))形成到構(gòu)建體內(nèi)用于插入動物內(nèi)。這種方法在例如US5, 545，807、5，545，806、5，625，825、5，625，126,5, 633，425,5, 661，016,5, 770，429,5, 789，650,5, 814，318,5, 591，669、5，612，205,5, 721，367,5, 789，215 和 5，643，763 中描述。還參見 US5, 569，825,5, 877，397、6，300，129,5, 874，299,6, 255，458和7，041，871，所述專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。還參見 EP0546073、W092/03918、W092/22645、W092/22647、W092/22670、W093/12227、W094/00569、W094/25585、W096/14436、W097/13852 和 W098/24884。進一步參見 Taylor etal., (1992Nuc.Acids.Res.，20:6287), Chen et al., (1993Int.1mmunol.5:647), Tuaillonet al., (1993PNAS USA.90:3720_4),Choi etal., (1993Nature Genetics4:117),Lonberget al., (1994Nature368:856-859),Taylor et al., (1994International Immunology6:579-591),和 Tuaillon et al., (1995J Immunol.154:6453-65), Fishwild et al.,
(1996Nature Biotechnologyl4:845), and Tuaillon et al., (2000 Eur J Immunol.10:2998-3005)。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，全人抗體使用體外預(yù)處理的人脾細(xì)胞進行制備(Boerner et al., 1991.J.1mmunol.147:86_95)。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，全人抗體通過庫克隆進行制備(Perssonet al., 1991.Proc.Nat.Acad.Sc1.USA88:2432_2436 ；Huang 和 Stollarl991.J.1mmunol.MethodsHl:227-236)。此外，US5， 798，230描述了來自人B細(xì)胞的人單克隆抗體的制備，其中產(chǎn)生人抗體的B細(xì)胞通過用EB病毒或其衍生物感染而永生化，所述衍生物表達EB病毒核抗原2 (“EBNA2”)(永生化所需的蛋白)。隨后關(guān)閉EBNA2功能，導(dǎo)致抗體產(chǎn)生增加。用于產(chǎn)生全人抗體的其他方法涉及使用非人動物，所述動物具有滅活的內(nèi)源Ig基因座，并且是未重排的人抗體重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因動物。可用活化T細(xì)胞或Dl.1蛋白免疫接種此轉(zhuǎn)基因動物(US5，474，771,6, 331，433和6，455，044)，并且可由源自其的B細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤。這些方法的細(xì)節(jié)在本領(lǐng)域得到描述。參見例如，有關(guān)含人Ig小型基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠的各種出版物/專利，包括US5，789，650 ;有關(guān)XENOMOUSE 小鼠的各種出版物 / 專利，包括 US6, 075，181 ;6，150，584 ;和 6，162，963 ；Green, 1997，NatureGenetics7: 13-21 ；Mendez, 1997,Nature Geneticsl5: 146-56 ;以及有關(guān)“transomic”小鼠的各種出版物 / 專利，包括 EP843961 和 Tomizuka, 1997，Nature Geneticsl6:1433_43。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白和抗CD154抗體還涉及交叉阻斷結(jié)合蛋白或抗體，或涉及與和本文所述任何抗體結(jié)合相同表位、或與和本文所述任何抗體緊密相關(guān)或重疊的表位結(jié)合的結(jié)合蛋白或抗體。交叉阻斷結(jié)合蛋白或抗體可競爭性抑制或阻斷本文所述任何抗體的結(jié)合。在本文所述某些實施方案中，本發(fā)明提供如下CD154結(jié)合蛋白和抗CD154抗體，其與含SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 13的重鏈序列且含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列的人源化抗體(342Fab和Fab’片段)結(jié)合相同表位，并且在用抗⑶154抗體5c8的競爭測定法中，顯示出相似的CD154結(jié)合性質(zhì)。在本文所述其他實施方案中，本發(fā)明提供如下CD154結(jié)合蛋白和抗CD154抗體，其與含SEQ ID NO:58的VL結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO:60的VH結(jié)構(gòu)域序列的人源化抗體(338抗體可變序列)結(jié)合相同表位,并且在用抗CD154抗體5c8的競爭測定法中，顯示出相似的CD154結(jié)合性質(zhì)。在本發(fā)明的某些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)顯示出對于人CD 154的高親和力。例如，在某些實施方案中，如通過表面等離子體共振(例如Biacore )所測定，CD154結(jié)合蛋白以50nM — IpM(包括端點)的Kd與人CD154(人CD40L)解離。例如，與人 CD154 的 Kd 可為 25nM— IpMUOnM -1pM, 5nm - 1ρΜ、1ηΜ — 1ρΜ、0.5ηΜ — 1ρΜ、0.InM—1ρΜ、75ρΜ — 1ρΜ、50ρΜ — lpM、20pm — lpm、或甚至 IOpm — lpm。在其他實施方案中，如通過表面等離子體共振(例如Biacore )所測定，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白以500pM -1pM(包括端點)的Kd與人⑶154解離。在一些實施方案中，與人⑶154的Kd小于50pM。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白以小于20pM的Kd與人⑶154解離。在本發(fā)明的一些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白以小于IOpM的Kd與人⑶154解離。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白以高親和力與⑶154結(jié)合，但不從⑶40取代結(jié)合的⑶154?？贵w親和力可通過本領(lǐng)域已知的方法得到增強(參見例如，Clark et al., 2006Protein Sc1.15 (5):949-60,其描述了使用基于結(jié)構(gòu)的計算設(shè)計的抗體親和力增強,和Chao et al.，2006NatProtocl:755-768，其描述了使用酵母表面展示分離且改造具有所需性質(zhì)的scFv的方法)。當(dāng)希望改善含一種以上的上述CDR的本發(fā)明抗體的親和力時，具有改善親和力的此抗體可通過許多親和力成熟方案獲得，包括但不限于維持⑶R (Yang et al., J.Mol.Biol, 254, 392-403,1995)、鏈改組(Marks et al.，Bio/Technology, 10，779-783，1992)、大腸桿菌突變菌株的使用(Low et al., J.Mol.Biol.，250，350-368，1996)、DNA 改組(Pattenet al.，Curr.0pin.Biotechnol, 8, 724-733,1997)、曬菌體展不(Thompson et al., J.Mol.Biol，256，7-88，1996)和有性 PCR (Crameri, et al.，Nature，391，288-291，1998)。所有這些親和力成熟方法由 Vaugh an et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539,1998)討論。因此，本發(fā)明還提供與CD154特異性結(jié)合的本發(fā)明抗體的序列變體。此序列變體在其序列內(nèi)含一種以上的半保守或保守置換，并且此置換優(yōu)選不顯著影響多肽的所需活性。置換可為天然存在的或可例如使用誘變引入(例如Hutchinson et al., 1978, J.Biol.Chem.253:6551)。氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通常可彼此置換(具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)。在這些可能的置換中，優(yōu)選甘氨酸和丙氨酸用于彼此置換(因為它們具有相對短的側(cè)鏈)，并且纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸用于彼此置換(因為它們具有疏水性的較大的脂肪族側(cè)鏈)。通?？杀舜酥脫Q的其他氨基酸包括但不限于:-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)；-賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸);-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)的結(jié)合親和力也可以相對術(shù)語或與第二種抗體的結(jié)合親和力比較進行描述，所述第二種抗體也與CD154特異性結(jié)合(例如，CD 154特異性的第二種抗CD154抗體，其在本文中可稱為“第二種CD154特異性抗體”。在一些實施方案中，第二種⑶154特異性抗體可為抗體5c8(由US5，474，771中所述保藏于ATCC的保藏號為HB10916的雜交瘤產(chǎn)生)或人源化5c8。在其他實施方案中，第二種CD154特異性抗體可為本發(fā)明的任何抗體，例如342、381、338、294、295、300、335、303或402 (圖12)。因此，本發(fā)明的某些實施方案涉及如下抗CD154抗體，其以相比抗體5c8更大的親和力、或以相比抗體5c8Kd更低的Kd與人CD154結(jié)合。在某些實施方案中，在等摩爾濃度下，本發(fā)明的抗⑶154抗體也抑制⑶154活性或阻斷⑶154:⑶40相互作用至相比第二種⑶154特異性抗體(例如5c8)更大的程度?？耿?54抗體阻斷⑶154:⑶40相互作用的相對能力可通過任何可用的測定法進行測量，例如本文所述ICAM-1上調(diào)測定法和競爭結(jié)合測定法。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體(包括抗體片段和衍生物)對于抑制⑶154與⑶40的結(jié)合有用且特異性高(例如IOpM — 1.5 μ M (包括端點)的IC50)。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗體)可具有IOpm —500pm、50pm — 500pm、100pm — 500pm、250pm — 750pm、500pm — I μ M 或 750pm — 1.5 μ M 的IC50。在進一步實施方案中，抗⑶154抗體基本上不激活⑶40活性或活化⑶40信號。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體拮抗⑶154或⑶40或兩者的活性。因此，本發(fā)明的某些實施方案涉及如下⑶154結(jié)合蛋白和抗⑶154抗體，相對于第二種CD154特異性抗體(例如抗體5c8或人 源化5c8)，其以更大或相等的親和力、或以低于或等于第二種⑶154特異性抗體的Kd與人⑶154結(jié)合，其中相對于第二種⑶154特異性抗體，抗⑶154抗體基本上不抑制⑶154:⑶40相互作用。此抗體可例如用作結(jié)合測定法和診斷劑。與第二種CD154特異性抗體相比，顯示出對于人CD154的高親和力但更低程度的⑶154:⑶40抑制的示例性抗體是本文所述抗體381和338。例如，本發(fā)明提供如下抗⑶154抗體，其以更高或相等的親和力(相對于第二種CD154特異性抗體(例如人源化5c8))與人⑶154特異性結(jié)合，但阻斷⑶154:⑶40相互作用至相比第二種⑶154特異性抗體更少的程度。在進一步實施方案中，抑制⑶154 (⑶40L)與⑶40的結(jié)合至相比第二種⑶154特異性抗體更少的程度的這些抗CD 154抗體也基本上不激活CD40活性或活化CD40信號。例如，如果在如實施例7中所述體外效力測定法中施用此抗體，則可不顯示出超過對照處理的任何基本上顯著的拮抗作用，或可顯示出與陽性對照(例如⑶154配體)相比1%、2%、3%、5%或10%的拮抗作用。Vidalain 等人(The EMBO Journal (2000) 19:3304_3313)和 Pearson 等人(International Immunology (2001)13:273_283)描述了 CD40 信號通路，并且還提供可用于測定CD154:CD40相互作用是否被阻斷或抑制，以及至何種程度被阻斷或抑制的測定法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及含選自CDR-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR-H2 (SEQ IDN0:4)和⑶R-H3 (SEQ ID NO:5)中的至少一個⑶R的抗⑶154抗體?？贵w優(yōu)選含選自CDR-Hl (SEQ ID N0:3)、CDR_H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)中的至少 2 個CDR,并且更優(yōu)選含這些CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3中的所有3個CDR。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體含選自CDR-LKSEQ ID NO:6)、CDR_L2(SEQ ID N0:7)和CDR-L3 (SEQ ID NO: 8)中的至少一個CDR。抗體優(yōu)選含選自CDR-L1(SEQ ID N0:6)、CDR-L2 (SEQ ID N0:7)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:8)中的至少 2 個 CDR，并且更優(yōu)選含這些⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中的所有3個⑶R。
在進一步實施方案中，抗體含CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 (SEQ ID NO:3 — 5)中的所有 3 個以及 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 (SEQ ID NO:6 — 8)中的所有 3 個。在進一步實施方案中，抗⑶154抗體含SEQ ID NO:1、9、10或11中任一個的可變重鏈序列，并且含SEQ ID NO:2或14的可變輕鏈序列。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及含選自CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR_H2 (SEQ IDNO:43)和⑶R-H3 (SEQ ID NO:44)中的至少一個⑶R的抗⑶154抗體?？贵w優(yōu)選含選自CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR_H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID N0:44)中的至少 2個CDR,并且更優(yōu)選含這些CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3中的所有3個CDR。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體含選自⑶R-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:47)中的至少一個 CDR。抗體優(yōu)選含選自CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR_L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID N0:47)中的至少 2個OTR,并且更優(yōu)選含這些⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中的所有3個⑶R。在進一步實施方案中，抗體含CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 (SEQ ID NO:42 一 44)中的所有 3 個，以及 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 (SEQ ID NO:45 — 47)中的所有 3 個。在進一步實施方案中，抗⑶154抗體含SEQ ID NO:56的可變重鏈序列和/或含SEQ ID NO:54的可變輕鏈序列。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及含選自CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR_H2 (SEQ IDN0:49)和⑶R-H3 (SEQ ID NO:50)中的至少一個⑶R的抗⑶154抗體?？贵w優(yōu)選含選自CDR-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR_H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID N0:50)中的至少 2個CDR,并且更優(yōu)選含這些CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3中的所有3個CDR。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體含選自⑶R-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)中的至少一個 CDR?？贵w優(yōu)選含選自CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR_L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID N0:53)中的至少 2個OTR,并且更優(yōu)選含這些⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中的所有3個⑶R。在某些實施方案中，抗體具有分別含上述⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3中一個以上的輕鏈⑶R的互補序列，或者含上述一個以上的重鏈⑶R或⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的互補序列。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體含⑶R-Hl (SEQ ID NO:48)、⑶R-H2(SEQ IDNO:49)或 CDR-H3 (SEQ ID NO: 50)，以及 CDR-Ll (SEQ ID NO: 51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)或 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)。在進一步實施方案中，抗體含CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 (SEQ ID NO:48 一 50)中的所有 3 個以及 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 (SEQ ID NO:51 — 53)中的所有 3 個。在進一步實施方案中，抗⑶154抗體含SEQ ID NO:60的可變重鏈序列和/或含SEQ ID NO:58的可變輕鏈序列。在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:62的輕鏈序列和SEQID N0:65的重鏈序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:63的輕鏈序列和SEQ ID NO:66的重鏈序列。
在某些實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:68的輕鏈序列和SEQID N0:71的重鏈序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:69的輕鏈序列和SEQ ID N0:72的重鏈序列。在其他實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71 或 SEQ ID NO -J2 的序列之一。本發(fā)明還提供如下⑶154結(jié)合蛋白，其與本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白優(yōu)選共享至少90%、91%、92%、93%或94%同一性。CD154結(jié)合蛋白更有選共享至少95%、96%、97%或98%同一性。⑶154結(jié)合蛋白最優(yōu)選與本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白共享至少99%、99.5%, 99.9%或更多同一性。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白可含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:60的可變結(jié)構(gòu)域，或其一個以上的CDR至少85%等同的可變結(jié)構(gòu)域序列。本發(fā)明的其他實施方案涉及雙特異性抗體。雙特異性抗體是單克隆的，優(yōu)選人或人源化抗體，其具有對于至少2種不同抗原的結(jié)合特異性。它們可單獨使用或混合到含多克隆群的組合物內(nèi)。在本發(fā)明中，結(jié)合特異性之一是對于CD154抗原，而另一種結(jié)合特異性是對于任何其他抗原，并且優(yōu)選對于細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。例如，其他結(jié)合特異性可為選自人血清白蛋白(HSA)、TNFa、IL-U IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、IFN- Y、CD2、CD4、CD8、CTLA4、LFA1、LFA3 和 VLA4 的配體。在本發(fā)明的其他實施方案中，抗⑶154抗體含通用配體結(jié)合位點。通用配體(例如多肽)能夠無關(guān)靶配體特異性地結(jié)合庫的功能成員。通用配體因此可用于鑒定或選擇(例如，如在純化和篩選過程中)庫的功能成員(例如，無關(guān)抗體的抗原結(jié)合特異性的抗體的集合或組)。通用配體包括例如蛋白A、蛋白G和蛋白L。W099/20749中教導(dǎo)了用通用配體預(yù)篩選噬菌體文庫成員?？贵w片段本發(fā)明還涉及抗 原結(jié)合或表位結(jié)合抗CD154抗體片段。有關(guān)抗CD154抗體的所有上述方法和制劑可類似地用于產(chǎn)生且使用本發(fā)明的抗CD154抗體片段。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗CD154抗體片段包括異聚抗體復(fù)合物和抗體融合物，例如雙特異性抗體、半二聚抗體、多價抗體(即四價抗體)和單鏈抗體。半二聚抗體由Fe部分和一個Fab部分構(gòu)成。單鏈抗體由在單條蛋白鏈中將可變區(qū)通過蛋白間隔物連接而構(gòu)成。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體片段還可包括含一個以上的免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的蛋白，例如這些鏈的單體和同多聚體或異多聚體(例如二聚體或三聚體)，其中這些鏈任選是二硫化物鍵合的或以其他方式交聯(lián)的。這些抗體能夠與一種以上的抗原結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明包括完整抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab、F (ab)2、Fab，、F (ab，)2、F (ab，)3、F (v)、Fd、dAb、雙抗體、小型抗體和納米抗體片段。本發(fā)明還涉及僅含單個可變結(jié)構(gòu)域(例如Vh或\結(jié)構(gòu)域)的片段，或僅含重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域的片段。片段可為人源化的或全人的。本發(fā)明還包括由備選支架制備(參見例如上述Binz和上述Hosse的文章)，或含通用構(gòu)架的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還涉及含任何抗原結(jié)合片段的綴合物、或例如與功能部分(例如載體蛋白或PEG)共價或非共價或者直接或間接綴合的特異性結(jié)合CD154的CD154結(jié)合蛋白。本發(fā)明的抗⑶154抗體包括二價抗體。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及二價抗CD154抗體片段，其含以共價連接的2條抗體重鏈和至少一個聚合物分子，每條重鏈通過至少一個非二硫化物鏈間橋與其他鏈共價連接，所述非二硫化物鏈間橋使一條鏈中的半胱氨酸殘基的硫原子與另一條鏈中的半胱氨酸殘基的硫原子連接，半胱氨酸殘基位于每條鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域外，其特征在于至少一個非二硫化物鏈間橋含共價連接的聚合物分子。本文所述術(shù)語“非二硫化物”意在排除例如通常見于抗體中的類型的S-S橋。然而，如下文所述，本發(fā)明的片段中存在的鏈間橋類型仍可經(jīng)由-S-S-鍵與重鏈連接。一般而言，本發(fā)明的二價抗體片段中的每個聚合物分子形成鏈間橋的部分。每個橋用于使2條重鏈連接，并且在每條鏈中將與半胱氨酸殘基的硫原子共價連接。共價鍵一般將是二硫鍵，或在具體實施方案中，將是硫-碳鍵。關(guān)于示例性二價抗體結(jié)構(gòu)，參見W099/64460和W005/061005。本發(fā)明還提供是單價抗體或單價抗原結(jié)合片段的抗CD154抗體。本文所述術(shù)語“單價”意指給定抗體或抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)v、單鏈scFv、dAb、Fab、Fab’、Fd、scFab、scFab Λ C等)可結(jié)合其靶的僅單個分子。天然存在的抗體一般是二價的，因為它們具有2個功能抗原結(jié)合臂，各自含Vh和'結(jié)構(gòu)域。當(dāng)空間位阻不是問題時，二價抗體可結(jié)合同一抗原的2個獨立的分子。相比之下，“單價”抗體具有靶的一個抗原結(jié)合位點。單價抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可含Vh和\結(jié)構(gòu)域，或可僅含單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(即Vh或\結(jié)構(gòu)域)，其無需分別相應(yīng)'或Vh結(jié)構(gòu)域的情況下具有結(jié)合CD154的能力。此示例性單價抗體是Fd片段，其含單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域并且可僅與一個CD154抗原分子結(jié)合。單價抗體缺乏使單個抗原分子交聯(lián)的能力。本發(fā)明提供抗CD154抗體，其中抗體與如下表位特異性結(jié)合，分別具有SEQ ID NO:12或13的重鏈序列且具有SEQ ID NO:15的輕鏈序列的人源化Fab或Fab’片段與所述表位特異性結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是具有SEQ ID NO:1、9、10或11的可變重鏈序列且具有SEQ ID NO:2或14的可變輕鏈序列的抗體片段。在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體是具有SEQ ID NO:12或13的重鏈序列和SEQ ID NO:15的輕鏈序列的抗體片段。在某些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗體含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列和SEQ IDNO:13的重鏈序列，或由SEQ ID NO:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:13的重鏈序列構(gòu)成。在某些實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白或抗體含SEQ ID NO:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:12的重鏈序列，或由SEQ ID NO:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:12的重鏈序列構(gòu)成。在備選實施方案中，本發(fā)明提供含SEQ ID NO:56的可變重鏈序列且含SEQ IDNO:54的可變輕鏈序列的抗體片段。在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體是含SEQ ID NO:60的可變重鏈序列且含SEQ ID NO:58的可變輕鏈序列的抗體片段。在一個實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合⑶154的Fab’或F (ab’)2*F (ab’)3片段。這種Fab’或F (ab’)2*F (ab’)3片段可為人源化的，并且可具有含SEQ ID NO:13序列或由SEQ ID NO:13序列構(gòu)成的重鏈序列，并且可具有含SEQ ID N0:15序列或由SEQ ID NO:15序列構(gòu)成的輕鏈序列。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及無Fe結(jié)構(gòu)域的抗⑶154抗體。此Fe缺陷抗體或片段可為單價、二價、或還可為多價的。本發(fā)明還提供與如下表位特異性結(jié)合的抗體或抗體片段，上述Fab’或F CabO2或F (&13’)3片段與所述表位特異性結(jié)合。這些抗體或抗體片段可通過如本文所述交叉阻斷測定法進行鑒定(實施例9)。這些抗體或抗體片段可進行分離、重組或合成，并且可與第二種分子附著以形成抗體-綴合物。具有減少的效應(yīng)子功能的抗體抗體和抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的相互作用觸發(fā)各種應(yīng)答，在本文中稱為效應(yīng)子功能。IgG抗體通過與細(xì)胞表面Fe Y受體家族成員和補體系統(tǒng)的Clq結(jié)合而活化免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子通路。效應(yīng)蛋白通過成簇抗體的連接觸發(fā)各種應(yīng)答，包括炎癥細(xì)胞因子的釋放、抗原產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、胞吞作用和細(xì)胞殺傷。在一些臨床應(yīng)用中，這些應(yīng)答對于單克隆抗體的功效是關(guān)鍵的。在其他中，它們引起不希望有的副作用(例如炎癥)和帶抗原細(xì)胞的消除。因此，本發(fā)明進一步涉及具有改變(例如減少)的效應(yīng)子功能的CD154結(jié)合蛋白(包括抗體)。重要的是，減少的效應(yīng)子功能不一定減少抗⑶154抗體經(jīng)由阻斷⑶154-⑶40相互作用來抑制一種以上的疾病的能力(參見通過弓I用整體并入本文的WO 05/03175)。具有減小的效應(yīng)子功能(例如Fe介導(dǎo)的效應(yīng)子功能；參見下文)的抗CD154抗體特別希望用于在其中存在不希望有的血栓栓塞活性潛力的受試者中使用。此外，抗CD154抗體減小的效應(yīng)子功能可減小或消除抗CD154抗體治療的其他潛在不需要的副作用，例如活化T細(xì)胞和誘導(dǎo)表達CD154或Fe依賴性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化的其他細(xì)胞群的消失。本發(fā)明的抗CD154抗體的效應(yīng)子功能可使用許多已知測定法之一進行測定?？笴D 154抗體的效應(yīng)子功能相對于第二種抗CD154抗體可為減少的。在一些實施方案中，第二種抗CD154抗體可為特異性結(jié)合CD154的任何抗體。在一些實施方案中，第二種抗CD154抗體可為抗體5c8(如US5，474，771中所述由保藏于ATCC的保藏號為HB10916的雜交瘤產(chǎn)生)或人源化5c8。在其他實施方案中，第二種CD154特異性抗體可為本發(fā)明的任何抗體，例如，342、381、338、294、295、300、335、303或402 (圖12)。在其他實施方案中，當(dāng)目的抗CD 154抗體已經(jīng)修飾以減少效應(yīng)子功能時，第二種抗CD154抗體可為抗體的未修飾或親本形式。本發(fā)明的抗⑶154抗體的效應(yīng)子功能也可例如通過測量相對于對照抗體由用抗CD154抗體處理引起的血小 板凝集或活化水平來進行測定。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體在標(biāo)準(zhǔn)血小板凝集或活化測定法中不介導(dǎo)或不增強血小板凝集或活化。在其他實施方案中，相對于第二種抗CD154抗體(例如5c8或人源化5c8)，抗CD154抗體介導(dǎo)較低水平的血小板凝集或活化。示例性效應(yīng)子功能包括Fe受體結(jié)合、噬菌作用、凋亡、促炎應(yīng)答、細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)等。其他效應(yīng)子功能包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，其中抗體結(jié)合在細(xì)胞毒性T細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的Fe受體導(dǎo)致細(xì)胞死亡，和補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，這是經(jīng)由補體級聯(lián)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(在Daeron, Annu.Rev.Tmmunol.15:203_234 (1997);Ward 和 Ghetie, Therapeutic Immunol.2:77-94 (1995);以及 Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.1mmunol.9:457_492 (1991)中綜述)。此效應(yīng)子功能一般需要Fe區(qū)以與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合，并且可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法進行評估(參見例如，W005/018572、W005/003175和U.S.6，242，195)。效應(yīng)子功能可通過使用缺乏Fe結(jié)構(gòu)域的抗體片段(例如Fab、Fab’ 2或單鏈Fv)來避免。備選方案已使用1864亞型抗體，其與？(:￥1 1結(jié)合但很少與Clq以及Fe Y RII和RIII結(jié)合。IgG2亞型也具有與Fe受體減少的結(jié)合，但保留與Fe y RIIa的H131同種異型和Clq的顯著結(jié)合。因此，需要Fe序列中的另外改變，以消除與所有Fe受體和Clq的結(jié)合。
幾種抗體效應(yīng)子功能(包括ADCC)由結(jié)合抗體的Fe區(qū)的Fe受體(FcR)介導(dǎo)?？贵w對于特定FcR的親和力且因此由抗體介導(dǎo)的效應(yīng)子活性可通過改變抗體的Fe和/或恒定區(qū)的氨基酸序列和/或翻譯后修飾來進行調(diào)節(jié)。FcR通過其對于免疫球蛋白同種型的特異性來限定；IgG抗體的Fe受體被稱為Fe Y R，IgE抗體的Fe受體被稱為Fe ε R, IgA抗體的Fe受體被稱為Fe a R等等。已鑒定了 3 個 Fe YR 亞類:Fe YRI (CD64)、FcyRII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16)。Fe Y RII 和Fe Y RIII 都具有 2 個類型:Fc y RIIA (CD32)和 Fe y RIIB (CD32);以及 Fe y RIIIA (CD16a)和Fe Y RIIIB(⑶16b)。因為每個Fe Y R亞類由2種或3種基因編碼，并且可變RNA剪接導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄物，所以存在Fe YR同種型中的廣泛多樣性。例如Fe Y RII (CD32)包括同種型Ila、llbl、llb2、llb3 和 He。已于之間將人和鼠類 抗體上Fe Y R的結(jié)合位點定位于由殘基233 — 239構(gòu)成的所謂的“較低鉸鏈區(qū)”(如在下述中的EU指數(shù)編號:Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991),Woof et al.,Molec.1mmunol.23:319-330 (1986)；Duncanet al., Nature332:563 (1988);Canfield 和 Morrison，J Exp.Med.173: 1483-1491 (1991 )；Chappel et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA88 =9036-9040 (1991))。這些文獻中指出殘基233-239中的P238和S239可能參與結(jié)合。其它先前指出可能參與與Fe Y R的結(jié)合的區(qū)域是=AFcyRI的G316-K338 (人IgG)(僅通過序列比對；未評估置換突變體)(Woofet al.,Molec Immunol.23:319-330 (1986));人 Fe Y RIII 的 K274-R301 (人 IgGl)(基于肽)(Sarmay et al.,Molec.1mmunol.21:43-51 (1984));和人 Fe Y RIII 的 Y407-R416(人 IgG)(基于妝)(Gergely et al., Biochem.Soc.Trans.12:739-743 (1984)和 Shieldset al., J Biol Chem 276:6591-6604(2001),Lazar GA et al., Proc Natl Acad Scil03:4005-4010 (2006)。根據(jù)Ig-FcR復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的檢查，涉及FcR結(jié)合的氨基酸殘基的這些和其他段或區(qū)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員可為顯而易見的(參見例如，Sondermann etal., 2000Nature406 (6793):267_73 和 Sondermann et al., 2002Biochem Soc Trans.30
(4):481-6)。因此，本發(fā)明的抗⑶154抗體包括一種以上的上述殘基的修飾。用于減少mAb效應(yīng)子功能的其他已知方法包括使mAb表面上參與效應(yīng)子結(jié)合相互作用的氛基酸突變(Lund, J.，et al., (1991) J.1mmunol.147 (8):2657_62 ;Shields,R-Let al., (2001) J.Biol.Chem.276 (9):6591_604 ;以及使用不同亞型序列區(qū)段的組合(例如IgG2和IgG4組合)，以產(chǎn)生比單獨的任一亞型與Fe Y受體的結(jié)合的更大減少(Armouret al., Eur.J.1mmunol.(1999) 29:2613-1624 ；Mol.1mmunol.40 (2003) 585-593)。本領(lǐng)域已知對于一些或全部Fe受體亞型(并且因此對于效應(yīng)子功能)具有改變和/或減少的親和力的大量Fe變體。參見例如，US2007/0224188 ；US2007/0148171 ；US2007/0048300 ；US2007/0041966 ；US2007/0009523 ；US2007/0036799 ；US2006/0275283 ；US2006/0235208 ；US2006/0193856 ；US2006/0160996 ；US2006/0134105 ；US2006/0024298 ；US2005/0244403 ；US2005/0233382 ；US2005/0215768 ；US2005/0118174 ；US2005/0054832 ；US2004/0228856 ；US2004/132101 ；US2003/158389 ;還參見 US7, 183，387 ；6, 737，056 ；6，538，124 ；6, 528，624 ；6, 194，551 ；5, 624，821 ；5, 648，260。在CDC中，抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合補體，導(dǎo)致補體級聯(lián)的活化和膜攻擊復(fù)合物的產(chǎn)生。經(jīng)典補體通路的活化通過補體系統(tǒng)的第一種組分(Clq)與抗體(合適的亞類的)的結(jié)合起始，所述抗體與其同源抗原結(jié)合；因此補體級聯(lián)的活化部分地通過免疫球蛋白與Clq蛋白的結(jié)合親和力調(diào)節(jié)。為了活化補體級聯(lián)，Clq必須與IgGl、IgG2或IgG3中的至少2種分子結(jié)合，但與IgM的僅一個分子結(jié)合，所述抗體與抗原祀附著(Ward和Ghetie, TherapeuticImmunology2:77_94( 1995)第80頁)。為了評估補體活化，可進行例如如Gazzano-Santoroet al., J.1mmunol.Methods202:163 (1996)中所述 CDC 測定法。已提出IgG分子的各個殘基涉及與Clq的結(jié)合，包括在CH2結(jié)構(gòu)域上的Glu318、Lys320和Lys322，位于與相同β鏈緊密相鄰的轉(zhuǎn)折上的氨基酸殘基331，位于較低鉸鏈區(qū)中的Lys235和Gly237殘基，以及位于CH2結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)域中的殘基231 — 238(參見例如，Xu et al., J.1mmunol.150:152A (Abstract) (1993),W094/29351 ；Tao et al., J.Exp.Med.,178:661_667 (1993) ；Brekke et al.，Eur.J.1mmunol, 24:2542-47 (1994) ；Burtonet al., ;Nature,288:338_344 (1980) ；Duncan 和 Winter, Nature332:738-40 (1988);Idusogie et al., J Immunoll64:4178_4184 (2000 ;U.S.5，648，260 和 U.S.5，624，821)。作為IgGl的例子，人IgGl的CH2結(jié)構(gòu)域的COOH末端區(qū)域中的2個突變(K322A和P329A)不活化⑶C通路，并且顯示導(dǎo)致Clq結(jié)合中超過100倍的減少(US6，242，195)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，可修飾、置換或去除一個以上的這些殘基，或者可插入一個以上的氨基酸殘基，以減少本文提供的⑶154抗體的⑶C活性。例如，在一些實施方案中，可能希望減少或消除受試者抗體的一種以上的效應(yīng)子功能，以便減少或消除進一步活化免疫應(yīng)答的潛力。具有減少的效應(yīng)子功能的抗體也可減少接受抗體的受試者中的血栓栓塞事件的危險。在某些其他實施方案中，本發(fā)明提供如下抗⑶154抗體，其顯示出與一種以上的FcR受體減少的結(jié)合，但維持其結(jié)合補體的能力(例如，至相似程度，或在一些實施方案中，至比天然、非變體或親本抗⑶154抗體更低的程度)。因此，本發(fā)明的抗⑶154抗體可結(jié)合且活化補體，同時顯示出與FcR (例如Fe Y RIIa (例如在血小板上表達的Fe y RIIa))減少的結(jié)合。此與Fe Y RIIa (例如在血小板上表達的Fe y RIIa)具有減少的結(jié)合或無結(jié)合但可結(jié)合Clq且使補體級聯(lián) 活化至至少一定程度的抗體將減少血栓栓塞事件的危險，同時維持可能需要的效應(yīng)子功能。在備選實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體顯示出與一種以上的FcR減少的結(jié)合，但維持其與一種以上的其他FcR結(jié)合的能力。參見例如，US2007-0009523、2006-0194290,2005-0233382,2004-0228856 和 2004-0191244,所述專利描述了產(chǎn)生與FcRI,FcRII和/或FcRlII具有減少的結(jié)合的抗體的各種氨基酸修飾，以及導(dǎo)致與一種FcR增加的結(jié)合但與另一種FcR減少的結(jié)合的氨基酸置換。因此，涉及抗⑶154抗體的恒定區(qū)的效應(yīng)子功能可通過改變恒定區(qū)且尤其是Fe區(qū)的性質(zhì)來進行調(diào)節(jié)。在某些實施方案中，比較具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體與具有效應(yīng)子功能的第二種抗體，所述第二種抗體可為含介導(dǎo)效應(yīng)子功能的天然恒定區(qū)或Fe區(qū)的非變體、天然或親本抗體(例如，抗體342或在US5，474，771中所述抗體5c8)。在具體實施方案中，效應(yīng)子功能調(diào)節(jié)包括活性消除或完全缺失的情況。天然序列Fe或恒定區(qū)含與見于天然的Fe或恒定鏈區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。用于評估相對效應(yīng)子功能的對照分子優(yōu)選含與測試抗體或變體抗體相同類型/亞型的Fe區(qū)。變體或改變的Fe或恒定區(qū)含如下氨基酸序列，其借助于至少一個氨基酸修飾(例如，翻譯后修飾、氨基酸置換、插入或刪除)而不同于天然序列重鏈區(qū)域的序列。因此，變體恒定區(qū)可含導(dǎo)致改變的翻譯后修飾(包括例如改變的糖基化模式)的一個以上的氨基酸置換、刪除或插入。親本抗體或Fe區(qū)是例如用于構(gòu)建具有改變的(例如減少的)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)(即Fe)的具有正常效應(yīng)子功能的變體。可通過改造或產(chǎn)生具有變體恒定、Fe或重鏈區(qū)域的抗體來產(chǎn)生具有改變的(例如減少或消除的)效應(yīng)子功能的抗體。重組DNA技術(shù)和/或細(xì)胞培養(yǎng)和表達條件可用于產(chǎn)生具有改變的功能和/或活性的抗體。例如，重組DNA技術(shù)可用于改造影響抗體功能(包括效應(yīng)子功能)的區(qū)域(例如Fe或恒定區(qū))中的一種以上的氨基酸置換、刪除或插入。備選地，可通過操作產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)和表達條件來達到翻譯后修飾(例如糖基化模式)的改變(參見下文)。氨基酸改變(例如氨基酸置換)可在不影響抗原結(jié)合親和力的情況下改變本發(fā)明的抗CD154抗體的效應(yīng)子功能。上述氨基酸置換(例如Glu318、Kys320、Lys332、Lys235、Gly237、K332和P329)例如可用于產(chǎn)生具有減少的效應(yīng)子功能的抗體。在其他實施方案中，可對一個以上的下述氨基酸殘基進行氨基酸置換:重鏈恒定區(qū)的 234、235、236、237、297、318、320 和 322 (參見 US5, 624，821 和 US5, 648，260)。此置換可在改變效應(yīng)子功能的同時保留抗原結(jié)合活性。與未經(jīng)修飾的或非變體抗體相比，在氨基酸234、235、236和237中的一處或多處改變可減少Fe區(qū)對于Fe Y RI受體的結(jié)合親和力。氨基酸殘基234、236和/或237可例如用丙氨酸置換，并且氨基酸殘基235可例如用谷氨酰胺置換。在另一實施方案中，抗⑶154IgGl抗體可含在位置234處的Leu用Ala的置換，在位置235處的Leu用Glu的置換，在位置237處的Gly用Ala的置換。另外或備選地，可改變在318、320和322處的Fe氨基酸殘基。在小鼠和人IgG中高度保守的這些氨基酸殘基介導(dǎo)補體結(jié)合。已顯示這些氨基酸殘基的改變減少Clq結(jié)合，但不改變抗原結(jié)合、蛋白A結(jié)合、或Fe與小鼠巨噬細(xì)胞結(jié)合的能力。

在另一實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體是含減少或消除效應(yīng)子功能的置換的IgG4免疫球蛋白。本發(fā)明的抗⑶154抗體的IgG4Fc部分可含一種以上的下述置換:用脯氨酸置換在殘基233處的谷氨酸，用丙氨酸或纈氨酸置換在殘基234處的苯丙氨酸，以及用丙氨酸或谷氨酸置換在殘基235(EU編號，參照上述Kabat，Ε.A.等人(1991)的文章)處的亮氨酸。此外，通過用Ala置換在殘基297(EU編號)處的Asn來去除IgG4Fc區(qū)中的N聯(lián)糖基化位點可進一步減少效應(yīng)子功能，并且消除可能存在的任何殘留效應(yīng)子活性。具有減少的效應(yīng)子功能的另一種示例性IgG4突變體是在重鏈恒定區(qū)中含突變S228P和L235E(PE突變)的IgG4亞型變體。這個突變導(dǎo)致減少的效應(yīng)子功能。參見US5，624，821和US5，648，260。在IgG4中減少效應(yīng)子功能的另一種示例性突變是本文所述的S228P/T229A。在恒定區(qū)中的其他示例性氨基酸序列改變包括但不限于由Bluestone等人所述Ala-Ala突變(參見W094/28027和W098/47531 ;還參見Xu et al., 2000Cell Immunol 200 ；16-26)。因此在某些實施方案中，具有在恒定區(qū)內(nèi)的突變(包括Ala-Ala突變)的抗⑶154抗體可用于減少或取消效應(yīng)子功能。根據(jù)這些實施方案，抗⑶154抗體的恒定區(qū)含對位置234處的丙氨酸的突變或?qū)ξ恢?35處的丙氨酸的突變。因此，恒定區(qū)可含雙重突變:對位置234處的丙氨酸的突變和對位置235處的丙氨酸的第二種突變。在一個實施方案中，抗⑶154抗體含IgG4構(gòu)架，其中Ala-Ala突變將描述在位置234處從苯丙氨酸到丙氨酸的突變和/或在位置235處從亮氨酸到丙氨酸的突變。在另一實施方案中，抗CD154抗體含IgGl構(gòu)架，其中Ala-Ala突變將描述在位置234處從亮氨酸到丙氨酸的突變和/或在位置235處從亮氨酸到丙氨酸的突變?？笴D154抗體可備選或另外攜帶其他突變，包括在CH2結(jié)構(gòu)域中的點突變K322A(Hezareh et al., 2001J Virol.75:12161-8)。在W094/29351 (其通過引用整體合并入本文)中提供了其他示例性氨基酸置換，所述專利描述了在CH2結(jié)構(gòu)域的N末端區(qū)域中具有突變的抗體，所述突變改變抗體與FcRI結(jié)合的能力，從而減少抗體與Clq結(jié)合的能力,這又減少抗體固定補體的能力。還參見Cole等人(J Immunol.(1997)159:3613_3621 )，其描述了在IgG2的上游CH2區(qū)中導(dǎo)致較低FcR
結(jié)合的突變。產(chǎn)生含氨基酸置換的任何上述抗體變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。這些方法包括但不限于，通過對制成的編碼抗體或抗體的至少恒定區(qū)的DNA分子的定點(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。定點誘變是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Carter et al., Nucleic AcidsRes.13:4431-4443( 1985)和 Kunkel et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488 (1987)))。PCR誘變也適合于制備起始多肽的氨基酸序列變體。參見Higuchi，PCRProtocols,第 177-183 頁(Academic Press,1990)；和 Vallette et al., Nuc.AcidsRes.17:723-733 (1989)。用于制備序列變體的另一方法-盒式誘變基于由Wells et al., Gene34:
315-323 (1985)所述技術(shù)。本發(fā)明的另一個實施方案涉及具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體，其中抗體的Fe區(qū)或其部分與具有天然減少的效應(yīng)子誘導(dǎo)活性的Fe區(qū)(或其部分)交換。例如，人IgG4恒定區(qū)顯示出減少的補體活化或無補體活化。此外，不同IgG分子在其對于FcR的結(jié)合親和力方面不同，這可至少部分是由IgG鉸鏈區(qū)的各種長度和彈性所致(這按順序IgG3>IgGl>IgG4>IgG2減少)。例如，IgG4顯示出與Fe Y RIIa減少的結(jié)合或無結(jié)合。關(guān)于嵌合分子和嵌合恒定區(qū)的例子，參見例如，Gillies et al., (Cancer Res.1999, 59:2159-2166)和 Mueller et al., (Mol.1mmunol.1997，34:441_452)。本發(fā)明還涉及具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體，其中Fe區(qū)完全缺失。此抗體也可稱為本發(fā)明的抗體衍生物和抗原結(jié)合片段。此衍生物和片段可與非抗體蛋白序列或非蛋白結(jié)構(gòu)融合，當(dāng)施用于動物(例如人受試者)時，所述結(jié)構(gòu)尤其是設(shè)計為促進遞送和/或生物利用度的結(jié)構(gòu)(參見下文)。 如上所述，在鉸鏈區(qū)內(nèi)的改變也影響效應(yīng)子功能。例如，鉸鏈區(qū)的缺失可影響對于Fe受體的親和力，并且可減少補體活化(Klein et al., 1981PNAS USA78:524-528)。本公開內(nèi)容因此也涉及具有在鉸鏈區(qū)中的改變的抗體。在具體實施方案中，本發(fā)明的抗體可經(jīng)修飾以抑制補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。通過在抗體的Fe區(qū)中引入一個以上的氨基酸置換、插入或刪除可實現(xiàn)調(diào)節(jié)的⑶C活性(參見例如，US6，194，551和US 6，242，195)。備選或另外地，可將半胱氨酸殘基引入Fe區(qū)中，從而允許這個區(qū)域中的鏈間二硫鍵形成。因此產(chǎn)生的同二聚抗體可具有改善或減少的內(nèi)在化能力和/或增加或減少的補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。參見Caron et al.，J.Exp Med.176:1191-1195 (1992)和 Shopes, B.J.1mmunol.148 =2918-2922 (1992)，W099/51642, Duncan& Winter Nature322:738_40 (1988) ；US5, 648，260 ；US5, 624，821 ;和 W094/29351。應(yīng)進一步理解效應(yīng)子功能可根據(jù)抗體的結(jié)合親和力而改變。例如，與具有相對更低的親和力的抗體相比，具有高親和力的抗體在活化補體系統(tǒng)方面可能更有效(Marzocch1-Machado et al., 1999Immunol Invest28:89_101)。因此，抗體可改變?yōu)閷τ谄淇乖慕Y(jié)合親和力減少(例如，通過諸如一個以上的氨基酸殘基的置換、添加或刪除的方法通過改變抗體的可變區(qū))。具有減少的結(jié)合親和力的抗體可顯示出減少的效應(yīng)子功能，包括例如減少的ADCC和/或CDC。具有減少的效應(yīng)子功能的本發(fā)明的抗CD154抗體包括相對于親本或非變體抗CD154抗體，對于一種以上的Fe受體(FcR)具有減少的結(jié)合親和力的抗體。因此，具有減少的FcR結(jié)合親和力的抗CD154抗體包括如下抗CD154抗體，與親本或非變體抗CD154抗體(例如抗體342或5c8)相比，其在與一種以上的Fe受體的結(jié)合親和力方面顯示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的減少。在一些實施方案中，相對于親本或非變體抗體，具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體以小約10倍的親和力與FcR結(jié)合。在其他實施方案中，相對于親本或非變體抗體，具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體以小約15倍的親和力或小約20倍的親和力與FcR結(jié)合。FcR受體可為Fe Y RI (CD64)、FcyRII (CD32)和Fe Y RII1、及其同種型，以及Fe ε R、Fe μ R、Fe δ R和/或Fe a R中的一種以上。在具體實施方案中，具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體在與Fe Y RIIa的結(jié)合親和力方面顯示出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的減少。因此，在某些實施方案中，相對于第二種抗⑶154抗體，本發(fā)明的抗⑶154抗體顯示出與補體蛋白減少的結(jié)合。在某些實施方案中，相對于第二種抗CD154抗體，本發(fā)明的抗⑶154抗體顯示出約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、約10倍以上、或約15倍以上減少的結(jié)合。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及當(dāng)施用于受試者時，引發(fā)減少的效應(yīng)子功能的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體不在施用了抗體的受試者中引起血栓形成。血栓形成包括例如血栓栓塞事件。此事件包括例如血管病變(例如血管變化,例如內(nèi)膜增厚和血管壁變化)。在一些實施方案中，相對于第二種CD154特異性抗體(例如抗體342、抗體5c8或人源化5c8),本發(fā)明的抗⑶154抗體引起更少的血栓栓塞事件。當(dāng)施用于受試者且與非變體或親本抗CD154抗體相比時,具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體可顯示出5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%的血栓栓塞事件次數(shù)減少。在某些實施方案中，當(dāng)與第二種⑶154特異性抗體(例如抗體5c8或人源化5c8 ；參見實施例1)相比時，本發(fā)明的抗CD154抗體在體外不引起血小板凝集或活化，和/或使血小板凝集或活化增強至更少的程度。因此，在某些實施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)血小板凝集或活化測定法中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)的存在不導(dǎo)致超過陰性對照測定法中觀察到的凝集或活化20%、25%、30%或50%以上的凝集或活化。示例性標(biāo)準(zhǔn)血小板凝集測定法是本文描述(實施例1，測定法I)且在圖26中顯示的測定法。可在本發(fā)明中使用的標(biāo)準(zhǔn)測定法和備選血小板凝集測定法(測定法2，圖27)描述于實施例11。CD154結(jié)合蛋白可為可溶性的。在某些實施方案中， 本發(fā)明還提供⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)，所述蛋白含特異性且單價結(jié)合CD40L的單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可溶性蛋白與CD154的結(jié)合基本上不誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞中的JNK磷酸化。本發(fā)明還提供CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)，所述蛋白含特異性且單價結(jié)合CD 154的單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可溶性蛋白與⑶154的結(jié)合基本上不誘導(dǎo)通過用抗⑶3抗體共刺激的Jurkat T細(xì)胞的IFN-Y分泌。本發(fā)明的某些實施方案涉及如下抗⑶154抗體，其含選自⑶R-HKSEQ ID NO:3)、CDR-H2 (SEQ ID NO:4)和CDR-H3 (SEQ ID NO:5)中一個以上的重鏈CDR序列，其中抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在進一步實施方案中，抗CD154抗體含至少2個所述CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3個如下重鏈CDR 序列，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR_H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ IDNO:5)。本發(fā)明的其他實施方案涉及如下抗CD154抗體，其含選自CDR-LKSEQ ID NO:6)、CDR-L2 (SEQ ID NO:7)和CDR-L3 (SEQ ID NO:8)中一個以上的輕鏈CDR序列，其中抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在進一步實施方案中，抗CD 154抗體含至少2個所述輕鏈CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3個如下輕鏈 CDR 序列，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:6)、CDR-L2 (SEQ ID N0:7)和 CDR-L3 (SEQID NO:8)。在本發(fā)明的進一步實施方案中，具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體含所有3個如下輕鏈 CDR 序列,所述序列是 CDR-LKSEQ ID NO:6)、CDR_L2(SEQ ID NO:7)和 CDR-L3(SEQ ID NO:8)，并且含所有3個如下重鏈⑶R序列，所述序列是⑶R-Hl (SEQ ID NO:3)、CDR-H2 (SEQ ID NO:4)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:5)。在某些實施方案 中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD 154蛋白的抗CD 154抗體，其中抗體含選自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10 和 SEQ ID N0:lU9VH 序列。在某些其他實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154蛋白的抗CD154抗體，其中抗體含選自SEQID N0:12和SEQ ID N0:13的重鏈序列。在進一步實施方案中，含上述任一個以上的⑶R或者重鏈或輕鏈序列的抗體是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更進一步實施方案中，抗體是F (ab’)2片段或其衍生物。還包括了特異性結(jié)合⑶154蛋白的含⑶R或者重鏈或輕鏈序列的其他抗體片段或其衍生物?？蓪⑦@些抗體修飾為引發(fā)減少的效應(yīng)子功能或無效應(yīng)子功能。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及含選自SEQ ID NO=USEQ ID N0:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO: 11的Vh序列的抗⑶154抗體，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比，賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及含選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14的 '序列的抗CD154抗體,所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在一些實施方案中，抗體含SEQ ID NO: 2的可變輕鏈序列。在進一步實施方案中，含SEQ ID NO:2的抗體是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更進一步實施方案中，抗體是FCabO2片段或其衍生物。還包括了特異性結(jié)合⑶154蛋白的含⑶R或者重鏈或輕鏈序列的其他抗體片段或其衍生物。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及含選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 14的'序列，且進一步含選自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 的 Vh 序列的抗CD154抗體,所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及含SEQ ID NO:29的Vh序列和SEQ ID NO:30的\序列的抗CD154抗體,所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD 154蛋白的抗CD 154抗體，其中抗體含SEQ ID NO:15的輕鏈序列。在進一步實施方案中，含SEQ ID NO:15的輕鏈序列的抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)(例如具有改變的糖基化和/或其他修飾的Fe區(qū))。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列以及選自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的重鏈序列的抗⑶154抗體，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相t匕，賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)(例如具有改變的糖基化和/或其他修飾的Fe區(qū))。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含如SEQ ID NO:2或14中所示的輕鏈序列和如SEQ ID NO:1、9、10或11中所示的重鏈序列的抗⑶154抗體。在一些實施方案中，抗⑶154抗體可為抗體片段。在進一步實施方案中，抗體是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更進一步實施方案中，抗體是F (ab’)2片段或其衍生物。還包括了特異性結(jié)合⑶154蛋白的含CDR或者重鏈或輕鏈序列的其他抗體片段或其衍生物。此外，抗體可顯示出減少的效應(yīng)子功能。例如，含F(xiàn)e區(qū)的抗體可含具有一種以上的修飾(例如改變的糖基化、綴合等)的Fe區(qū)，從而使得抗體引發(fā)減少的效應(yīng)子功能或無效應(yīng)子功能。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及含SEQ ID NO:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:13的重鏈序列的抗CD154抗體,其中抗體進一步含 與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及含SEQ ID NO: 15的輕鏈序列和SEQ IDNO:12的重鏈序列的抗CD154抗體,其中抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及如下抗⑶154抗體，其含選自⑶R-HKSEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)中一個以上的重鏈 CDR 序列，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在某些實施方案中，抗CD 154抗體含至少2個所述重鏈CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3個如下重鏈 CDR 序列，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR_H2 (SEQ ID NO:43)和 CDR-H3(SEQ ID NO:44)。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及如下抗⑶154抗體，其含選自⑶R-LKSEQ ID NO:
45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:47)中一個以上的輕鏈 CDR 序列，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在某些實施方案中，抗CD 154抗體含至少2個所述輕鏈CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3個如下輕鏈 CDR 序列，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR_L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3(SEQ ID NO:47)。 本發(fā)明的進一步實施方案涉及如下抗CD154抗體,所述抗體含與天然或親本Fe區(qū)相比，賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)，其中抗體含所有3個如下輕鏈CDR序列，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:45)、CDR-L2 (SEQ ID NO:46)和 CDR-L3 (SEQ ID N0:47)，并且其中抗體含所有3個如下重鏈⑶R序列，所述序列是⑶R-Hl (SEQ ID NO:42)、⑶R-H2 (SEQID NO:43)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:44)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及如下抗⑶154抗體，其含選自⑶R-HKSEQ ID NO:48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:50)中一個以上的重鏈 CDR 序列，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在進一步實施方案中，抗CD154抗體含至少2個所述重鏈CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3 個如下重鏈 CDR 序列，所述序列是 CDR-Hl (SEQ ID NO:42)、CDR-H2 (SEQ ID N0:43)和CDR-H3 (SEQ ID NO:44)。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及如下抗⑶154抗體，其含選自⑶R-LKSEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQ ID NO:53)中一個以上的輕鏈 CDR 序列，所述抗體進一步含與天然或 親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在進一步實施方案中，抗體含至少2個所述輕鏈CDR，并且在其他實施方案中，抗體含所有3個如下輕鏈 CDR 序列，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3(SEQ ID NO:53)。在某些實施方案中，具有減少的效應(yīng)子功能的抗CD154抗體含所有3個如下輕鏈CDR 序列，所述序列是 CDR-Ll (SEQ ID NO:51)、CDR-L2 (SEQ ID NO:52)和 CDR-L3 (SEQID NO:53)，并且進一步含所有3個如下重鏈⑶R序列，所述序列是⑶R-Hl (SEQ ID NO:48)、CDR-H2 (SEQ ID NO:49)和 CDR-H3 (SEQ ID NO:50)。在進一步實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154的抗CD154抗體，其中抗體含SEQ ID N0:54的Vl序列。本發(fā)明還涉及含SEQ ID NO:56的Vh序列的抗CD154抗體。本發(fā)明的抗CD154抗體可含SEQ ID NO:54的Vl序列和SEQ ID勵:56的￥11序列。在進一步實施方案中，抗體是Fab或Fab’片段或其衍生物。在更進一步實施方案中，抗體或抗體片段是F (ab’)2片段或其衍生物。抗體或片段還可為人源化或全人抗體或其片段。本發(fā)明的某些實施方案涉及含SEQ ID NO:56的Vh序列和SEQ ID NO:54的\序列的抗CD154抗體，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比,賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。在進一步實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154的抗CD154抗體，其中抗體含SEQ ID N0:58的Vl序列。在另外的實施方案中，抗體含SEQ ID N0:6(^^VH序列。在進一步實施方案中，抗體或片段含SEQ ID NO:60的Vh序列和SEQ ID NO:58的\序列?？贵w可為Fab或Fab’片段或其衍生物。在更進一步實施方案中，抗體是F (ab’)2片段或其衍生物?？贵w還可為人源化或全人抗體或其片段。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及含SEQ IDNO:58的Vh序列和SEQ ID NO:60的\序列的抗⑶154抗體，所述抗體進一步含與天然或親本Fe區(qū)相比，賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。具有改變的糖基化的抗CD154抗體聚糖去除產(chǎn)生應(yīng)大大減少與跨物種的Fe受體家族的所有成員的結(jié)合的結(jié)構(gòu)變化。在糖基化抗體(包括抗CD154抗體)中，與Fe 二聚體的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點附著的聚糖(寡糖)在CH2結(jié)構(gòu)域之間包圍，使糖殘基與相對CH2結(jié)構(gòu)域上的特定氨基酸殘基接觸。不同糖基化模式與抗體的不同生物性質(zhì)相關(guān)(Jefferis和Lund, 1997, Chem.1mmunol,65:111-128 ;Wright 和Morrison, 1997,Trends Biotechnol, 15:26_32)。某些特定糖型賦予潛在有利的生物性質(zhì)。聚糖的喪失改變結(jié)構(gòu)域之間的間隔，并且增加其相對于彼此的流動性，并且預(yù)期對Fe受體家族的所有成員的結(jié)合具有抑制作用。例如，在用各種糖基化抗體的體外研究中已證實CH2聚糖的去除改變Fe結(jié)構(gòu)，從而使得與Fe受體和補體蛋白ClQ結(jié)合的抗體大大減少。減少效應(yīng)子功能的另一種已知方法是抑制Fe的CH2結(jié)構(gòu)域中的位置297(EU編號)處的N聯(lián)聚糖的產(chǎn)生，或去除Fe的CH2結(jié)構(gòu)域中的位置297 (EU編號)處的N聯(lián)聚糖(Nose et al., 1983PNAS80:6632 ；Leatherbarrow et al., 1985Mol.1mmunol.22:407 ；Tao et al., 1989J.1mmunol.143:2595 ；Lund et al., 1990Mol.1mmunol.27:1145 ；Doraiet al., 1991HybridomaIO:211 ；Hand et al., 1992Cancer Immunol.1mmunother.35: 165 ；Leader et al.,1991 Immunology72:481 ；Pound et al.,1993Mol.1mmunol.30:233 ；Boyd et al., 1995Mol.1mmunol.32:1311)。還已知不同糖型可顯著影響治療性質(zhì),包括藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、受體相互作用和組織特異性祀向(Graddis et al., 2002, Curr PharmBiotechnol.3:285_297)。尤其是,對于抗體,寡糖結(jié)構(gòu)可影響與蛋白酶抗性相關(guān)的性質(zhì)、由FcRn受體介導(dǎo)的抗體的血清半衰期、噬菌作用和抗體反饋、加上抗體效應(yīng)子功能(例如與補體復(fù)合物Cl結(jié)合，這誘導(dǎo)⑶C，和與Fe Y R受體結(jié)合，這負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)ADCC通路)(Nose和Wigzell, 1983 ;Leatherbarrow 和 Dwek,1983 ；Leatherbarrow et al., , 1985 ；ffalker etal., 1989 ；Carter et al., 1992, PNAS,89:4285_4289)。因此，調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)子功能的另一種方法包括改變抗體恒定區(qū)的糖基化。改變的糖基化包括例如許多糖基化殘基的減少或增多，糖基化殘基模式或位置的改變，以及糖結(jié)構(gòu)的改變。在人IgG上發(fā)現(xiàn)的寡糖影響其效應(yīng)子功能程度(Raju, Τ.S.BioProcessInternational Apri 12003.44-53)；人IgG寡糖的微觀不均勻性可影響生物學(xué)功能例如⑶C和ADCC、與各種Fe受體的結(jié)合和與Clq蛋白的結(jié)合(Wright A.& MorrisonSL.TIBTECH1997，1526-32 !Shields et al., J Biol Chem.2001276(9):6591-604 ；Shieldset al., J Biol Chem.2002 ；277 (30):26733-40 ；Shinkawa et al., J Biol Chem.2003278(5):3466-73 ；Umana et al.，Nat Biotechnol.1999Feb ；17 (2):176_80)。例如，IgG 結(jié)合Clq且活化補體級聯(lián)的能力可依賴定位在2個CH2結(jié)構(gòu)域之間的碳水化合物部分(這通常錨定在 Asn297 處)的存在、不存在或修飾(Ward 和 Ghetie, Therapeutic Immunology2:77_94(1995)。 含F(xiàn)e的多肽(例如抗體(例如IgG抗體))中的糖基化位點可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行鑒定。糖基化位點的鑒定可為實驗的或基于序列分析或建模數(shù)據(jù)。共有基序即由各種糖基轉(zhuǎn)移酶識別的氣基酸序列已得到描述。例如，N聯(lián)糖基化基序的共有基序通常是NXT或NXS,其中X可為除脯氨酸外的任何氨基酸。用于定位潛在的糖基化基序的幾種算法已得到描述。因此，為了鑒定抗體或含F(xiàn)e片段內(nèi)的潛在糖基化位點，抗體的序列例如通過使用可公開獲得的數(shù)據(jù)庫進行檢查，例如由Center for Biological Sequence Analysis提供的網(wǎng)站(關(guān)于預(yù)測N聯(lián)糖基化位點參見NetNGlyc服務(wù)器，和關(guān)于預(yù)測O聯(lián)糖基化位點參見NetOGlyc服務(wù)器)。體內(nèi)研究已證實無糖基抗體的效應(yīng)子功能中的減少。例如，無糖基抗CD8抗體無法耗盡小鼠中具有CD8的細(xì)胞(Isaacs，1992J.1mmunol.148:3062),并且無糖基抗⑶3抗體在小鼠或人中不誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放綜合征(上述Boyd (1995)的文章；Friend,1999Transplantation68:1632)。
重要的是，盡管CH2結(jié)構(gòu)域中聚糖的去除看起來對效應(yīng)子功能具有明顯影響，但抗體的其他功能和物理性質(zhì)仍未改變。尤其是，已顯示聚糖的去除對血清半衰期和與抗原的結(jié)合具有很少的影響或無影響(上述Nose (1983)的文章；上述Tao (1989)的文章；上述 Dorai (1991)的文章;上述 Hand (1992)的文章；Hobbs, 1992Mol.1mmunol.29:949)。盡管存在無糖基化方法的體內(nèi)驗證，但存在用無糖基mAbs的殘留效應(yīng)子功能的報告(參見例如，Pound, J.D.et al., (1993)Mol.Tmmunol 30 (3):233_41 ;Dorai,H.et al.,
(1991) HybridomalO (2):211_7)。Armour 等人顯不與 Fe Y RIIa 和 Fe Y RIIb 蛋白殘留的結(jié)合(Eur.J.1mmunol.(1999) 29:2613-1624 ；Mol.1mmunol.40 (2003) 585-593)。因此，效應(yīng)子功能特別是補體活化中的進一步減少，在一些情況下對于保證活性的完全取消可能是重要的。為此，設(shè)想了 IgG2和IgG4和G1/G4嫁接物的無糖基形式，因為在具有減少的效應(yīng)子功能的本發(fā)明的方法和抗體組合物中有用。去糖基化的和無糖基抗CD154抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD154抗體可進行修飾或改變，以引發(fā)減少的效應(yīng)子功能(與第二種CD 154特異性抗體相比)，同時任選保留Fe部分的其他有價值的屬性。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及具有減少的效應(yīng)子功能的無糖基抗CD154抗體，其特征在于在抗體的Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點處的修飾。Fe 二聚體的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點的修飾可導(dǎo)致無糖基抗CD154抗體。此修飾的例子包括Fe 二聚體的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點的突變，與CH2結(jié)構(gòu)域中的N聯(lián)位點附著的聚糖的去除，和糖基化的阻止。例如，可通過使重鏈CH2結(jié)構(gòu)域中的常規(guī)N聯(lián)Asn位點變成Gln殘基來產(chǎn)生無糖基抗CD154抗體(參見例如，W005/03175和US2006-0193856)。在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾含在重鏈糖基化位點處的突變，以阻止在該位點處的糖基化。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，無糖基抗CD 154抗體通過重鏈糖基化位點的突變(即N298Q(使 用Kabat EU編號的N297)的突變)進行制備，并且在合適的宿主細(xì)胞中表達。例如，這個突變可通過關(guān)于來自Amersham-Pharmacia Biotech (Piscataway,NJ, USA)的獨特位點誘變劑盒根據(jù)制造商推薦的方案來實現(xiàn)。突變抗體可在宿主細(xì)胞(例如NSO或CHO細(xì)胞)中穩(wěn)定表達，隨后進行純化。例如，純化可使用蛋白A和凝膠過濾層析來進行。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，還可使用另外的表達和純化方法。在本發(fā)明的另一實施方案中，無糖基抗CD154抗體具有減少的效應(yīng)子功能，其中在所述抗體或抗體衍生物的Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點處的修飾含CH2結(jié)構(gòu)域聚糖的去除，即去糖基化。這些無糖基抗CD154抗體可通過常規(guī)方法來產(chǎn)生，然后酶促去糖基化。用于抗體的酶促去糖基化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(Williams，1973 ；ffinkelhake&Nicolson,1976J.Biol Chem.251: 1074-80.)。在本發(fā)明的另一實施方案中，去糖基化可通過使產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長來達到，所述培養(yǎng)基含糖基化抑制劑例如衣霉素(Nose & Wigzell，1983)。S卩，修飾是在所述抗體的Fe部分的CH2結(jié)構(gòu)域中的保守N聯(lián)位點處的糖基化的減少或阻止。在本發(fā)明的其他實施方案中，重組CD154多肽(或含此多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜)可用作抗原，以產(chǎn)生抗CD154抗體或抗體衍生物，其隨后可進行去糖基化。在備選實施方案中，本發(fā)明的無糖基抗CD154抗體或具有減少的糖基化的抗CD154抗體，可通過Taylor等人(W005/18572和US2007-0048300)中所述方法來產(chǎn)生。例如，在一個實施方案中，抗CD154無糖基抗體可通過改變第一個氨基酸殘基(例如通過置換、插入、刪除、或通過化學(xué)修飾)來產(chǎn)生，其中改變的第一個氨基酸殘基通過空間位阻或電荷或兩者抑制第二個殘基的糖基化。在某些實施方案中，第一個氨基酸殘基通過氨基酸置換進行修飾。在進一步實施方案中，氨基酸置換選自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Asn、Gln、Trp> Pro、Ser、Thr、Tyr> Cys> Met、Asp、Glu、Lys> Arg 和 His。在其他實施方案中，氨基酸置換是非常規(guī)氨基酸殘基。第二個氨基酸殘基可接近或在糖基化基序內(nèi)，例如含氨基酸序列NXT或NXS的N聯(lián)糖基化基序。在一個示例性實施方案中，第一個氨基酸殘基是氨基酸299，和第二個氨基酸殘基是氨基酸297 (根據(jù)Kabat編號)。例如，第一個氨基酸置換可為 T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299K、T299R、T299G、T2991、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W和T299V (根據(jù)Kabat編號)。在具體實施方案中，氨基酸置換是T299C。效應(yīng)子功能也可這樣減少:通過修飾本發(fā)明的抗體，從而使得抗體含阻斷部分。示例性阻斷部分包括足夠空間位阻和/或電荷的部分，從而使得減少的糖基化發(fā)生，例如通過阻斷糖苷酶使多肽糖基化的能力。阻斷 部分可另外或備選地減少效應(yīng)子功能，例如通過抑制Fe區(qū)結(jié)合受體或補體蛋白的能力。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)，其含選自SEQ ID NO:5、44和50的重鏈CDR3序列，以及變體Fe區(qū)，所述變體Fe區(qū)含第一個氨基酸殘基和N糖基化位點，第一個氨基酸殘基經(jīng)側(cè)鏈化學(xué)進行修飾，以達到與未經(jīng)修飾的第一個氨基酸殘基相比，增加的空間位阻或增加的靜電電荷，從而減少在N糖基化位點處的糖基化水平或以其他方式改變在N糖基化位點處的糖基化。在某些這些實施方案中，與對照、非變體Fe區(qū)相比，變體Fe區(qū)賦予減少的效應(yīng)子功能。在進一步實施方案中，具有增加的空間位阻的側(cè)鏈?zhǔn)沁x自下述的氨基酸殘基的側(cè)鏈:Phe、Trp, His、Glu、Gin、Arg、Lys> Met和Tyr。在更進一步實施方案中，具有增加的靜電電荷的側(cè)鏈化學(xué)是選自下述的氨基酸殘基的側(cè)鏈:Asp、Glu、Lys> Arg和His。因此，在一個實施方案中，糖基化和Fe結(jié)合可通過用帶電側(cè)鏈化學(xué)(例如D、E、K或R)置換T299來調(diào)節(jié)。由于不利的靜電相互作用，所產(chǎn)生的抗體將具有減少的糖基化和與Fe受體減少的Fe結(jié)合親和力。在另一實施方案中，與其無糖基化抗體對應(yīng)物(參見例如W005/18572)相比，無糖基化且能夠形成半胱氨酸加合物的T299C變體抗體可顯示出更少的效應(yīng)子功能(例如Fe Y RI結(jié)合)。因此，接近糖基化基序的第一個氨基酸的改變可抑制在第二個氨基酸殘基處抗體的糖基化；當(dāng)?shù)谝粋€氨基酸殘基是半胱氨酸殘基時，抗體可顯示出更進一步減少的效應(yīng)子功能。此外，與其他亞型中的無糖基化的影響相比，IgG4亞型抗體的糖基化的抑制可能對Fe Y RI結(jié)合具有更顯著的影響。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及具有改變的糖基化的抗CD154抗體，其顯示出與一種以上的FcR受體減少的結(jié)合，并且任選還顯示出與一種以上的Fe受體和/或補體增加的或正常的結(jié)合(例如至少維持與天然、對照抗CD154抗體相同或相似的對于一種以上的Fe受體和/或補體的結(jié)合親和力的具有改變的糖基化的抗體)。例如，與其中Man5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)不占優(yōu)勢的抗CD154抗體群相比，具有占優(yōu)勢地Man5GlcNAc2N-聚糖作為存在的聚糖結(jié)構(gòu)的抗⑶154抗體(例如，其中Man5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)以比Ig組合物的下一個占優(yōu)勢聚糖結(jié)構(gòu)多至少約5摩爾百分比的水平存在)可顯示出改變的效應(yīng)子功能。具有占優(yōu)勢地這種聚糖結(jié)構(gòu)的抗體顯示出與Fe Y RIIa和Fe y RIIb減少的結(jié)合，與Fe YRIIIa和Fe Y RIIIb增加的結(jié)合，以及與Cl復(fù)合物的Clq亞單位增加的結(jié)合(參見US2006-0257399)。這種聚糖結(jié)構(gòu)當(dāng)它是占優(yōu)勢的聚糖結(jié)構(gòu)時，賦予增加的ADCC、增加的CDC、增加的血清半衰期、B細(xì)胞增加的抗體產(chǎn)生、和減少的經(jīng)由巨噬細(xì)胞的噬菌作用。一般而言，在糖蛋白上的糖基化結(jié)構(gòu)將依表達宿主和培養(yǎng)條件而變(Raju，TS.BioProcess International April 2003.44-53)。此差異可導(dǎo)致效應(yīng)子功能和藥代動力學(xué)中的變化(Israel et al., Immunology.1996 ；89 (4):573-578 ；Newkirk et al., P.Clin.Exp.1996 ;106(2):259_64)。例如，糖基化可隨著細(xì)胞培養(yǎng)條件改變，這可賦予一些免疫球蛋白組合物免疫原性，依賴其具體半乳糖模式(Patel et al., 1992.Biochem J.285:839-845)。由非人哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)趨于與人糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)更緊密相關(guān)。此外，蛋白表達宿主系統(tǒng)可進行改造或選擇，以表達占優(yōu)勢的Ig糖型，或備選地可天然產(chǎn)生具有占優(yōu)勢的聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。產(chǎn)生具有占優(yōu)勢糖型的糖蛋白的經(jīng)改造蛋白表達宿主系統(tǒng)的例子包括基因敲除/突變(Shields et al., 2002, JBC, 277 =26733-26740)；遺傳改造(Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17:176_180)或兩者的組合。備選地，
某些細(xì)胞天然表達占優(yōu)勢的糖型-例如，雞、人和牛(Raju et al., 2000, Glycobiology,
10:477-486)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過選擇許多表達宿主系統(tǒng)中的至少一種來獲得具有改變的糖基化(例如占優(yōu)勢地一種特定聚糖結(jié)構(gòu))的抗CD154抗體或抗體組合物的表達。可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD 154抗體的蛋白表達宿主系統(tǒng)包括動物、植物、昆蟲、細(xì)菌細(xì)胞等。例如，US2007-0065909,2007-0020725和2005-0170464描述了在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生無糖基化的免疫球蛋白分子。作為進一步的例子，Wright和Morrison在糖基化方面缺陷的CHO細(xì)胞系中產(chǎn)生了抗體(1994J Exp Medl80:1087-1096)，并且顯示在這種細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗體無法補體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。在本領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)的用于產(chǎn)生糖蛋白的其他表達宿主系統(tǒng)的例子包括:CH0細(xì)胞:Raju W099/22764和Presta W003/35835 ;雜交瘤細(xì)胞=Trebaket al., 1999, J.1mmuno l.Methods, 230:59_70 ;昆蟲細(xì)胞:Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970，和植物細(xì)胞:Gerngross et al.，W004/74499。就給定細(xì)胞或提取物已導(dǎo)致給定基序的糖基化的程度，用于測定基序是否被糖基化的領(lǐng)域公認(rèn)技術(shù)是可用的，例如使用凝膠電泳和/或質(zhì)譜法。用于改變抗體的糖基化位點的另外方法例如在US6，350，861和US5，714，350、W005/18572和W005/03175中描述；這些方法可用于產(chǎn)生具有改變、減少的糖基化或無糖基化的本發(fā)明的抗⑶154抗體。具有減少的效應(yīng)子功能的無糖基抗CD154抗體可為如下抗體，其含修飾或可綴合以含功能部分。此部分包括阻斷部分(例如，PEG部分、半胱氨酸加合物等)、可檢測部分(例如，熒光部分、放射性同位素部分、不透射線的部分等，包括診斷部分)，和/或治療部分(例如，細(xì)胞毒性劑、抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗感染劑、抗癌劑、抗神經(jīng)變性劑、放射性核素等)。杭體綴合物當(dāng)施用時，抗體通常從循環(huán)中快速清除，并且因此可引發(fā)相對短壽命的藥理學(xué)活性。因此，可能需要相對大劑量的抗體的頻繁注射，以維持抗體治療的治療效力。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體可為經(jīng)修飾(與其他部分例如異源功能部分綴合)的抗體，以增加抗體在體內(nèi)的完整性和壽命。例如，本發(fā)明的抗CD154抗體可為經(jīng)修飾以包括部分(功能部分)的抗體，所述部分可增加穩(wěn)定性，從而延長抗體的血清半衰期。本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗體)的血清半衰期可為至少3天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少I個月或更久。增加抗體的半衰期的此功能部分例如在其中抗體是抗體片段的實施方案中可為特別有用的?？贵w修飾也可增加蛋白在水溶液中的溶解性，消除凝集，增強蛋白的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，并且大大地減少蛋白的免疫原性和抗原性。因此，通過比用未修飾的蛋白更少的頻率或更低的劑量施用此聚合物-蛋白加合物可達到所需體內(nèi)生物活性。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是與異源功能部分附著的抗體，以形成抗體綴合物?！肮δ懿糠帧敝概c本發(fā)明的抗體結(jié)合的任何功能部分(例如，多肽、蛋白結(jié)構(gòu)域、載體、聚合物等)。與抗CD154抗體的結(jié)合可為共價或非共價附著，并且可為可逆或可調(diào)節(jié)的?？捎糜谛纬杀景l(fā)明的CD154抗體綴合物的示例性分子包括但不限于功能部分，例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其他抗體、抗體衍生物或抗體片段，合成的(例如PEG)或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、適體、放射性核素(特別是放射性碘、放射性同位素)、螯合金屬、納米顆粒和報告基團(例如熒光或發(fā)光化合物或者可通過成像技術(shù)(例如NMR或ESR光譜法)檢測的化合物)。在一個進一步的例子中，綴合有本發(fā)明的抗體的功能部分可增加抗體在體內(nèi)的半衰期，和/或減少抗體的免疫原性和/或增強抗體經(jīng)過上皮屏障遞送給免疫系統(tǒng)。這種類型的合適功能部分的例子包括聚合物、右旋糖、羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、白蛋白結(jié)合蛋白或白蛋白結(jié)合化合物，例如在PCT/GB2005/002084中所述那些。當(dāng)功能部分是聚合物時，一般而言，它可為合成或天然存在的聚合物，例如任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧亞烷基聚合物，或者支鏈或未分支多糖(例如同或異多糖)。參見例如 Veronese和Pasut, 2005,Drug Discovery Today, 10(21):1451_1458 ；Pasut et al., 2004, Expert Opinion in Therapeutic Patents,14 (6):859_894?？纱嬖谟谏鲜龊铣删酆衔锷系木唧w任選取代基包括一個以上的羥基、甲基或甲氧基。合成的聚合物的具體例子包括任選取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚乙烯醇或其衍生物，尤其是任選取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、右旋糖、糖原或其衍生物。在這個背景下的“衍生物”意欲包括反應(yīng)衍生物，例如硫醇選擇性反應(yīng)基團(例如馬來酰亞胺等)。反應(yīng)基團可直接或通過接頭區(qū)段與聚合物連接。應(yīng)當(dāng)理解，此基團的殘基在一些情況下將形成產(chǎn)物的部分，作為抗體片段和聚合物之間的連接基團。
需要時，可改變聚合物的大小，但平均分子量一般將為500Da — 50000Da，優(yōu)選5000Da - 40000Da且更優(yōu)選20000Da — 40000Da。聚合物大小可特別基于產(chǎn)物的預(yù)期用途進行選擇，所述用途例如定位至某些組織(例如腫瘤)或延長循環(huán)半衰期的能力(關(guān)于綜述，參見 Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545)。因此，例如，當(dāng)產(chǎn)物預(yù)期離開循環(huán)且滲透組織，例如用于在腫瘤治療中使用時，使用小分子量聚合物(例如具有約5000Da的分子量)可能是有利的。對于其中產(chǎn)物保留在循環(huán)中的應(yīng)用，使用較高分子量聚合物(例如具有在20000Da - 40000Da的分子量)可為有利的。
特別優(yōu)選的聚合物包括聚亞烷基聚合物，例如聚(乙二醇)(或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物)，且尤其具有約15000Da —約40000Da的分子量。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、抗體衍生物或抗體片段，包括具有減少的效應(yīng)子功能的抗體或片段，與聚亞烷基聚合物，特別是聚(乙二醇)(在本文中縮寫為PEG)或其衍生物附著。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體、抗體衍生物或抗體片段是如下抗體片段，其是Fab’或F(&13’)2片段或其衍生物，在重鏈或輕鏈或兩者上與PEG附著。這種Fab’或其F (&13’)2片段可為人或人源化的。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體是通過功能部分(例如水溶性聚合物的共價附著進行修飾的抗體，所述聚合物例如聚(乙二醇)、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)或聚(脯氨酸)，所有這些已知在靜脈內(nèi)注射后顯示出在血液中比相應(yīng)未經(jīng)修飾的蛋白基本上更長的半衰期。參見例如，Abuchowski et al., 1981.1n:〃Enzymes as Drugs", Holcenberg et al.,(編輯)1981.Wiley-1nter science, New York, NY, 367-383 (1981) ；Anderson, ff.F.1992.Human Gene Therapy.Science256:808_813 ；Newmark et al.，1982.J.App1.Biochem.4:185-189 ；Katre et al.，1987.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:1487-1491。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是與功能部分(例如聚(乙二醇)(PEG)部分)附著的抗體。在一個具體實施方案中，抗體是抗體片段，并且PEG分子可通過位于抗體片段中的任何可用的氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸功能基團進行附著，所述基團例如任何游離氨基、亞氨基、硫醇、羥基或羧基。此氨基酸可在抗體片段中天然存在，或可使用重組DNA方法改造到片段內(nèi)(參見例如US5，219，996 ;US5，667，425 ;W0 98/25971)。在另一實施方案中，本發(fā)明的Fab片段通過使其重鏈的C末端與一個以上的氨基酸附著來進行修飾，以允許功能部分的附著。優(yōu)選地，另外的氨基酸形成含可附著有功能部分的一個以上的半胱氨酸殘基的經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)。多個位點可用于附著2個以上PEG分子。在本發(fā)明的某些 方面，PEG分子可通過位于本發(fā)明的抗體片段中的至少一個半胱氨酸殘基的巰基進行共價連接。與經(jīng)修飾的抗體片段附著的每個PEG分子可與位于片段中的半胱氨酸殘基的硫原子共價附著。共價連接將一般是二硫鍵，或尤其是硫-碳鍵。當(dāng)巰基用作適當(dāng)活化的功能部分的附著點時，可使用例如硫醇選擇性衍生物(例如馬來酰亞胺和半胱氨酸衍生物)?；罨疨EG可用作如上所述經(jīng)PEG修飾的抗體片段的制備中的起始材料?；罨疨EG可為含硫醇反應(yīng)基團的任何PEG，所述反應(yīng)基團例如α-鹵羧酸或酯(例如碘乙酰胺、酰亞胺(例如馬來酰亞胺)、乙烯基砜或二硫化物)。在某些實施方案中，抗⑶154抗體綴合物可含2個PEG分子與2個馬來酰亞胺分子。起始材料可商購獲得(例如來自Nektar,之間是 Shearwater Polymers Inc.,Huntsville, AL,USA),或可使用常規(guī)化學(xué)操作由商購可得的起始材料進行制備。具體的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可從Nektar，之前是 Shearwater ；Rapp Polymere ;和 SunBio 獲得)和 M-PEG-SPA (可從 Nektar,之前是Shearwater 獲得)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是經(jīng)修飾的Fab片段，其是PEG化的，即具有與之共價附著的PEG (聚(乙二醇))，例如根據(jù)EP0948544中公開的方法(還參見〃Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications",1992,J.Milton Harris (編輯)，Plenum Press, New York, 〃Poly (ethyleneglycol) Chemistryand Biological Applications", 1997, J.Milton Harris 和 S.Zalipsky (編輯)，AmericanChemical Society, Washington DC 和〃Bioconjugation Protein Coupling Techniquesfor the Biomedical Sciences", 1998, M.Aslam 和 A.Dent, Grove Publishers, New York ；Chapman, A.2002, Advanced Drug Delivery Reviews2002, 54:531_545)。在一個例子中，PEG與鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸附著。在另一個例子中，經(jīng)PEG修飾的Fab片段具有與經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)中的單個巰基共價連接的馬來酰亞胺基團。賴氨酸殘基可與馬來酰亞胺基團共價連接，并且賴氨酸殘基上的每個胺基可與具有約20，OOODa分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物附著。與Fab片段附著的PEG的總分子量因此可為約40，OOODa0在另一實施方案中，功能部分是PEG，并且使用W098/25971和W004/72116中所述方法附著，其中賴氨酰-馬來酰亞胺基團與重鏈的C末端處的半胱氨酸殘基附著，并且賴氨酰殘基的每個氨基已與具有約20，OOODa分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基共價連接。與抗體附著的PEG的總分子量因此是約40，OOODa。在另一實施方案中，功能部分是PEG，并且使用W098/25971和W004/072116中所述方法與F(ab)2片段附著，其中賴氨酰-二馬來酰亞胺基團與每條Fab重鏈的C末端處的半胱氨酸殘基附著，并且賴氨酰殘基的每個氨基已與具有約20，OOODa分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基共價連接。與F (ab)2抗體附著的PEG的總分子量因此是約40，000Da。在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是Fab’抗體片段，其可為全人或人源化的，并且在重鏈、輕鏈或兩者中是PEG化的。在其他實施方案中，全人或人源化的抗體片段在一條或兩條重鏈、或者一條或兩條輕鏈、或者重鏈和輕鏈上是PEG化的。因此，在某些實施方案中，抗⑶154抗體是PEG連接的抗體(例如PEG連接的人抗體)，其中PEG與抗體在半胱氨酸或賴氨酸殘基處連接。在某些實施方案中，PEG化的抗CD154抗體具有至少24kD的流體動力學(xué)尺寸。在其他實施方案中，PEG的尺寸可任意變化于20kD - 60kD (包括端點)。在進一步實施方案中，PEG連接的抗CD154抗體具有至少200kD的流體動力學(xué)尺寸。在其中抗CD154抗體與PEG部分連接的本發(fā)明的實施方案中，相對于缺乏PEG部分的抗⑶154抗體，PEG化的抗⑶154抗體可具有增加的體內(nèi)半衰期。在某些實施方案中，本發(fā)明提供含SEQ ID NO:15的輕鏈序列和SEQ ID NO:13的重鏈序列的⑶154結(jié)合蛋白，其中蛋白是PEG化的。在改善本發(fā)明抗體的體內(nèi)完整性和壽命方面可有用的其他功能部分包括多肽。例如，本發(fā)明的抗CD154抗體或抗體片段可進行修飾，以包括人血清白蛋白(HSA)多肽。與未綴合的抗體或抗原結(jié)合片段相比，此抗體綴合物可顯示出增加的穩(wěn)定性和增加的血清半衰期。例如，在某些實施方案中，相對于未綴合的抗CD 154抗體，與HSA綴合的抗CD 154抗體可顯示出增加的體內(nèi)半衰期。HSA綴合抗體的半衰期(t α -或t β -半衰期)可增加10%、20%、30%、40%、50%或更多。例如，ta-半衰期可在0.25分鐘一 12小時范圍內(nèi)，而t β -半衰期可例如在12 — 48小時內(nèi)。t a -或t β -半衰期可優(yōu)選是至少3天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少I個月或更久。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體是經(jīng)功能部分修飾(通過用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記)的抗體，所述可檢測標(biāo)記例如放射性同位素、酶、染料或生物素、或其他親和劑。在本發(fā)明的一些實施方案中， 本發(fā)明的抗CD154抗體是經(jīng)功能部分修飾(與治療劑綴合)的抗體，所述治療劑例如放射性同位素或放射性核素(例如IllIn或90Y)、毒素部分(例如，破傷風(fēng)類毒素或蓖麻蛋白)、類毒素或化學(xué)治療劑(U.S.6，307, 026)。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體是通過與顯像劑綴合修飾的抗體。顯像劑可包括例如用于容易分離或檢測的標(biāo)記部分(例如，生物素、熒光部分、放射性部分、組氨酸或myc標(biāo)簽或其他肽標(biāo)簽)。用于本發(fā)明的抗CD154抗體的修飾或與本發(fā)明的抗CD154抗體綴合的功能部分的進一步例子，可包括血清毒素或細(xì)胞毒性劑，包括對于細(xì)胞有害(例如殺死)的任何制劑。例子包括(301]11^68丨31:；[118、(10138丨31:；[118、埃博霉素、星形孢菌素、類美坦素、8卩011〖丨8丨31:；[118、根霉素、軟海綿素、桿孢菌素、哈米特林、泰素、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。在綴合中有用的功能部分包括但不限于，抗葉酸劑(例如氨基蝶呤和氨甲蝶呤)、抗代謝藥(例如氨甲蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化劑(例如氮芥、噻替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和羅莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C、和順鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)(例如柔紅霉素(之前是道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(之前是放線菌素)、博來霉素、光輝霉素、氨茴霉素(AMC)、卡奇霉素或多卡米星、CC-1065、enedieyenes、新制癌菌素)、和抗有絲分裂藥(例如長春新堿和長春堿)。關(guān)于進一步的細(xì)節(jié)，參見Garnett，2001，Advanced drug Delivery Reviews53:171_216。其他功能部分可包括螯合放射性核素，例如1311、mIn和9°Y、Lu177、鉍213、锎252、銥192和鎢188/錸188、211砹；或藥物例如但不限于烷基磷酸膽堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、紫杉烷和舒拉明。進一步的功 能部分包括蛋白、肽和酶。感興趣的酶包括但不限于，蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶。感興趣的蛋白、多肽和肽包括但不限于，免疫球蛋白、毒素(例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白Α、假單胞菌外毒素、或白喉毒素)、類美坦素(例如，但不限于DM1)、蛋白(例如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生的生長因子或組織型纖溶酶原激活物)、血栓形成劑或抗血管生成劑(例如血管他丁或內(nèi)皮他丁)、血管生成素、白樹毒素、dolstatins、小溝結(jié)合劑、bis-1do-phenol mustard、或生物應(yīng)答修飾劑(例如淋巴因子、白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、白介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或其他生長因子)。其他功能部分可包括例如在診斷中有用的可檢測物質(zhì)?？蓹z測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性核素、正電子發(fā)射金屬(用于在正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)中使用)、和非放射性順磁金屬離子。關(guān)于可與抗體綴合用于用作診斷劑的金屬離子，一般參見US4，741，900。合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括鏈霉親和素、抗生物素蛋白和生物素；合適的熒光材料包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯和藻紅蛋白；合適的發(fā)光材料包括魯米諾；合適的生物發(fā)光材料包括螢光素酶、螢光素和水母素；并且合適的放射性核素包括1251、1311、mIn和"Tc。鍾在某些方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)的核酸。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及分離的、重組的和/或合成的DNA分子，其含選自下述一個以上的序列:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:2USEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQID NO:6USEQ ID NO:67, SEQ ID NO:70 和 SEQ ID NO:73。在另一個方面，本公開內(nèi)容的特征在于含編碼多肽的一種以上的序列的分離核酸，所述多肽包括與 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2 ；SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11、SEQ ID NO:14 ；SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:60的 可變結(jié)構(gòu)域序列的序列至少80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或100% 等同的序列，或與編碼 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60的可變結(jié)構(gòu)域的序列的核酸雜交(例如在嚴(yán)格條件下)的序列。本發(fā)明的核酸可進一步包括調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子序列、非翻譯的5’區(qū)和非翻譯的3’區(qū))和/或載體序列。例如，核酸構(gòu)成載體。在更進一步實施方案中，本發(fā)明涉及含載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可產(chǎn)生抗體，從而使得抗體顯示出減少的糖基化或無糖基化(例如,如果Fe區(qū)存在)。本發(fā)明還涉及上述核酸的序列變體。例如，本發(fā)明包括與本文提供的任何序列約75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約99%、99.5%,99.9%或100%等同的核酸序列，包括其片段和針對其的互補體。本發(fā)明還包括由于遺傳密碼的簡并性與本文具體提供的序列不同的核酸。此外，本發(fā)明包括與本文提供的任何核酸特異性雜交的序列。術(shù)語“特異性雜交”指核酸序列與本文提供的序列或針對其的序列互補體的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50或100個連接核苷酸雜交的能力，從而使得它具有與對照核酸(例如，非特異性DNA或除本文提供的具體抗體序列外的DNA)小于15%、優(yōu)選小于10%、和更優(yōu)選小于5%的背景雜交。各種雜交條件可用于檢測特異性雜交，并且嚴(yán)格性主要由雜交測定法的洗滌步驟決定。一般而言，高溫和低鹽濃度產(chǎn)生高嚴(yán)格性，而低溫和高鹽濃度產(chǎn)生低嚴(yán)格性。通過在例如約
2.0XSSC中在50°C下洗滌達到低嚴(yán)格性雜交，并且用約0.2XSSC在50°C下達到高嚴(yán)格性。編碼本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白的核酸可含前導(dǎo)或信號序列。前導(dǎo)和信號序列可改變，并且可用備選前導(dǎo)序列取代，并且應(yīng)當(dāng)理解，在某些實施方案中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白含無前導(dǎo)序列的序列?？墒褂萌魏魏线m的備選前導(dǎo)或信號序列。宿豐細(xì)朐本發(fā)明涉及經(jīng)改造以表達圖2 - 8、10、11和13 — 16中提供的任何DNA分子，包括其序列變體的宿主細(xì)胞。還提供表達本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)的宿主細(xì)胞。無論結(jié)合蛋白還是抗體，它可僅含一條鏈，在該情況下，僅需要將編碼那條多肽鏈的DNA序列用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對于含2條鏈的抗體的產(chǎn)生，細(xì)胞系可用2種載體進行轉(zhuǎn)染。備選地，合適時，單個載體可編碼2條鏈序列，例如抗CD154抗體的輕鏈和重鏈，以及變化，依賴待表達的具體抗體結(jié)構(gòu)。宿主細(xì)胞可為例如原核細(xì)胞例如大腸桿菌，或其他微生物細(xì)胞，或真核細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞，例如人、小鼠、猴、兔、山羊、倉鼠或大鼠細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，禽類細(xì)胞，植物細(xì)胞和低等真核細(xì)胞例如真菌細(xì)胞(參見下文)。應(yīng)當(dāng)理解宿主細(xì)胞機制負(fù)責(zé)使重組表達的蛋白糖基化，并且因此可選擇具體糖基化模式，以進一步改變本發(fā)明的抗體的效應(yīng)子功能。在本發(fā)明的一些實施方案中，用于實踐本發(fā)明的宿主細(xì)胞可為例如(I)細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈霉菌屬(Streptomyces)物種和枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)胞、和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium) ； (2)真菌細(xì)胞和曲霉菌屬(Aspergillus)細(xì)胞、酵母細(xì)胞，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccha romyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、其他畢赤酵母屬物種、乳酸克魯維氏酵母(K.1actis), (3)昆蟲細(xì)胞系，例如來自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的細(xì)胞(如Sf9和Sf21細(xì)胞系，以及expresSF 細(xì)胞(Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA))、果妮屬 S2 細(xì)胞，和粉紋葉蛾(Trichoplusia ni) High Five Cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ; (4)哺乳動物細(xì)胞，或(5)植物細(xì)胞。因此，本發(fā)明的⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)可在任何可用的原核或真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述細(xì)胞能夠被改造以表達外源核酸序列。可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD154抗體的低等真核宿主細(xì)胞包括本領(lǐng)域中所述那些細(xì)胞(參見例如，W002/00879, W003/056914, W004/074498, W004/074499, Choi et al.，2003, PNAS, 100:5022-5027 ;HamiIton et al.，2003，Nature,301:1244-1246 和 Bobrowicz et al.，2004，Glycobiology, 14:757_766)。一般的哺乳動物細(xì)胞包括COSl和C0S7細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO骨髓瘤細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、293細(xì)胞、HEPG2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C127、3T3、BHK、Bowes黑素瘤細(xì)胞、L 細(xì)胞、MDCK、HEK293、WI38、鼠類 ES 細(xì)胞系(例如，來自品系 129/SV、C57/BL6、DBA-U129/SVJ)、K562、Jurkat細(xì)胞和BW5147。本發(fā)明因此提供表達本發(fā)明的抗體的細(xì)胞，包括但不限于雜交瘤細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞，以及經(jīng)重組修飾以表達本發(fā)明的抗體的哺乳動物和人宿主細(xì)胞(例如成人胚胎干細(xì)胞)。其他有用的哺乳動物細(xì)胞系是眾所周知的，并且可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)(Manassas, VA, USA)和在 Coriell Cell Repositories(Camden,NJ,USA)的 National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) HumanGenetic Cell Repository容易地獲得。這些細(xì)胞類型僅是代表性的，并且這個列表不意味著是詳盡列表。在其他考慮中，其中一些是上述，宿主細(xì)胞可就其以所需方式處理所表達的抗CD154抗體的能力進行選擇。除經(jīng)修飾的糖基化和無糖基化外，多肽的此翻譯后修飾包括但不限于乙?；?、羧化、羧甲基化、磷酸化、脂化和?；?。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的抗CD 154抗體通過無細(xì)胞翻譯或在體外合成進行制備。編碼這些蛋白的基因可在體外合成。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體在含抗體表達細(xì)胞的生物反應(yīng)器中進行生產(chǎn)，以便促進大規(guī)模生產(chǎn)。在另一實施方案中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白或抗CD154抗體在乳中表達抗體的經(jīng)遺傳改造或轉(zhuǎn)基因哺乳動物(例如，山羊、牛、綿羊)中進行生產(chǎn)，以便促進抗⑶154抗體的大規(guī)模生產(chǎn)(US5, 827，690 ；Pollock et al.，1999.J.1mmunol.Meth.231( 1-2):147_57)。治療方法在本發(fā)明的一個實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者中的免疫應(yīng)答。以有效抑制量給受試者施用本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的藥物組合物。在某些實施方案中，抗CD154抗體或含所述抗體的藥物組合物的“有效抑制量”是有效抑制施用了所述抗體或藥物組合物的受試者中的CD154-CD40相互作用的任何量。確定“抑制量”的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且依賴包括但不限于下述的因素:涉及的受試者類型、受試者的大小和年齡以及遞送的具體治療劑的藥代動力學(xué)性質(zhì)。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠通過抑制CD154-CD40相互作用而抑制免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制炎癥。為了本發(fā)明的目的，炎癥應(yīng)答的特征在于發(fā)紅、腫大、發(fā)熱和疼痛，作為毛細(xì)血管膨脹與水腫和吞噬性白細(xì)胞的遷移的結(jié)果。炎癥應(yīng)答的一些例子包括:關(guān)節(jié)炎、接觸性皮炎、高IgE綜合征、炎性腸病、變應(yīng)性哮喘和特發(fā)性炎性疾病。特發(fā)性炎性疾病包括例如牛皮癬和狼瘡(例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)、藥物誘發(fā)性紅斑狼瘡、和狼瘡 mephritis)。參見例如，Gallinl989.Fundamental Immunology,第 26 章，RavenPress，第2版，第721-733頁，New York。本發(fā)明提供治療或預(yù)防個體中的全身性紅斑狼瘡(SLE)癥狀的方法，所述方法包括以有效治療或預(yù)防SLE癥狀的量給個體施用單價CD154結(jié)合蛋白，例如單價抗CD 154抗體。關(guān)節(jié)炎的一些例子包括:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非類風(fēng)濕性炎性關(guān)節(jié)炎、與萊姆病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎和炎性骨關(guān)節(jié)炎。特發(fā)性炎性疾病的一些例子包括:牛皮癬和全身性狼瘡。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗CD154抗體或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者對移植器官的排斥。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者對移植心臟、腎、肝、皮膚、胰島細(xì)胞或骨髓的排斥。在本發(fā)明的一個實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者中的移植物抗宿主病。在本發(fā)明的一個實施方案中，⑶154結(jié)合蛋白(例如抗⑶154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者中的變應(yīng)性應(yīng)答，例如花粉熱或者對青霉素或其他藥物的過敏癥。 在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制患有自身免疫疾病的受試者中的自身免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，自身免疫應(yīng)答與選自下述的病狀相關(guān)或源自選自下述的病狀:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、全身性紅斑狼瘡、格雷夫斯氏病、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、糖尿病、炎性腸病、克羅恩氏病、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、藥物誘發(fā)性自身免疫疾病、或藥物誘發(fā)性狼瘡。在某些實施方案中，自身免疫應(yīng)答與全身性紅斑狼瘡相關(guān)或源自全身性紅斑狼瘡。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制患有自身免疫應(yīng)答的受試者中的自身免疫應(yīng)答，所述自身免疫應(yīng)答源自傳染病。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制患有自身免疫應(yīng)答的受試者中的自身免疫應(yīng)答，所述自身免疫應(yīng)答源自萊特氏綜合征、椎關(guān)節(jié)炎、萊姆病、HIV感染、梅毒或肺結(jié)核。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者中的纖維化。纖維化的一些例子包括:肺纖維化或纖維變性疾病。肺纖維化的一些例子包括:成人呼吸窘迫綜合征繼發(fā)的肺纖維化、藥物誘發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、或過敏性肺炎。纖維變性疾病的一些例子包括:丙型肝炎；乙型肝炎；肝硬化；毒素?fù)p傷繼發(fā)的肝的硬化；藥物繼發(fā)的肝的硬化；病毒感染繼發(fā)的肝的硬化；和自身免疫疾病繼發(fā)的肝的硬化。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制胃腸道疾病。胃腸道疾病的一些例子包括:食管活動不良、炎性腸病(包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、胃炎、膠原性結(jié)腸炎(包括淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎和微觀結(jié)腸炎)、腹部 疾病(也稱為麩質(zhì)腸病、腹腔口炎性腹瀉或麩質(zhì)耐受不良)和硬皮病。 在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制血管疾病。血管疾病的一些例子包括:動脈粥樣硬化、腎動脈疾病、淋巴水腫、局部缺血性病癥和再灌注損傷。還包括了膠原血管/免疫復(fù)合物疾病，例如全身性紅斑狼瘡或冷球蛋白血癥。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制患有T細(xì)胞癌癥的受試者中的T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞增殖，所述T細(xì)胞癌癥例如T細(xì)胞白血病或淋巴瘤。此抗CD154抗體或含所述抗體的藥物組合物，可以有效抑制受試者中的T細(xì)胞腫瘤細(xì)胞增殖的量施用于受試者。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠抑制受試者的T細(xì)胞通過人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型(HTLV I)的病毒感染。此抗CD154抗體或含所述抗體的藥物組合物可以有效抑制病毒感染的量施用于受試者。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠使受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞成像，所述細(xì)胞表達本發(fā)明的抗體與之特異性結(jié)合的CD154蛋白。用于使受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞成像的方法包括下述步驟:在允許抗體和腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞表面上的蛋白之間形成復(fù)合物的條件下，給受試者施用有效量的本發(fā)明的抗CD154抗體或含其的組合物；并且使所形成的任何抗體/蛋白復(fù)合物成像，從而使受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞成像。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的CD 154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠檢測受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞的存在，所述細(xì)胞表達本發(fā)明的抗體與之特異性結(jié)合的CD154蛋白。用于檢測受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞的存在的一個此方法包括下述步驟:在允許抗體和蛋白之間形成復(fù)合物的條件下，給受試者施用有效量的本發(fā)明的抗CD154抗體或含其的藥物組合物；從受試者中去除任何未結(jié)合的顯像劑；并且檢測所形成的任何抗體/蛋白復(fù)合物的存在，此復(fù)合物的存在指示受試者中的腫瘤細(xì)胞或贅生細(xì)胞的存在。藥物纟目合物本發(fā)明提供含如本發(fā)明中所述的CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD154抗體)的藥物組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物含本發(fā)明的至少一種CD154結(jié)合蛋白(例如抗CD 154抗體)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的無糖基抗CD154抗體(或具有減少的效應(yīng)子功能的其他抗CD154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，能夠與CD154抗原(例如，由保藏號為ATCC N0.PTA-4931的細(xì)胞系產(chǎn)生的無糖基hu5c8特異性結(jié)合的⑶154抗原)結(jié)合，并且其中無糖基抗⑶154抗體的特征在于具有N298Q (使用EU Kabat編號的N297)的突變，并且進一步顯示出減少的效應(yīng)子功能，如本文其他處所述。在本發(fā)明的某些實施方案中，無糖基抗CD154抗體(或具有減少的效應(yīng)子功能的其他抗CD154抗體)或含所述抗體的藥物組合物，不與效應(yīng)子受體結(jié)合。在一個更具體的實施方案中，無糖基抗CD 154抗體或含所述抗體的藥物組合物，能夠與由保藏號為ATCCN0.PTA-4931的細(xì)胞系產(chǎn)生的無糖基hu5c8特異性結(jié)合的⑶154蛋白結(jié)合，并且其中無糖基抗CD154抗體或藥物組合物 不與效應(yīng)子受體結(jié)合。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，無糖基抗CD154抗體(或具有減少的效應(yīng)子功能的其他抗CD154抗體或CD154結(jié)合蛋白)或含所述抗體的藥物組合物，不引起血栓形成，包括血栓栓塞事件。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，無糖基抗CD154抗體或含所述抗體的藥物組合物，能夠與由保藏號為ATCC N0.PTA-4931的細(xì)胞系產(chǎn)生的無糖基hu5c8特異性結(jié)合的CD154蛋白結(jié)合，并且其中無糖基抗CD154抗體或藥物組合物不引起血栓形成。在本發(fā)明的另一實施方案中，藥物組合物可進一步含任一種以上的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑、遞送媒介物、緩沖劑和/或穩(wěn)定劑。用于配制和施用本發(fā)明的抗體的示例性技術(shù)可例如見于〃Remington’ s Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing C0.,Easton, PA,最近版本。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，藥學(xué)上可接受的載體是磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、水、檸檬酸鹽/蔗糖/Tween制劑和乳狀液(例如油/水乳狀液)。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可在微囊化裝置中遞送，以便減少或阻止針對組合物的宿主免疫應(yīng)答。結(jié)合劑例如本發(fā)明的抗體或抗體片段也可微囊化于膜中而遞送，例如脂質(zhì)體或其他膠囊化或免疫保護的遞送媒介物。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可以無菌注射劑的形式，例如無菌可注射水或油懸浮液。這種懸浮液可使用合適的分配、濕潤和懸浮劑，根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行配制。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物可經(jīng)口、局部或靜脈內(nèi)遞送。當(dāng)全身性施用時，治療組合物應(yīng)是無菌、基本上無熱原的且在腸胃外可接受的溶液中，所述溶液已考慮pH、等滲性和穩(wěn)定性。例如，藥物組合物基本上不含致熱材料，以便適合于作為人治療施用。這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，對于口部施用，藥物組合物在合適的膠囊、片劑、水懸浮液或溶液中配制。用于口部施用的組合物的固體制劑可含合適的載體或賦形齊U，例如玉米淀粉、明膠、乳糖、阿拉伯膠、蔗糖、微晶纖維素、白陶土、甘露醇、磷酸二鈣、磷酸鈣、氯化鈉或海藻酸?？墒褂玫谋澜鈩┌ǖ幌抻谖⒕Юw維素、玉米淀粉、淀粉羥乙酸鈉和海藻酸?？墒褂玫钠瑒┙Y(jié)合劑包括阿拉伯膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮(Povidone )、羧丙基甲基纖維素、蔗糖、淀粉和乙基纖維素?？墒褂玫臐櫥瑒┌ㄓ仓徭V、硬脂酸、硅酮流體、滑石、蠟、油和膠體硅。在本發(fā)明的一個更具體的實施方案中，對于局部應(yīng)用，藥物組合物可在合適的軟膏中配制。用于局部使用的組合物制劑的一些例子包括:含活性成分和各種支持物和媒介物的滴劑、II劑、洗劑、乳膏劑、溶液和軟膏。在本發(fā)明的一個 實施方案中，局部半固體軟膏制劑一般含在載體(例如藥學(xué)膏基)中約I 一 20% (例如5 - 10%)濃度的活性成分。在本發(fā)明的一個實施方案中，還可容易地制備用于吸入和經(jīng)皮組合物的藥物組合物。治療組合物可通過鼻或肺施用，例如作為液體或粉末氣溶膠(凍干的)。在本發(fā)明的一個實施方案中，在水或其他水媒介物中制備用于口部施用的藥物組合物的液體制劑可含各種懸浮劑，例如甲基纖維素、海藻酸鹽、黃蓍膠、果膠、kelgin、角叉菜膠、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。本發(fā)明的藥物組合物的液體制劑還可包括溶液、乳狀液、糖漿劑和酏劑，其連同活性化合物含濕潤劑、甜味劑以及著色和調(diào)味劑。藥物組合物的各種液體和粉末制劑可通過常規(guī)方法進行制備，以用于吸入待治療的哺乳動物的肺內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于注射的藥物組合物的液體制劑可含各種載體，例如蔬菜油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蘧酸異丙酯、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)等。在一些實施方案中，組合物包括檸檬酸鹽/蔗糖/Tween載體。對于靜脈內(nèi)注射，組合物的水溶性形式可通過滴注法進行施用，其中輸注含抗真菌劑和生理學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制劑。生理學(xué)上可接受的賦形劑可包括例如5%右旋糖、0.9%鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。組合物的合適的不溶性形式可作為在水基或藥學(xué)上可接受的油基(例如長鏈脂肪酸酯(例如油酸乙酯))中的懸浮液進行制備且施用。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物含在藥學(xué)上可接受的載體中的0.1 — 90重量％ (例如，1- 20%或I 一 10%)的本發(fā)明的抗⑶154抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，在每種藥物組合物中的本發(fā)明的抗CD154抗體的最佳百分比根據(jù)制劑其自身以及具體病理狀態(tài)和相關(guān)治療方案中所需的療效而變化。藥物制劑是本領(lǐng)域良好確定的。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法可用于給受試者施用藥物組合物。
因此，本發(fā)明的藥物組合物涉及延長釋放制劑。延長釋放或控制釋放或緩慢釋放指如下藥物制劑，其在施用于受試者后經(jīng)過時間段釋放活性藥物，例如多肽或抗體藥物。可在所需時間范圍(例如，分鐘、小時、天、周或更久，依賴藥物制劑)內(nèi)發(fā)生延長釋放的多肽藥物不同于基本上整個劑量單位可經(jīng)由血流立即被吸收或立即被分配的標(biāo)準(zhǔn)制劑。在某些實施方案中，延長釋放制劑可導(dǎo)致來自單次施用的循環(huán)藥物水平持續(xù)例如8小時以上、12小時以上、24小時以上、36小時以上、48小時以上、60小時以上、72小時以上84小時以上、96小時以上、或甚至例如I周或2周或更久、例如I個月以上。延長釋放組合物可含本發(fā)明的單價抗CD154抗體。在進一步實施方案中，單價抗體是人源化或全人抗體。在進一步實施方案中，抗CD154抗體，抗CD154抗體是如本文所述具有減少的效應(yīng)子功能的抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，藥物組合物進一步含免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物。例如，此免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物可為下述之一:中斷經(jīng)由CD28的T細(xì)胞共刺激信號的制劑；中斷鈣神經(jīng)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的制劑、皮質(zhì)類固醇、抗增殖劑、與免疫細(xì)胞表面上表達的蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述免疫細(xì)胞表面上表達的蛋白包括但不限于⑶45、⑶2、IL2R、⑶4、CD8 和 RANK FcR、B7、CTLA4、TNF, LT β 和 VLA-4。 在本發(fā)明的一些實施方案中，免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物是他克莫司、西羅莫司、霉酹酸嗎啉乙酯或其活性形式霉酹酸、mizorubine、脫氧精胍菌素、布喹那鈉、來氟米特、雷帕霉素或氮雜螺烷。在本發(fā)明的其他 實施方案中，本發(fā)明的抗體或含其的藥物組合物可單獨或作為試劑盒的部分與標(biāo)簽和施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。施用和遞送涂徑本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可以醫(yī)學(xué)上可接受的任何方式施用于受試者。為了本發(fā)明的目的，“施用”意指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的施用抗體、抗體片段和藥物組合物的任何標(biāo)準(zhǔn)方法，并且不應(yīng)限制于本文提供的例子。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可通過靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、髓內(nèi)、心室內(nèi)、硬膜內(nèi)、動脈內(nèi)、血管內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、脊柱內(nèi)、瘤內(nèi)、顱內(nèi)注射；通過腸內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)粘膜、子宮內(nèi)或舌下施用途徑、或局部(例如在炎癥或腫瘤生長位點處)施用于受試者。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)口或經(jīng)鼻，或通過吸入、眼、直腸或局部途徑施用于受試者。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可以膠囊、片劑、水懸浮液或溶液的形式經(jīng)口施用于受試者。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可通過乳膏、軟骨等的應(yīng)用局部施用于受試者。在本發(fā)明的其他實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物也可通過使用噴霧器、干粉吸入器或計量吸入器通過吸入進行施用。在本發(fā)明的進一步實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可通過持續(xù)釋放施用、通過諸如在手術(shù)過程中直接應(yīng)用的易蝕植入劑的積存注射的方式、或通過輸注泵的植入或生物相容性持續(xù)釋放植入受試者內(nèi)而施用于受試者。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可通過可注射積存施用途徑，例如通過使用1、3或6個月積存可注射或生物可降解材料和方法施用于受試者。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可這樣施用于受試者:通過給受試者的皮膚應(yīng)用含抗體、抗體衍生物或藥物組合物的經(jīng)皮貼劑，并且使貼劑與受試者的皮膚接觸，一般I 一 5小時/貼劑。在本發(fā)明的其他實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可以任何劑量/體重和醫(yī)學(xué)上可接受的任何劑量頻率施用于受試者?？山邮軇┝堪s0.01 -200mg/kg受試者體重的范圍。在使用本發(fā)明的抗體或藥物組合物的任何方法中，抗體或藥物組合物可每天、每2、3、4、5或6天、每周、每月或任何期段或其倍數(shù)期段以單次或多次劑量施用于受試者，并且可進一步根據(jù)技術(shù)人員的決定以每天到隔月的間隔重復(fù)施用于受試者。在使用本發(fā)明的抗體或藥物組合物的任何方法中，結(jié)合蛋白、抗體或含其的藥物組合物可以如醫(yī)學(xué)上指示的長時間間隔(數(shù)天或數(shù)周到受試者的壽命)施用于有此需要的受試者。在進一步實施方案中，本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可以每天到隔月的間隔重復(fù)施用于受試者。在本發(fā)明的一個實施方案中，可根據(jù)需要將本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物以多次劑量/天進行施用，以達到總所需日劑量。治療方法的有效性可通過監(jiān)控受試者的病癥的已知體征或癥狀來評估。對于本發(fā)明的所有實施方案，有效產(chǎn)生所需效應(yīng)的本發(fā)明的抗CD154抗體和本發(fā)明的藥物組合物的給藥和劑量率將依賴各種因素，例如待治療疾病的性質(zhì)、受試者的大小和年齡、治療目的、所使用的具體藥物組合物、活性劑的藥代動力學(xué)和治療醫(yī)生的判斷。因此，本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物將以有效達到其預(yù)期用途的量進行施用。治療有效量可指有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或延長待治療受試者的存活的抗體量。治療有效量可通過改變受試者抗體的施用劑量和給藥方案來達到。本發(fā)明的抗⑶154抗體和本發(fā)明的藥物組合物可作為單次劑量施用于某些適應(yīng)癥，例如預(yù)防針對暴露于受試者短暫時間的抗原的免疫應(yīng)答，例如在治療一天時施用的外源性抗原。此治療的例子將包括本發(fā)明的抗體片段連同治療劑的同時施用，所述治療劑例如抗原藥物、變應(yīng)原或血液產(chǎn)品、或基因治療載體。在抗原長期存在的適應(yīng)癥中，例如在控制針對移植組織或長期施用的抗原藥物的免疫應(yīng)答中，本發(fā)明的抗體片段或藥物組合物以如醫(yī)學(xué)上指示的長時間間隔(數(shù)天或數(shù)周到受試者的壽命)進行施用。在本文所述任何方法中，抗體或藥物組合物可與第二種制劑一起施用于受試者。在某些實施方案中，制劑是治療劑，例如免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制劑。免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制劑可為下述任何:
(a)中斷經(jīng)由⑶28的T細(xì)胞共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的制劑；(b)中斷鈣神經(jīng)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的制劑，(C)皮質(zhì)類固醇，(d)抗增殖劑；和(e)與免疫細(xì)胞表面上表達的蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述免疫細(xì)胞表面上表達的蛋白包括但不限于 CD45、CD2、IL2R、CD4、CD8 和 RANK FcR、B7、CTLA4、TNF、LT β 和 VLA-4。免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物可為例如他克莫司、西羅莫司、霉酚酸嗎啉乙酯、mizorubine、脫氧精胍菌素、布喹那鈉、來氟米特、雷帕霉素或氮雜螺烷?？贵w和第二種制劑可同時或順序施用。在一些情況下，給有此需要的受試者施用本發(fā)明的一種以上的核酸可為有利的。本發(fā)明的范圍內(nèi)包括本發(fā)明的治療和診斷方法，其包括根據(jù)眾所周知的方法施用本發(fā)明的至少一種核酸的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中,可通過上述方法治療的受試者是動物。優(yōu)選地,動物是哺乳動物?？芍委煹牟溉閯游锏睦影ǖ幌抻?，人、非人靈長類、嚙齒類動物(包括大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠)、牛、馬、綿羊、山羊、豬、犬和貓。優(yōu)選地，哺乳動物是人。基于下述實施例可更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解所討論的具體方法和結(jié)果僅是如本文所述的本發(fā)明的舉例說明。
實施例下述實施例舉例說明本發(fā)明的方法和產(chǎn)品。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的分子生物學(xué)領(lǐng)域中通常遇到的所述條件和參數(shù)的合適修改和調(diào)整在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實施例1:通過SLAM產(chǎn)生抗人⑶154抗體選擇淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM)(Babcook et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci,93,7843-7848 ；W092/02551 ；de Wildt et al.，1997，J.1mmunol.Methods, 207:61_67 和Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques 18:862_869)被用于鑒定且分離抗人 CD 154 抗體。SLAM使得在體內(nèi)免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的產(chǎn)生高親和力抗體的細(xì)胞能夠與任何種類分離。分離的單個抗體產(chǎn)生細(xì)胞隨后進行克隆擴增，隨后篩選產(chǎn)生抗CD154抗體的那些克隆，隨后鑒定其可變重(Vh)和輕(')鏈基因的序列。具體篩選方法在W004/051268中詳述。因此，分離對于針對人⑶154的抗體陽性的B細(xì)胞。使用SLAM技術(shù)鑒 定且分離幾種大鼠抗人⑶154抗體(圖12)。這些抗體之一CA08100342 (所述“342抗體”)是人源化的，如下述實施例中所述。它的DNA和推定氨基酸序列顯示于圖2中?？寺【幋a這種抗體的基因。實施例2:CA08100342的人源化——342.G2的產(chǎn)生SLAM抗體342通過將⑶R移植到人種系構(gòu)架上進行人源化。大鼠抗體(供體)序列與人種系(受體)構(gòu)架的比對顯示于圖9中，連同設(shè)計的人源化序列。所選擇的輕鏈種系受體序列是人VK12_1_( I )012V_ 區(qū)加 JKlJ-區(qū)(V BASE,MRC Centre for Protein Engineering,UK ；SEQ ID NO:35和36)(圖3)。所選擇的重鏈種系受體序列是人VH31-13-66V-區(qū)加JH4J-區(qū)(V BASE, MRC Centre for Protein Engineering, UK ;SEQ ID NO:37 和 38)(圖3)。此外，選擇不同的VH受體構(gòu)架，人VH41-14-59序列(SEQ ID NO:39和40)(圖3)。除其中使用組合的Chothia/Kabat定義的CDR-Hl外(參見W091/09967)，從供體移植到受體序列的 CDR 通過 Kabat(Kabat.Et al., Sequence of proteins of immunological interest(1987).Bethesda MD, National Institutes of Health, US)定義。對于其中僅 CDR 從供體抗體轉(zhuǎn)移到受體構(gòu)架上的移植，構(gòu)建其中還包括關(guān)鍵供體構(gòu)架殘基的形式。這些殘基使用基于W091/09967中所述那種的方法進行鑒定。例如，輕鏈移植物VKlgL4含在位置38、71和85處的供體殘基；重鏈移植物VH3gHl含在位置24、48、49、73和78處的供體構(gòu)架；重鏈移植物VH4gHl含在位置48、71和78處的供體構(gòu)架。所有這些移植物的序列顯示于圖9中。通過合同基因合成公司(Entelechon GmBH ；DNA2.0 ；Blue Heron)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計且構(gòu)建編碼這些V區(qū)序列的基因。使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸指導(dǎo)的誘變使用PCR進行修飾以產(chǎn)生移植的變體。來自原始大鼠抗體的信號肽序列包括在原始基因設(shè)計中，以允許使用哺乳動物細(xì)胞表達載體的表達。將移植的輕鏈基因亞克隆到輕鏈表達載體內(nèi)，所述表達載體含編碼人C-κ恒定區(qū)(Km3同種異型)的DNA。將移植的重鏈基因亞克隆到人Y _4表達載體內(nèi)，所述表達載體含編碼人Y-4恒定區(qū)的DNA，所述恒定區(qū)含鉸鏈穩(wěn)定突變S241P (Angal et al.,MolImmunol.1993，30 (I): 105-8)?？墒褂萌魏魏线m的表達載體。還將原始大鼠抗體基因亞克隆到這些載體內(nèi)，產(chǎn)生表達嵌合大鼠V區(qū)/人C區(qū)抗體的質(zhì)粒作為測定法中的基準(zhǔn)。輕鏈基因和重鏈基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞內(nèi)使得能夠表達IgG和通過Biacore '分析人CD154結(jié)合。為了分析在大腸桿菌中的表達和作為單價Fab’的活性，將關(guān)鍵構(gòu)建體的基因亞克隆到表達載體pTTOD (Fab)內(nèi)(W0 03/48208，W003/031475)。亞克隆在2步過程中完成:首先克隆入VK基因片段作為EcoRV-BsiWI片段；隨后克隆入VH基因片段作為PvuI1-Xh0I片段。這個過程使編碼來自O(shè)mpA蛋白的信號肽的DNA與編碼輕鏈和重鏈的基因融合，賦予將翻譯的蛋白分泌到細(xì)菌周質(zhì)。將所產(chǎn)生的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K-12菌株W3110內(nèi)，并且用于在小規(guī)模搖瓶中的誘導(dǎo)實驗和用于高細(xì)胞密度發(fā)酵。表I通過Riat、nrP(R)測I定的342Fab構(gòu)津體的親和力(從IL發(fā)酵物中純化的Fab)
權(quán)利要求
1.⑶154結(jié)合蛋白，其包含 重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3， 所述的CDR序列分別選自:a)分別示于 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46 和 SEQ ID NO:47 的序列；和b)分別示于 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52 和 SEQ ID NO:53 的序列。
2.⑶154結(jié)合蛋白，包含: a)分別示于SEQID NO:56,SEQ ID NO:60的Vh結(jié)構(gòu)域序列、以及與SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:60所示的任一序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列；或 b)分別示于SEQID NO:54,SEQ ID NO:58的'結(jié)構(gòu)域序列、以及與SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:58所示的任一序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的⑶154結(jié)合蛋白，包含選自下述的Vh和\結(jié)構(gòu)域序列: a)分別示于SEQID NO:56的序列；或與SEQ ID NO:56所示的序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列；示于SEQ ID NO:54的序列或與SEQ ID NO:54所示序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列； b)分別示于SEQID NO:60的序列；與SEQ ID NO:60所示的序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列；示于SEQ ID NO:58的序列或與SEQ ID NO:58所示序列具有至少90%同一性的、包含一個或多個保守置換的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2或3的⑶154結(jié)合蛋白，其中所述保守置換不在⑶R內(nèi)。
5.權(quán)利要求1一 4中任一項的CD154結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白含為抗CD154抗體或者其抗原結(jié)合片段。
6.權(quán)利要求5的抗CD154抗體，其中所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、靈長類源化抗體和人源化抗體。
7.權(quán)利要求5的抗CD154抗體，其中所述抗體選自多聚抗體、異二聚抗體、半二聚抗體、四價抗體、雙特異性抗體和單鏈抗體；及其衍生物。
8.權(quán)利要求5的抗體結(jié)合片段，其中的片段選自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv和結(jié)構(gòu)域抗體。
9.權(quán)利要求5- 8中任一項的抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段，其通過共價連接功能部分而被修飾。
10.權(quán)利要求9的抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述功能部分是聚乙二醇或其衍生物。
11.權(quán)利要求10的抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段， 其中所述抗原結(jié)合片段是Fab’， 其中經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)中的單個巰基與共價連接于賴氨酸殘基的馬來酰亞胺基共價連接， 其中將分子量約20，OOODa的甲氧基聚(乙二醇)聚合物與賴氨酸的各胺基連接。
12.權(quán)利要求1的CD154結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白缺乏免疫球蛋白Fe區(qū)。
13.權(quán)利要求1的CD154結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含免疫球蛋白Fe區(qū)， 所述免疫球蛋白Fe區(qū)選自:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe區(qū)，或 所述免疫球蛋白Fe區(qū)源自:IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe區(qū)。
14.權(quán)利要求1的⑶154結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白還包含與天然或親本Fe區(qū)相比，賦予減少的效應(yīng)子功能的變體Fe區(qū)。
15.權(quán)利要求14的⑶154結(jié)合蛋白，其中所述變體Fe區(qū)是包含來自超過一種IgFe結(jié)構(gòu)域類型的序列的嫁接(hybrid) Fe區(qū)。
16.權(quán)利要求1 15中任一項的⑶154結(jié)合蛋白抗⑶154抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白未糖基化。
17.權(quán)利要求14或15的CD154結(jié)合蛋白，其中所述減少的效應(yīng)子功能是與Fe受體(FcR)減少的結(jié)合。
18.權(quán)利要求14或15的CD154結(jié)合蛋白，其中所述減少的效應(yīng)子功能是與補體蛋白減少的結(jié)合。
19.權(quán)利要求1 18中任一項的⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述結(jié)合蛋白、抗體或片段與功能部分相連接。
20.核酸分子，其編碼權(quán)利要求1 19中任一項的⑶154結(jié)合蛋白，抗⑶154抗體或抗原結(jié)合片段。
21.DNA分子 包含選自下列的序列:SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61 ;或 包含選自與下列序列具有至少90%同一'丨生的序列:SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:610
22.載體,其包含:權(quán)利要求20的核酸分子或權(quán)利要求21的DNA分子。
23.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求22的載體。
24.產(chǎn)生權(quán)利要求1-19中任一項的⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體、或抗原結(jié)合片段的方法，其包括以下步驟: (a)在適合于由所述宿主細(xì)胞表達所述⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體、或抗原結(jié)合片段的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞；及 (b)回收所述CD154結(jié)合蛋白、抗CD 154抗體、或抗原結(jié)合片段。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
26.組合物，其包含: 權(quán)利要求1 19中任一項的⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體，或抗原結(jié)合片段，及 合適的藥學(xué)載體。
27.權(quán)利要求26的組合物，其還包含其他免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)化合物或制劑。
28.權(quán)利要求1-19中任一項的CD154結(jié)合蛋白、抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段或權(quán)利要求26或27的組合物，其用作藥物。
29.權(quán)利要求1-19中任一項的CD154結(jié)合蛋白、抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段或權(quán)利要求26或27的組合物，其用于治療炎性或自身免疫應(yīng)答，或者纖維化。
30.權(quán)利要求29的CD154結(jié)合蛋白質(zhì)、抗CD154抗體或抗原結(jié)合片段或組合物，其中所述炎性或自身免疫應(yīng)答，或者纖維化選自:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、脊椎關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、克羅恩氏病、牛皮癬硬皮病、狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜、血管疾病和多發(fā)性硬化癥。
31.下列物質(zhì)用于制備治療炎性或自身免疫應(yīng)答，或者纖維化的藥物中的用途: 權(quán)利要求1 19中任一項的⑶154結(jié)合蛋白、抗⑶154抗體，或抗原結(jié)合片段，或 權(quán)利要求20或27的組合物。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述炎性或自身免疫應(yīng)答，或者纖維化選自:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、脊椎關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、克羅恩氏病、牛皮癬硬皮病、狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜 、血管疾病和多發(fā)性硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性結(jié)合CD154(CD40L)蛋白的結(jié)合蛋白，包括抗體、抗體衍生物和抗體片段。本發(fā)明還提供與表位特異性結(jié)合的嵌合、人源化或全人抗體、抗體衍生物或抗體片段，含SEQ ID NO1所示的可變重鏈序列且含SEQ ID NO2所示的可變輕鏈序列的人源化Fab片段與所述表位特異性結(jié)合。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白可引發(fā)相對于第二種抗CD154抗體減少的效應(yīng)子功能。本發(fā)明的CD154結(jié)合蛋白在診斷和治療方法中有用，例如在疾病包括涉及由CD154-CD40相互作用介導(dǎo)的不希望有的免疫應(yīng)答的那些的治療和預(yù)防中。
文檔編號C12N15/63GK103214577SQ201310100838
公開日2013年7月24日 申請日期2008年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者L·C·伯克利, J·L·費倫特-奧格塔斯, E·A·加伯, Y·許, L·蘇, F·R·泰勒, R·亞當(dāng)斯, D·T·布朗, A·G·波普爾韋爾, M·K·魯濱遜, A·肖克, K·L·泰森 申請人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司, Ucb醫(yī)藥有限公司