栽培小麥Brock中轉錄因子TaWRKY基因序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及WRKY類轉錄因子基因— TaWRKY 基因序列及功能。該基因全長1242bp，編碼354個氨基酸多肽,相對分子量38.7kD,等電點4.96，與小麥和大麥中 WRKY 類基因同源性分別達90%和80%以上。進化分析， TaWRKY 與WRKY家族中 TaWRKY8 親緣關系最近。 TaWRKY 被白粉菌誘導表達；用病毒介導沉默抗病小麥Brock中的 TaWRKY ，Brock對白粉菌的抵抗明顯降低：與對照相比，沉默株葉片表面畸形附著胞比例降低，7d時僅為對照的四分之一，而白粉菌成功侵染率較對照株提高約14倍。以上結果顯示TaWRKY具有WRKY家族成員結構特征，在小麥抗白粉病應答途徑中起重要作用。
【專利說明】栽培小麥Brock中轉錄因子7^#/?/rr基因序列及其應用
[0001]本發(fā)明得到:國家自然科學基金(31071671)和天津市科委青年基金(14JCQNJC14900)資助。
[0002]【技術領域】:
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物基因工程【技術領域】，涉及小麥一種WRKY轉錄因子的基因序列的獲得及其在小麥抗白粉病基因功能研究方面的應用。

【背景技術】
[0003]植物在漫長的進化過程中形成一系列復雜而精確的機制，來抵御生長發(fā)育過程中受到各種生物和非生物脅迫。逆境脅迫下，植物通過一系列生理、生化和分子水平上的改變來適應逆境脅迫。大量研究表面，植物對逆境的響應是自身多個基因和基因家族共同作用的結果，這些基因主要分為功能基因和調(diào)節(jié)基因兩類。轉錄因子是植物中非常重要的一類調(diào)節(jié)基因。
[0004]WRKY轉錄因子是近年來在植物中被廣泛研究的一類轉錄因子家族，因其含有一段高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名。WRKY轉錄因子廣泛參與植物的抗逆脅迫和衰老等生理生化過程，機械損傷、病原菌侵害、植物激素類物質刺激都會引起WRKY基因的表達變化。煙草WRKY3和WRKY6能夠響應昆蟲取食造成的傷害。水稻中，過表達可以提高其對細菌和真菌疫病的抗性。擬南芥中轉錄因子WRKY2介導了依賴于ABA的種子萌發(fā)以及萌發(fā)后發(fā)育的阻滯過程。HvWRKY38在大麥中受干旱、低溫脅迫的誘導。在水稻中，干旱誘導水稻的葉中0sWRKY80的表達量顯著增加。1994年，Ishiguro和Nakamura首次從甘薯(Ipomoea batatas)中克隆出第一個WRKY蛋白SPF1，此后人們相繼在野生燕麥、歐芹、擬南芥、煙草和水稻等多種植物中都得到了 WRKY基因。目前，在擬南芥和水稻中分別發(fā)現(xiàn)了 72個和107個WRKY基因，Wu等和Niu等也分別在小麥中克隆了 15個和43個WRKY基因。
[0005]前期工作中，我們在利用cDNA-AFLP技術分析Brock中白粉菌誘導下基因表達譜時，發(fā)現(xiàn)一個367 bp的片段F16，經(jīng)Blast比對，該片段與NCBI GenBank中小麥WRKY8(Genbank 登錄號:DQ323885.1)，小麥 rM7Z/(Genbank 登錄號:EF368356.1),小茇 WRKY80(Genbank 登錄號 JX679079.1)，小麥 cDNA 文庫序列(Genbank 登錄號:AK331823.1)，大茇 WRKYl (Genbank 登錄號:AJ536667.1)，大茇 WRKY38 (Genbank 登錄號:ΑΥ541586.I)分別有94%、93%、93%、92%、85%和80%的同源性。我們根據(jù)上述基因序列設計兼并引物，在抗白粉病小麥Brock中克隆了一個WRKY基因cDNA全長序列，命名為TaWRKY0利用熒光定量PCR技術對該基因的表達模式進行了分析，利用病毒介導的基因沉默(VIGS)技術獲得沉默植株，通過對小麥葉片基因沉默前后白粉菌侵染情況觀察統(tǒng)計，初步認為該WRKY基因參與了小麥抗白粉病早期防御反應過程。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是公開了小麥轉錄因子AMXT基因序列的獲得以及在小麥抗白粉病相關性研究方面的應用。主要內(nèi)容包括: 小麥WRKY轉錄因子基因序列，該基因序列全長1242bp，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。編碼蛋白含354個氨基酸，相對分子量為38.7 kD，理論等電點為4.96，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明進一步公開了小麥WRKY轉錄因子AMXT基因序列在用于小麥抵抗白粉病方面的應用。進化樹分析表明，TaWRKY與WRKY家族中TaWRKY8親緣關系最近?；虻恼T導表達模式分析顯示，AFMT被白粉菌強烈、迅速誘導表達；用病毒介導的基因沉默方法沉默抗病小麥Brock中的基因，小麥對白粉菌的抵抗明顯降低，表現(xiàn)在兩個方面--第一，與對照相比，沉默株葉片表面畸形附著胞比例明顯降低，7d時僅為對照的四分之一；第二，白粉菌接種小麥葉片7天時，白粉菌成功侵染率對照株約為6%，基因沉默株則達86%，提高了約14倍。以上結果顯示7?腸轉錄因子具有WRKY家族成員基因結構特征，在小麥抗白粉病應答途徑中起重要作用。
[0008]本發(fā)明人所在實驗室前期在利用cDNA-AFLP技術分析Brock中白粉菌誘導下基因表達譜時，發(fā)現(xiàn)一個367 bp的EST F16，經(jīng)Blast比對，該片段與NCBI GenBank中多個植物WRKY基因有同源性，因此，我們根據(jù)上述基因序列設計兼并引物，在抗白粉病小麥Brock中克隆了一個WRKY基因cDNA全長序列，命名為rarMT。為了研究TaWRKY基因對白粉菌誘導的應答情況，我們利用熒光定量分析法(qRT-PCR)分析白粉菌誘導后AMXT基因mRNA積累情況。Brock中，基因受白粉菌誘導后的表達趨勢呈“W”型曲線特征，在白粉菌誘導2h時基因表達開始上升，約為本底表達的1.2倍；4h時約為1.5倍，8h時達到最高，約為本底表達量的3.75倍；之后迅速回復到2倍以下，24h后又開始上升，48h時達到接近本底表達量的3倍。以上結果說明，的表達水平與白粉菌的誘導密切相關。沉默AMXT基因小麥葉片白粉菌附著胞畸形率低，成功侵染率高，試驗小麥的抗病性由強變?nèi)?，說明目標基因與抗白粉病特性密切相關。以上結果顯示轉錄因子具有WRKY家族成員基因結構的特征，在小麥抗白粉病應答途徑中起重要作用。因此完成了本發(fā)明。
[0009]小麥轉錄因子TaWRKY基因屬于WRKY基因家族成員，該基因序列全長1242bp，堿基序列如下(SEQ ID NO:1):
CCACGCGTCCGCGGAAATAGTTCTCCATCTCAACCTTCTCTTCTCCCTTCTCTTCTCTCCCGCGCGTTACCT
CGAACCGGAAGCGAACTCTACATCCATCCTCGACCGATGGATCCATGGGTCAGCAGCCAGCCTTCCCTTAGCCTCGA
CCTGCACGTCGGCCTCCCGCCGATGGGGCACCCGCACCACCACCAGGCGGCGCCCATGGTCGCGCTGGCCAAGCCCA
AGGTCCTCGTCGAGGAGAACTTCATGCAGCTCAAGAAGGACCCTGAGGTTGCGGTTCTTGAGTCTGAGCTACAGCGG
GTGAGCGAGGAGAACCGGCGGCTGGGCGAGATGCTCAGGGAGGTGGCCTCCAAGTACGAGACCCTGCAGGGCCAGTT
CACCGACATGGTCACGGCCGGCGCCCACGCCGGCGGCAATAACCACTACAACAACCAGCCGTCCTCCGCGTCGGAGG
GCGGGTCGGTGTCGCCGTCGAGGAAGCGCAAGAGCGAGGAGAGCAACGGCACGCCACCGCCGTCGCACCAGCAGCAG
CAGCAGCACTACGCCGGCGGCCTCGCGTACGCGGCGGCGCCGGACCAGGCGGAGTGCACGTCCGGCGAGCCGTGCAA
GCGCATCCGGGAGGAGTGCAAACCCGTCATCTCCAAGCGCTACGTCCACGCCGACCCCGCCGACCTCAGCCTGGTGG
TGAAGGACGGGTACCAATGGCGCAAGTACGGGCAGAAGGTGACCAAGGACAACCCCTGCCCCAGAGCCTACTTCCGG
TGCTCCTTCGCCCCCGGCTGCCCCGTCAAGAAGAAGGTGCAGAGGAGCGCCGAGGACAAGACCATACTCGTGGCGAC
GTACGAGGGCGAGCACAACCACAGCCAGCCCCCGTCGTCGCAGCCGCAGCAGCAGAACGACGGCTCCGGCGCGGGCA
AGAACGCCGGGAAGCCACCCCAGGCGCCGGCCACGCCTCACCACCCGCAGCAGCATCAGCAGCAGCACAAGCAGGAA
GCGCCAGCGGTAGCCGTCAGCGGCGAGTCCGCCGCCGCGGAATCCGAGATGATCCGTCGGAACCTGGCGGAGCAGATGGCCATGACGCTGACGAGGGACCCCAGCTTCAAGGCGGCGCTCGTCACCGCCCTCTCCGGCCGGATCCTCGAGCTAT
CGCCGACCAGGGACATCAATTAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCA
ACGCGTTGATTCCAT
陰影單劃線部分為起始密碼子，陰影雙劃線部分為終止密碼子。
[0010]本發(fā)明所述的小麥轉錄因子AMXT基因序列，該基因含有編碼354個氨基酸的開放讀碼，理論預測該蛋白的分子量為38.7kDa，序列如下(SEQ ID N0:2):
MDPWVSSQPSLSLDLHVGLPPMGHPHHHQAAPMVALAKPKVLVEENFMQLKKDPEVAVLESELQRVSEENRR
LGEMLREVASKYETLQGQFTDMVTAGAHAGGNNHYNNQPSSASEGGSVSPSRKRKSEESNGTPPPSHQQQQQHYAGG
LAYAAAPDQAECTSGEPCKRIREECKPVISKRYVHADPADLSLVVKDGYQffRKYGQKVTKDNPCPRAYFRCSFAPGC
PVKKKVQRSAEDKTILVATYEGEHNHSQPPSSQPQQQNDGSGAGKNAGKPPQAPATPHHPQQHQQQHKQEAPAVAVS
GESAAAESEMIRRNLAEQMAMTLTRDPSFKAALVTALSGRILELSPTRDIN。
[0011]陰影單劃線部分為WRKY保守結構域。
[0012]本發(fā)明公開的栽培小麥Brock中轉錄因子AMXT基因序列所具有的積極效果在于:
(1)為從抗病栽培小麥Brock中獲得的轉錄因子基因，通過基因沉默技術研究發(fā)現(xiàn)該基因在小麥抗白粉病早期應答方面有重要作用；
(2)轉錄因子基因具有迅速調(diào)控其下游基因的表達，從而提高植物的整體抗性，因此轉錄因子AMXT可以作為目標基因應用于小麥抗白粉病分子育種研究。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1.小麥TaWRKY與其他物種的WRKY的系統(tǒng)進化樹分析；
圖2.基因在Brock中的表達趨勢；
圖3.7?腸《7基因沉默植株葉片形態(tài)；A = GKP-Buffer水稀釋液對照組，B: BSMV y: GFP對照組，C: BSMVy: /--對照組，D: BSMVy基因沉默組；
圖4.AMXT基因沉默效率檢測；
圖5.基因沉默植株(BSMV:和對照(BSMV:ff^)的白粉菌侵染情況；
圖6.對照和沉默植株上的畸形附著胞和成功侵染率比較，A為對照和沉默植株上畸形附著胞比較為對照和沉默植株白粉菌成功侵染率比較。
[0014]【具體實施方式】:
下面結合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質由權利要求來限定。
[0015]實施例1 I材料與方法
1.1實驗材料與試劑
白粉菌抗性品種Brock,由Ray Johnson博士惠贈。
[0016]小麥白粉菌15號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。
[0017]1.2 TaWRKY基因的克隆
參照Roche公司TriPure Isolat1n Reagent試劑盒操作手冊提取總RNA。利用NanodroplOOO和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量及濃度。然后以4 μ g總RNA為模板，利用Oligo (dT) 18,在 Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche)的作用下合成cDNA。根據(jù)F16的Blast比對結果，設計一對兼并引物，
WRKYCDS-F: 5’ -ATGGATCCATGGRTSRGCAGCC-3’ ;
WRKYCDS-R: 5，-TTAATTGATGTCCCTGGTCGGCGAK-3，進行 PCR 擴增，擴增體系為 5 X HFBuffer 10.Ομ I, 10mM dNTP Mixture 1.0 μ 1，WRKYCDS-F 2.5 μ 1，WRKYCDS-R 2.5 μ I,cDNA 1.0 μ I, DNA polymerase 0.5 μ 1，ddH20 補齊至 50 μ I。PCR 反應參數(shù):98°C預變性5 min ;98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸2 min ;反應進行35個循環(huán)。72°C終延伸7min。將目標條帶回收純化,純化產(chǎn)物連接到pGEM-T easy Vector上，轉化大腸桿菌,藍白斑篩選陽性克隆，經(jīng)PCR驗證和酶切驗證后，陽性克隆送公司測序，測序結果提交NCBIGenBank進行同源性分析。
[0018]1.3 7?腸?Τ基因表達模式分析
在小麥幼苗長至一葉一心期時采用抖落法高密度接種新鮮白粉菌孢子，接種0，2，4，8，12，24和48h后取葉片用于提取RNA和表達趨勢分析。
[0019]根據(jù)小麥TaWRKY基因的特異區(qū)段設計一對熒光定量引物QTaWRKYF: 5’-AGTCCAATCCCGTCATCTCC-3’
和 QTaWRKYR: 5’-GTCGCCACGAGTATGGTCTT-3’，大小為 154bp。使用 FastStart UniversalSYBR Green Master (Roche)在突光定量PCR儀(Corbett Rotor Gene 6000)上進行基因擴增、熒光信號檢測和溶解曲線分析。內(nèi)參基因為小麥基因(GenBank: U76744.1)，該基因擴增引物為 TubulinF: 5’ -CCGTCTCCTTCTGGCTGCTT-3’ 和 TubulinR: 5’ -GCCCGATGTGGATGCTTAT-3’，擴增片段大小為186bp。PCR擴增體系及程序參照試劑盒說明書進行，每個樣品設置3個重復，采用2_ΛΛσΓ法進行數(shù)據(jù)分析[11]。
[0020]1.4 VIGS 載體構建
用于載體構建的是大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)病毒，它由BSMVa，BSMVβ，BSMVy:PDS/GFP 3個組分組成。BSMVy上的Yb開放閱讀框下游終止密碼子處引入了觔e I切點，用于插入克隆DNA片段。BSMVy-PDS經(jīng)觔e I酶切后，去掉PDS基因片段，回收載體片段。根據(jù)AMXT基因保守區(qū)序列設計一對兩端添加 Nhe I 酶切位點的上下游引物，WRKY-V-F: 5，-AGCCGCAGCAGCAGAACG-3 ’ 和 WRKY-V-R5’-CTTGAAGCTGGGGTCCCTC-3’。擴增片段大小為200bp左右。以含基因全長的質粒作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化、酶切后與同樣經(jīng)#知I酶切并磷酸化的BSMV Y:PDS載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)克隆，篩選，測序后成功構建VIGS重組載體。
[0021]1.5體外轉錄和病毒接種
載體 BSMV a，BSMV Y 和 BSMV β 酶切線性化，然后用 RiboMAX large Scale RNAProduct1n-T7 kit (Promega)體外轉錄獲得BSMV病毒RNA。將病毒的3個RNA組分等量混合，加等體積GKP緩沖液混勻后，接種于小麥二葉期在第2片葉子上。以GKP緩沖液作為陰性對照；接種RNA a +RNA β +RNA Y:PDS/GFP (BSMV: PDS/GFP)并以葉片漂白癥狀跟蹤基因沉默情況作為陽性對照。接種后保濕24 h，然后在光照培養(yǎng)箱中于20°C培養(yǎng)數(shù)天，定期觀察病毒癥狀和接種BSMV = PDS植株葉片漂白情況。
[0022]1.6基因沉默效率檢測
提取接種BSMV:且有病毒癥狀的小麥第3葉總RNA，反轉錄成cDNA，qRT-PCR分析基因的表達水平，進而確定基因的沉默效率。
[0023]1.7基因沉默對白粉菌侵染小麥葉片的影響
在Brock第三片葉子上接種白粉菌，接菌48hr，72hr和7d的TaWRKY實驗組、GFP對照組和GKP-Buffer水稀釋液對照組的葉片上取3-4cm長的葉段，浸泡于脫色液中脫色48h，期間更換脫色液直至葉片透明。再于考馬斯亮藍R-250染色液中染色4hr。以蒸餾水洗去葉片表面殘余的染色液，隨后將葉片置于保存液中保存并在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計白粉菌與葉片的互作情況。
[0024]實驗結果
2.1基因的克隆
分離白粉菌誘導8h的小麥Brock葉片總RNA,以Oligo (dT) 18為引物進行反轉錄，獲得cDNA，以該cDNA為模版，WRKYCDS-F和WRKYCDS-R為引物，PCR擴增出一個約1.3kb的基因片段，將該片段連接到T-easy克隆載體，克隆并測序，該片段長1242 bp，包含F(xiàn)16序列區(qū)段，與小麥腸基因(GenBank登陸號:DQ323885.1)有97%同源性。其ORF區(qū)共1065bp，推測編碼354個氨基酸(SEQ ID NO: 2),理論預測該蛋白的分子量為38.7 kD,等電點4.96。氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，TaWRKY中后部包含WRKY基因超家族保守結構域WRKYGQK，故將該基因命名為TaWRKY (圖1)。
[0025]本發(fā)明所述的小麥轉錄因子基因序列，該基因含有編碼354個氨基酸的開放讀碼，理論預測該蛋白的分子量為38.7kDa，見SEQ ID NO: 2
利用ClustalW軟件進行系統(tǒng)譜系分析發(fā)現(xiàn)，本研究中克隆的基因與WRKY家族中WRKY8親緣關系較近(圖1)
2.2 TaffRKY基因表達模式分析
為了研究TaWRKY基因對白粉菌誘導的應答情況，我們利用熒光定量分析法(qRT-PCR)分析白粉菌誘導后基因mRNA累計情況。Brock中，TaWRKY基因受白粉菌誘導后的表達趨勢呈“W”型曲線特征，在白粉菌誘導2h時基因表達開始上升，約為本底表達的1.2倍；4h時約為1.5倍，8h時達到最高，約為本底表達量的3.75倍；之后迅速回復到2倍以下，24h后又開始上升，48h時達到接近本底表達量的3倍(圖2)。以上結果說明，
的表達水平與白粉菌的誘導密切相關。
[0026]小麥沉默基因植株的獲得
將rarMT基因非保守區(qū)片段插入BSMV Y載體，構成重組BSMV病毒(BSMV y: TaWRKV)；作為對照，同時以I3DS和GFP構建相同的重組病毒BSMV Y: PDS和BSMV y: GFP,分別接種小麥Brock第二片葉，結果發(fā)現(xiàn)接種重組病毒BSMV: PDS的植株葉片出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象(圖3)，說明該基因沉默實驗體系有效。除去病毒引起的潰水斑外，本研究中基因沉默小麥與對照組小麥在生長、形態(tài)等方面沒有明顯差異。然后分別提取了實驗組和對照組的小麥的第三片葉總RNA，利用半定量PCR分析實驗材料中基因的mRNA水平。如圖4所示，實驗組中hrMT基因的表達量明顯下降，說明我們設計的片段可以有效的沉默內(nèi)源TaWRKY基因。
[0027]TaWRKY基因沉默后小麥葉片對白粉菌侵染的抗性變化
以接種BSMV Y: GFP %對照，本研究分別觀察了白粉菌侵染48h，72h和7d后，BSMVy laMXT基因沉默小麥植株對白粉菌侵染的抗性變化。接種白粉菌48h后，BSMV y:基因沉默小麥植株葉片上開始出現(xiàn)次生菌絲，而對照組BSMV y: 中的白粉菌基本處于附著胞狀態(tài)；接種72h后，基因沉默株葉片上出現(xiàn)大量多分支的次級菌絲，而對照組中則剛剛開始出現(xiàn)次級菌絲；染菌7d后，基因沉默株出現(xiàn)大量串珠狀孢子，對照組中的菌絲開始出現(xiàn)多分支，但是數(shù)量明顯少于基因沉默組(圖5)。結果暗示，沉默hrMT基因在一定程度上降低了植株的抗病水平。
[0028]本研究共對每組9個葉片上的畸形附著胞和菌絲的生長情況分別進行統(tǒng)計，如統(tǒng)計圖6A和B。與對照組相比，沉默株葉片表面畸形附著胞比例明顯低于對照，7d時僅為對照的四分之一(圖6A)，表明由于基因沉默導致植株對白粉菌的抵抗能力下降；與之相對應，白粉菌成功侵染率明顯提高，7d時對照株約為6%，基因沉默株則達86% (圖6B)，提高了約14倍，進一步說明該基因在小麥抵抗白粉病過程中具有重要作用。
【權利要求】
1.小麥WRKY轉錄因子基因序列，該基因序列全長1242bp，具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.小麥WRKY轉錄因子AMXT基因序列，編碼蛋白含354個氨基酸，相對分子量為38.7 kD,理論等電點為4.96，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.權利要求1或2所述的小麥WRKY轉錄因子AMXT基因序列在用于小麥抵抗白粉病方面的應用。
【文檔編號】A01P3/00GK104357457SQ201410691682
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權日:2014年11月27日
【發(fā)明者】王振英, 劉曉穎, 肖瑩, 彭永康, 范寶莉, 陳宏
申請人:天津師范大學