專利名稱：一種k562細(xì)胞擴(kuò)增激活nk細(xì)胞的方法
一種K562細(xì)胞擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指使用跨膜白介素21，⑶14，⑶19，⑶86和⑶137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和低濃度白介素2共同作用定向擴(kuò)增激活自然殺傷細(xì)胞(NK)的方法。
背景技術(shù)：
NK細(xì)胞治療對(duì)腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前NK細(xì)胞治療在美國(guó)主要用來(lái)和手術(shù)、化療和放療聯(lián)合使用。NK細(xì)胞數(shù)量和殺傷功能與療效直接相關(guān)，治療中存在的問(wèn)題在于獲得大量NK細(xì)胞非常困難。傳統(tǒng)使用的高劑量白介素2激活生長(zhǎng)倍數(shù)有限，端粒酶活性降低，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞殺傷功能低下。本公司之前的發(fā)明采用K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD137復(fù)合物解決了這一問(wèn)題。用該方法擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度和活性顯著增強(qiáng)，數(shù)量上可以達(dá)到臨床治療的需要。然而在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs (腫瘤相關(guān)巨曬細(xì)胞)和CD19+B細(xì)胞，這些細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)因子。用僅轉(zhuǎn)染跨膜IL-21和CD 137復(fù)合物的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增的NK細(xì)胞雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷能力，對(duì)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的殺傷能力卻很弱。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種更具有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?，?shí)現(xiàn)NK細(xì)胞的擴(kuò)增。
本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:
在第一方面，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，使用跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的混合物與白介素2共同作用擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞，其中所述跨膜白介素21為白 介素21與膜蛋白或膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域相連而成的復(fù)合物，優(yōu)選地為白介素21與⑶8 α的胞外結(jié)構(gòu)域相連而成的復(fù)合物；優(yōu)選地，所述⑶8 α、白介素21、CD14、CD19、CD86和CD 137分別包含CD8 α、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的完整氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段。
在本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法中，可以加入兩次或更多次跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137混合物，優(yōu)選地，所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137混合物的劑量可以為50ρΜ-1000ρΜ，更優(yōu)選地可以為500ρΜ 800ρΜ。
在本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法中，所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的混合物可以為純化后的蛋白混合物或由同一宿主細(xì)胞即時(shí)表達(dá)。
在本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法中，所述淋巴細(xì)胞可以為純化的或未純化的，優(yōu)選地，所述淋巴細(xì)胞可以是外周血淋巴細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的組合、純化的NK細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后作用的血液中所有白細(xì)胞，優(yōu)選地所述純化可以是指NK細(xì)胞為細(xì)胞總數(shù)的50%以上。
在本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法中，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137可以分別采用蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選地，所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137各自的表達(dá)載體中均可以含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因。在本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法中，所述宿主細(xì)胞可以為K562細(xì)胞；優(yōu)選地，當(dāng)所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137混合物同時(shí)由K562細(xì)胞即時(shí)表達(dá)時(shí)，所述K562細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例可以為K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=1_10:1，更優(yōu)選地，可以為K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=1-4:1，最優(yōu)選地可以為2: 1-3: I。7、根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中所述白介素2的最低劑量可以為50單位/毫升，優(yōu)選地，可以加入兩次或更多次所述白介素2。本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋 巴細(xì)胞的方法，所述方法可以包括:(I)在含有所述淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液中，加入同時(shí)表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的經(jīng)過(guò)輻照的K562細(xì)胞以及白介素2共同培養(yǎng)7天；(2)將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，獲取細(xì)胞沉淀，并用與步驟(I)中等量的培養(yǎng)液重懸；和(3)加入所述K562細(xì)胞，培養(yǎng)7天；其中，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液為=Eagle培養(yǎng)液加入10%人血清或10%小牛血清；或RPMI1640 加入 10%人血清或 10% 小牛血清；或 F-10 (Ham，s) Nutrient mixtures 加入 10%人血清或10%小牛血清；優(yōu)選地，所述輻照的劑量為100Gy-1000Gy。本發(fā)明的擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法，可以通過(guò)所述方法擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞溶于生理鹽水溶液，優(yōu)選地用于靜脈滴注。在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面中所述的方法在制備在用于在受治療者中治療癌癥或傳染性疾病的藥物的制備中的應(yīng)用，其中，優(yōu)選地所述受治療者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是人類；所述癌癥優(yōu)選地為急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種；所述傳染性疾病優(yōu)選為細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)感染，更優(yōu)選地為乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒感染。作為優(yōu)選，當(dāng)使用純化后的蛋白混合物時(shí)，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的總劑量在50pM InM ;為了更好實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的總劑量在500pM 800pM。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137是經(jīng)過(guò)純化處理的蛋白質(zhì)，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的50 %。作為優(yōu)選，跨膜IL-21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=1-10: I。作為更佳選擇，上述方法的淋巴細(xì)胞中加入白介素2(10-500單位)，且K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=I: 1、2: 1、3:1或4:1。作為優(yōu)選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137擴(kuò)增的NK細(xì)胞
過(guò)程是通過(guò)溶于生理鹽水溶液的方法進(jìn)行。本發(fā)明中跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞對(duì)外周血單核細(xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞擴(kuò)增和激活有重要的作用。擴(kuò)增和激活后產(chǎn)生的NK細(xì)胞有重要的醫(yī)療作用。本發(fā)明利用的方法可以得到的足夠數(shù)量和功能的NK細(xì)胞，是理想的識(shí)別和摧毀腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，增強(qiáng)病人免疫反應(yīng)的方法。腫瘤的類型參考前專利(專利申請(qǐng)?zhí)?CN201110075736)。NK細(xì)胞還可以識(shí)別和殺傷病原體感染的細(xì)胞，其中包括但不限于:乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒。
本發(fā)明中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137、⑶8 α和白介素2是該蛋白質(zhì)的全部多肽，其中也包括這些蛋白質(zhì)中具備功能的多肽成分。本發(fā)明中的外周血單核細(xì)胞來(lái)自于外周血，臍帶血和骨髓，是脫離人體的組織。本發(fā)明中用于擴(kuò)增的細(xì)胞可以是NK細(xì)胞；也可以是NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的不同組合；也可以是NK細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的不同組合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后所作用的血液中所有白細(xì)胞的總和。本發(fā)明中的白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137來(lái)源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對(duì)象是其它物種，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素 21、CD14、CD19、CD86 和 CD137。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所有的技術(shù)和科學(xué)詞匯的含義是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術(shù)語(yǔ)的定義在所有分子生物學(xué)書(shū)中可以找到，例如，Benjamin Lewin,Genes VIII, Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)。
為了確保長(zhǎng)期，高收益的生產(chǎn)重組白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137，本發(fā)明采用了蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所通常采用的技術(shù)，具體方法可詳見(jiàn)(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄了穩(wěn)定表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的表達(dá)載體，這個(gè)載體中含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。⑶8 α是一種在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白KD14、⑶19、⑶86和CD137為膜蛋白。外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，用恰當(dāng)?shù)姆椒せ顔?dòng)子，培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間后即可以得到在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽。這些方法是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士通常理解的方法。
在K562細(xì)胞膜上高水平表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細(xì)胞可以通過(guò)高速離心的方法收集，K562細(xì)胞可以通過(guò)這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法處理:強(qiáng)酸，強(qiáng)堿和輻照。處理后的細(xì)胞可以直接與外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)或NK細(xì)胞共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞 ，也可以純化分離后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞。
在細(xì)胞膜上高水平表達(dá)的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137可以通過(guò)本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的技術(shù)來(lái)純化和分離。這些技術(shù)包括但不限于下面所列的方法:硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質(zhì)復(fù)性的方案可用來(lái)幫助純化表達(dá)的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137會(huì)有一部分分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士都可以根據(jù)普通的生物化學(xué)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證。分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過(guò)上述方法純化和分離。
細(xì)胞膜為跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137提供了固相支撐，所述固相支撐包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、顆粒、微小顆粒、磷脂、磷脂雙分子層、細(xì)胞膜和類似物。重要的是固相的表面能夠粘附上述蛋白質(zhì)?？缒ぐ捉樗?1、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的操縱核苷酸編碼序列的方法來(lái)生產(chǎn)。例如，用特定的，非特定的定點(diǎn)突變或其他分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)功能等同的，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不相同的多肽。簡(jiǎn)單的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修改如果不影響蛋白質(zhì)的生化特性，這些通過(guò)氨基酸保守替換產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞，可以用來(lái)進(jìn)行自體移植，也可以進(jìn)行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴(kuò)增的細(xì)胞可以通過(guò)靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應(yīng)用中，細(xì)胞系(例如，NK細(xì)胞系，NKT細(xì)胞系)也可以通過(guò)轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞進(jìn)行激活和擴(kuò)增。擴(kuò)增的細(xì)胞系用于制備治療疾病的藥物也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞可從來(lái)源于包含有大量淋巴細(xì)胞和前體細(xì)胞的任何組織。例如，外 周血(包括臍帶血)，骨髓，脾臟和淋巴結(jié)。淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞通常取自于外周血或骨髓。在其他應(yīng)用中(例如，實(shí)驗(yàn)研究)，脾臟和/或淋巴結(jié)也是合適的來(lái)源。例如，淋巴細(xì)胞可以通過(guò)抽外周血和/或骨髓來(lái)獲得。淋巴細(xì)胞可以進(jìn)一步經(jīng)過(guò)純化得到NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞。純化NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞的步驟和工藝是本行業(yè)內(nèi)的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細(xì)胞可以通過(guò)密度梯度離心的方式來(lái)分離血液或骨髓中的血紅細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞。NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞可以利用抗體介導(dǎo)的親和制備方法進(jìn)一步純化，例如抗體結(jié)合磁珠法。純化淋巴細(xì)胞并不要求純化的淋巴細(xì)胞絕對(duì)純,而是指純化的細(xì)胞比其在來(lái)源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細(xì)胞至少代表總數(shù)的50%，或者60%，或者更高。純化的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞懸浮在一個(gè)合適的生理緩沖溶液中，然后懸浮生長(zhǎng)于但不局限于下列培養(yǎng)液中，Eagle' s培養(yǎng)液加入10%人血清，RPMI 1640加入10%人血清，F(xiàn)-10 (Ham' s)Nutrient mixtures加入10%人血清。人血清也可以用10%胎牛血清取代，但人血清對(duì)NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果更好。淋巴細(xì)胞和/或純化的淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入輻照后轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2培養(yǎng)，每周加入新的轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞。通常情況下為了降低成本和避免感染，本發(fā)明采用最小的劑量來(lái)擴(kuò)增NK淋巴細(xì)胞。白介素2的劑量在50單位/毫升到1000單位/毫升之間。在某些情況下，白介素2復(fù)合物的劑量至少在500單位/毫升以上。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，激活濃度約為500單位/毫升或1000單位/毫升。另外，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137直接注射入人體，用來(lái)在體內(nèi)擴(kuò)增NK細(xì)胞時(shí)，所用劑量在0.5pM到0.5nM之間。轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞的采用劑量按照跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137在K562中的表達(dá)劑量來(lái)確定。在某些情況下，按照K562:外周血單核細(xì)胞=I: 1，
2: 1,3: 1,4: 1或以上加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、0)14、0)19、0)86和0)137的1(562細(xì)胞。在某些情況下，有必要進(jìn)行高劑量的處理，按照K562:外周血單核細(xì)胞=10: I或以上加入轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞。在體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以移植給單核細(xì)胞的捐助人本身或者受捐助人，以加強(qiáng)天生或抗原特異性免疫反應(yīng)。通常情況下，擴(kuò)增的NK細(xì)胞通過(guò)溶于生理鹽水溶液的方法靜脈滴注。有益效果:(I)本發(fā)明在跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染了⑶14、⑶19和CD86。K562細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的CD14有助于激活NK細(xì)胞識(shí)別并殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；轉(zhuǎn)染CD19有助于激活NK細(xì)胞識(shí)別并殺傷B細(xì)胞；轉(zhuǎn)染CD86有助于提升NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞、微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和微環(huán)境中的B細(xì)胞的殺傷作用。(2)本發(fā)明提供體外擴(kuò)增和激活NK的方法比用僅轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，擴(kuò)增的效率高2.4倍，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的殺傷能力提高了 2.7倍。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與用僅轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增的NK細(xì)胞相比，采用本發(fā)明擴(kuò)增的NK細(xì)胞顯著提高了對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤的殺傷能力。(3)本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2培養(yǎng)擴(kuò)增激活的NK提高病人的免疫力來(lái)幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細(xì)菌。


圖1是本發(fā)明中宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的
結(jié)構(gòu)示意圖；圖2NK細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示NK淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞 擴(kuò)增NK細(xì)胞作為對(duì)照；圖3PBMC細(xì)胞體外擴(kuò)增線性圖，顯示淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增淋巴細(xì)胞作為對(duì)照；圖4PBMC細(xì)胞體外擴(kuò)增前后流示儀數(shù)據(jù)圖，PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+和⑶56+/⑶16+)的比例顯著增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和⑶137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC細(xì)胞作為對(duì)照；圖5NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞圖，人PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對(duì)照；圖6NK細(xì)胞殺傷TAM細(xì)胞，人PBMC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對(duì)TAM細(xì)胞的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對(duì)照；圖7擴(kuò)增激活后人NK細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)PC3腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用圖，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)的PC3細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對(duì)照?qǐng)D；圖8轉(zhuǎn)染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞圖，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞顯著提高腫瘤小鼠的存活率和延長(zhǎng)小鼠平均壽命，轉(zhuǎn)染跨膜白介素21和CD137的K562細(xì)胞擴(kuò)增PBMC中的NK細(xì)胞作為對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式
來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作具體說(shuō)明:
以K562細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的表達(dá)載體(參見(jiàn)圖1)，⑶8α為在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜蛋白，⑶8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達(dá)在細(xì)胞膜上，成為跨膜蛋白，而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137均為膜蛋白，其各自的載體分別中含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因；當(dāng)外源表達(dá)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞后，激活啟動(dòng)子，培養(yǎng)Κ562細(xì)胞一段時(shí)間，即可以同時(shí)得到在細(xì)胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；經(jīng)培養(yǎng)后的Κ562細(xì)胞膜上同時(shí)具有表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細(xì)胞，通過(guò)強(qiáng)酸，強(qiáng)堿、和/或輻照、及通過(guò)高速離心收集Κ562細(xì)胞；或?qū)Ζ?62細(xì)胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強(qiáng)酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進(jìn)行純化收集；將上述離心收集的Κ562細(xì)胞與NK細(xì)胞、或NK細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的組合、或是NK細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的組合、或是外周血單核細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞的組合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或⑶86和/或⑶137與白細(xì)胞的組合進(jìn)行共同培養(yǎng)、或在純化分離Κ562細(xì)胞后與PBMC共同培養(yǎng)，激活擴(kuò)增NK細(xì)胞，直至NK細(xì)胞代表總數(shù)的50%以上。
實(shí)施例1擴(kuò)增NK細(xì)胞。
取NK細(xì)胞(2x107)培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)染CD8a-白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞(輻照，IOOGy)和白介素2(50單位/毫升)后培養(yǎng)7天。7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過(guò)輻照的轉(zhuǎn)染 CD8a -白介素 21、CD14、CD19、CD86 和 CD 137 的 K562 細(xì)胞(Imai 等 Leukemia, 2004,18，676-684)，再培養(yǎng)7天， 如圖1所示。高劑量白介素2 (200單位/毫升)作為對(duì)照組。如圖1所示，NK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的Κ562細(xì)胞和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。細(xì)胞數(shù)量的增加可以通過(guò)插入胸苷的方法來(lái)測(cè)定。胸苷插入之后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，然后再開(kāi)始測(cè)量細(xì)胞數(shù)量的變化。在Κ562: NK淋巴細(xì)胞=1: I濃度的作用下NK細(xì)胞數(shù)量在7天時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14天的時(shí)約增長(zhǎng)了 2200倍。在加入滋養(yǎng)細(xì)胞后，NK細(xì)胞在50單位/毫升的白介素2作用下即可開(kāi)始增長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于促進(jìn)NK細(xì)胞生長(zhǎng)的作用明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染跨膜白介素2和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞(14天時(shí)約強(qiáng)2.4倍)。
實(shí)施例2擴(kuò)增未經(jīng)純化的外周血淋巴細(xì)胞
轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞不僅可以擴(kuò)增純化的NK細(xì)胞，還可以擴(kuò)增未經(jīng)過(guò)純化的淋巴細(xì)胞。健康捐獻(xiàn)人的PBMC培養(yǎng)在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞(輻照，IOOGy)和低劑量白介素2后共同培養(yǎng)7天。7天后離心，用等量的培養(yǎng)液重懸，加入經(jīng)過(guò)IOOGy輻照的滋養(yǎng)細(xì)胞，再培養(yǎng)7天，如圖2所示。轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21 m CD 137的K562滋養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照。NK細(xì)胞在轉(zhuǎn)染CD8 α -白介素21、CD14、CD19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加。NK細(xì)胞數(shù)量在7天時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14天的時(shí)約增長(zhǎng)了 2100倍。轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞生長(zhǎng)的作用明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染跨膜白介素2和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞(14天時(shí)，2.1倍)。在轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下，第14天時(shí)95%的淋巴細(xì)胞變成NK細(xì)胞(⑶56+，⑶16+，⑶56+/⑶16+)，如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞作用下，外周血淋巴細(xì)胞有91%細(xì)胞變成NK細(xì)胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。實(shí)施例3擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和TAM (腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)的裂解作用在轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解作用以前的研究表明給患腫瘤的小鼠注射白介素2能夠增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實(shí)施例采用轉(zhuǎn)染CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，來(lái)研究用擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤的可行性。本實(shí)施例采用轉(zhuǎn)染CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞注射小鼠體內(nèi)治療小鼠體內(nèi)腫瘤的方法，來(lái)研究擴(kuò)增的NK細(xì)胞抗腫瘤的效果。將健康捐獻(xiàn)者的淋巴細(xì)胞中分離出來(lái)后，加入轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞和低劑量白介素2共同作用下擴(kuò)增的NK細(xì)胞生長(zhǎng)14天。Κ562和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被用來(lái)作為裂解的靶細(xì)胞。Κ562是B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系是血液腫瘤細(xì)胞系。IL-4，IL-10和IL-13處理后的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被用來(lái)作為裂解的靶細(xì)胞。擴(kuò)增的NK細(xì)胞和靶細(xì)胞按照適當(dāng)?shù)谋壤餐囵B(yǎng)6小時(shí)后檢測(cè)存活的靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、CD86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞與對(duì)照組NK細(xì)胞對(duì)Κ562靶細(xì)胞的殺傷作用相當(dāng)，而對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的殺傷作用則顯著增強(qiáng)，P < 0.05，如圖5所示。體外用Lentivirus系統(tǒng)構(gòu)建Fluc報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)的PC3細(xì)胞系。FlucLentivirus系統(tǒng)購(gòu)自System Biosciences (美國(guó)，加州),具體構(gòu)建方法詳見(jiàn)產(chǎn)品介紹。PC3-Fluc細(xì)胞靜脈注射進(jìn)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，21天后熒光檢測(cè)器檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，隨機(jī)分組。擴(kuò)增后的NK細(xì)胞按照IxlO7細(xì)胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續(xù)治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖6顯示治療14天后腫瘤報(bào)告基因的熒光信號(hào)。轉(zhuǎn)染CD8 α -白介素21和CD137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞比對(duì)照組NK細(xì)胞PC3腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)。圖7顯示，對(duì)照組的NK細(xì)胞對(duì)延長(zhǎng)小鼠的存活率有一定的作用。而與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞顯著提高了對(duì)腫瘤的治愈率，顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活率。這提示轉(zhuǎn) 染⑶8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562滋養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以用于臨床的腫瘤治療。
在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一個(gè)可以用來(lái)制成藥物的方案，按照這個(gè)方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個(gè)方案包括白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD137。利用本方案擴(kuò)增的NK細(xì)胞適用于需要增強(qiáng)病人免疫力的各種情景。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對(duì)治療腫瘤特別有效，如急性髓細(xì)胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴(kuò)增NK細(xì)胞對(duì)治療細(xì)菌，真菌或寄生蟲(chóng)內(nèi)感染特別有效。擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴(kuò)增的NK細(xì)胞可以顯著提高抗原的作用效果。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)染⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的Κ562細(xì)胞可用來(lái)擴(kuò)增NK細(xì)胞，也可以移植病人。體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞可移植病人。例如，CD8a-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137和低劑量白介素2擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法比用僅轉(zhuǎn)染⑶8 a -白介素21和⑶137的K562細(xì)胞激活擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，擴(kuò)增的效率高2.4倍。兩個(gè)星期后，NK細(xì)胞的純度可以達(dá)到95%，細(xì)胞的數(shù)量可以達(dá)到1.0xlOici以上，滿足臨床治療的需求，如圖4所示。
申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，使用跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD137的混合物與白介素2共同作用擴(kuò)增激活淋巴細(xì)胞，其中所述跨膜白介素21為白介素21與膜蛋白或膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域相連而成的復(fù)合物，優(yōu)選地為白介素21與CD8a的胞外結(jié)構(gòu)域相連而成的復(fù)合物；優(yōu)選地，所述⑶8 a、白介素21、CD14、⑶19、⑶86和⑶137分別包含⑶8 a、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的完整氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中加入兩次或更多次的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137混合物，優(yōu)選地，所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD137混合物的 劑量為50pM-1000pM，更優(yōu)選地500pM 800pM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述跨膜白介素21、CD14、CD 19、CD86和CD137的混合物為純化后的蛋白混合物或由同一宿主細(xì)胞即時(shí)表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞為純化的或未純化的，優(yōu)選地，所述淋巴細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞、純化的NK細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的組合、純化的NK細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞和別的淋巴細(xì)胞的組合、或白介素2和/或白介素21和/或CD137混合物注射進(jìn)人體血管后作用的血液中所有白細(xì)胞，優(yōu)選地所述純化是指NK細(xì)胞為細(xì)胞總數(shù)的50%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137分別采用蛋白穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選地，所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137各自的表達(dá)載體中均含有病毒啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為K562細(xì)胞；優(yōu)選地，當(dāng)所述跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137混合物同時(shí)由K562細(xì)胞即時(shí)表達(dá)時(shí)，所述K562細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的用量比例為K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=1-10:1，更優(yōu)選地，為K562細(xì)胞:淋巴細(xì)胞=1-4:1，最優(yōu)選地為2: 1-3:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其中所述白介素2的最低劑量為50單位/毫升，優(yōu)選地，加入兩次或更多次所述白介素2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)在含有所述淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液中，加入同時(shí)表達(dá)跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的經(jīng)過(guò)輻照的K562細(xì)胞以及白介素2共同培養(yǎng)7天； (2)將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，獲取細(xì)胞沉淀，并用與步驟(I)中等量的培養(yǎng)液重懸；和 (3)加入所述K562細(xì)胞，培養(yǎng)7天； 其中，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液為=Eagle培養(yǎng)液加入10%人血清或10%小牛血清；或RPMI1640 加入 10%人血清或 10% 小牛血清；或 F-10 (Ham，s) Nutrient mixtures 加入 10%人血清或10%小牛血清；優(yōu)選地，所述輻照的劑量為100Gy-1000Gy。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)所述方法擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞溶于生理鹽水溶液，優(yōu)選地用于靜脈滴注。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法在制備在用于在受治療者中治療癌癥或傳染性疾病的藥物的制備中的應(yīng)用， 其中，優(yōu)選地所述受治療者是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是人類； 所述癌癥優(yōu)選地為急性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細(xì)胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種； 所述傳染性疾病優(yōu)選為細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)感染，更優(yōu)選地為乙肝病毒，甲肝病毒，丙肝病毒和 艾滋病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種K562細(xì)胞擴(kuò)增激活NK細(xì)胞的方法，其包括使用跨膜白介素21，CD14，CD19，CD86和CD137轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和低濃度白介素2共同作用定向擴(kuò)增激活NK細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是與現(xiàn)有的類似復(fù)合物相比，本發(fā)明的復(fù)合物擴(kuò)增和激活淋巴細(xì)胞的能力更強(qiáng)，效率更高。本發(fā)明在免疫治療方面具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK103232973SQ20131005308
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者吳忠福, 徐以兵, 董生聚 申請(qǐng)人:浙江中贏方舟生物工程股份有限公司