專利名稱：富集短鏈核酸的方法
富集短鏈核酸的方法 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/EP2006/069484，國際申請日為2006年12月08日，進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?00680046308.3，名稱為“富集短鏈核酸的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及富集長度小于300個核苷酸的核酸的方法，涉及用于富集長度小于300個核苷酸的核酸的試劑盒，涉及所述試劑盒的用途，涉及陰離子交換基質(zhì)的用途并涉及治療疾病的方法。若干年前，由于發(fā)現(xiàn)小的核糖核酸(RNA)執(zhí)行了基因表達(dá)的實質(zhì)調(diào)節(jié)功能，因此科學(xué)研究日益集中于短于300個核苷酸，尤其是短于100個核苷酸的小RNA。更具體地說，許多研究者已經(jīng)對微小RNA(miRNA)感興趣。miRNA是一類在進(jìn)化上保守的長度約22個核苷酸的小的非編碼RNA，其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的復(fù)雜作用正變得越來越明顯。已在所研究的所有真核生物和幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn)miRNA，其中包括真菌、植物、昆蟲和哺乳動物。除了miRNA，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它小RNA在細(xì)胞功能中也扮演重要角色。這些小RNA包括，例如，小干擾 RNA(siRNA)、核小 RNA (snRNA)和核仁小 RNA (snoRNA)。這些短于300個 核苷酸的短RNA必須盡可能純并以高產(chǎn)率從要研究的生物系統(tǒng)中純化，這樣才能夠研究它們的細(xì)胞作用。因此迫切需要提供能夠從復(fù)雜生物系統(tǒng)、尤其從細(xì)胞裂解物中純化和分離這種短RNA的方法。通常，為分離生物樣品中的核酸，必須將它們與剩余的細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)和其它組分分離?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了多種從非常不同的原料，如從細(xì)胞培養(yǎng)物、從植物和動物來源的組織、以及從體液分離核酸的方法。例如，一種方法包括在有機溶劑如酚和氯仿的幫助下提取通常為水性的原始溶液(Chomczynski和Sacchi, 1987),然后在醇類如乙醇或異丙醇的幫助下從水相中沉淀核酸(Sambrook, J., Fritsch, E.F.1n T.Maniatis,CSH, "Molecular Cloning", 1989)。另一種方法包括將核酸固定于固相,例如通過娃吸附技術(shù)。不利的是，所有這些方法不能、或不足以分離或至少純化相對較小的核酸。為解決該問題，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了專門富集小RNA群體的方法，該方法基于硅膜技術(shù)。在這些方法中，在將細(xì)胞裂解之后在細(xì)胞裂解物中加入相對小量的醇，在離液結(jié)合條件下至少部分相對較長的核酸可結(jié)合于硅膜。然而，現(xiàn)有技術(shù)所述純化方法中所用醇的量過低，因此不能使小核酸也有效結(jié)合于硅膜，因此這些小RNA出現(xiàn)在流出液中。然后提高流出液的醇濃度，然后再結(jié)合第二硅膜。洗滌步驟之后，小RNA與未結(jié)合于第一柱的所有其它核酸一起被洗脫(參見，例如，來自美國奧斯汀安拜恩公司(Ambion，Austin, USA)的■>Vana 試劑盒或來自德國希爾登恰根公司(QIAGEN, Hilden, Germany)的RNeasy 脂組織迷你試劑盒，使用方法見"使用手冊")。恰根與安拜恩法的缺點在于需要使用兩種固相，且通過單次結(jié)合步驟無法僅獲得所需的小RNA。此外，例如，如果不同時分離tRNA和其它較大核酸，則該方法無法分離大小約22個核苷酸的miRNA。盡管在某些條件下通過該方法可以富集小RNA，尤其是miRNA達(dá)到一定程度，但所述小RNA仍會被其它核酸尤其被轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)污染。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點。
更具體地說，本發(fā)明的目的是提供一種富集(enrich)小核酸，尤其是miRNA的方法，例如，該方法能夠采用盡可能少的方法步驟從復(fù)雜的生物組合物如細(xì)胞裂解物中富集小核酸。本發(fā)明的再一個目的是提供一種純化小核酸的方法，例如，該方法不僅能夠從復(fù)雜生物組合物如細(xì)胞裂解物中長度大于300個核苷酸的核酸或其它組分中除去長度為25個核苷酸或更小的特定核酸，還能夠從長度小于300且大于25個核苷酸的其它核酸如tRNA中特異性除去這些小核酸。本發(fā)明還提供了一種可用于盡可能單獨產(chǎn)生所需大小的RNA的方法。本發(fā)明的再一個目的是提供一種無需改變反應(yīng)容器的方法一通過“單容器反應(yīng)(one-pot reaction) ” 一從而將待分析樣品的混合風(fēng)險降至最低。本發(fā)明的再一個目 的是提供一種試劑盒，在該試劑盒的幫助下能夠如上所述從復(fù)雜生物組合物中有利地純化小核酸，尤其是小RNA。一種富集長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸，更優(yōu)選小于100個核苷酸，再優(yōu)選小于50個核苷酸，最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸的方法為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)，所述方法包括以下步驟:i)提供流體相(fluid phase),優(yōu)選水相P1,其中含有(α I)至少一種長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸，更優(yōu)選小于100個核苷酸，再優(yōu)選小于50個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸,和( α 2)至少一種不同于所述核酸(α I)的組分，ii)使所述相P1接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α I)結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)，iii)任選地用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì)，其中所述核酸(α I)仍舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)，和iv)從所述陰離子交換基質(zhì)上除去，優(yōu)選洗脫，結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(α I)以獲得含有核酸(α I)的流體相，優(yōu)選水相Ρ2。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合然后再洗滌和洗脫，而不需要上述恰根和安拜恩法所需的首先稀釋較長核酸，便可從除所述小核酸外可能含有眾多其它組分的復(fù)雜生物組合物中富集長度小于300個核苷酸的小核酸。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方式，要純化的核酸(α I)是單鏈或雙鏈RNA，優(yōu)選雙鏈RNA。更具體地說，優(yōu)選的長度小于300個核苷酸的RNA是選自下組的RNA:miRNA,前 miRNA，siRNA, snRNA, snoRNA, tRNA, 5S_rRNA，5.8S_rRNA 或其中至少兩種的混合物，尤其是miRNA和tRNA的混合物，更優(yōu)選的核酸(α I)是miRNA，其長度在15-30個核苷酸之內(nèi)，再優(yōu)選為17-24個核苷酸，最優(yōu)選其長度為20-23個核苷酸。術(shù)語“5S-rRNA”和“5.SStRNA"表示可在真核核糖體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非編碼核糖核酸。術(shù)語“tRNA”表示由約80個核苷酸構(gòu)成并含有共軛堿基對(腺嘌呤和尿嘧啶；胞嘧啶和鳥嘌呤)的核糖核酸。這些堿基對造成了 tRNA苜蓿葉樣結(jié)構(gòu)。術(shù)語“siRNA”表示長度約為22個核苷酸的核糖核酸，它是通過酶“切割機”切割雙鏈RNA (dsRNA)并摻入“RISC”(RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)酶復(fù)合體而產(chǎn)生的。術(shù)語“snRNA”表示真核生物細(xì)胞核內(nèi)大小約100-300個堿基對的催化活性RNA。這些snRNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成“snRNP” (核小核糖核蛋白)并負(fù)責(zé)剪切掉前mRMA中的內(nèi)含子以得到mRNA。術(shù)語“snoRNA”表示一類涉及核糖體RNA(rRNA)和其它RNA基因的化學(xué)修飾，如甲基化的核糖核酸。它們形成“snoRNP”(核仁小核糖核蛋白)的一部分。術(shù)語“miRNA”表示用于調(diào)節(jié)植物和動物發(fā)育過程的小核酸。它們特異性結(jié)合mRNA并阻止后者在翻譯中的活性，例如防止過量產(chǎn)生生長因子。miRNA是從雙鏈前體產(chǎn)生的單鏈RNA分子。不同于長度不超過300個核苷酸的核酸(α I)的組分(α 2)是長度至少為300個核苷酸的特定核酸(α 2’)和不同于核酸的組分(α 2〃)。長度至少為300個核苷酸的核酸(α 2’)具體包括單鏈或雙鏈DNA分子或者單鏈或雙鏈 RNA 分子，例如 mRNA、18S-rRNA 或 28S_rRNA。不同于核酸的組分(α 2〃)具體是指細(xì)胞裂解過程中釋放的那些組分。因此，這些組分具體包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多肽或多糖。方法步驟i)中提供的流體相，優(yōu)選水相P1可以是不含細(xì)胞的樣品材料、血漿、血清、體液(如血液、尿液、精液、唾液、腦脊髓液、痰液)、表面活檢樣品、廢水、淤泥或細(xì)胞裂解物(如來自動物或植物組織、來自微生物如細(xì)菌、真菌或酵母、來自組織培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物、或者來自體液如血液的細(xì)胞裂解物)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，方法步驟i)中提供的流體相，優(yōu)選水相P1是通過包括以下步驟的方法獲得的細(xì)胞裂解物:I)提供細(xì)胞，II)裂解細(xì)胞以獲得細(xì)胞裂解物，和III)任選地從所述細(xì)胞裂解物中至少部分地分離至少一種不同于核酸(a J的組分(α 2)。 方法步驟I)中提供的細(xì)胞可以是任選固定的組織切片或任選固定的組織片段、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或者是體液中的細(xì)胞。如果細(xì)胞是貼壁細(xì)胞或組織裝配體內(nèi)的細(xì)胞，則方法步驟I)可任選包括洗滌該貼壁細(xì)胞或組織，用合適的酶溶液分開貼壁細(xì)胞或或從組織中除去細(xì)胞，所述溶液含有諸如EDTA等配位化合物或其混合物，并任選通過例如細(xì)胞分選儀、沉淀分開或分離的細(xì)胞、洗滌如此獲得的細(xì)胞團(tuán)并任選重懸于合適的懸浮緩沖液等方法從如此獲得的細(xì)胞懸浮液中分離特定細(xì)胞群。然而，無需先分開也可以裂解貼壁細(xì)胞，這之后宜進(jìn)行洗滌步驟。如果所述細(xì)胞是懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或體液內(nèi)的細(xì)胞,則方法步驟I)優(yōu)選包括沉淀懸浮細(xì)胞，這之后宜例如通過細(xì)胞分選儀除去特定細(xì)胞群，洗漆如此獲得的沉淀細(xì)胞并任選重懸于合適的懸浮緩沖液。沉淀細(xì)胞可任選地重懸其中的懸浮緩沖液優(yōu)選含有一種或多種緩沖物質(zhì)和任選的一種或多種配位化合物。懸浮緩沖液的PH可在較寬范圍內(nèi)變化并能夠進(jìn)行本發(fā)明方法，優(yōu)選范圍為ΡΗ3-11，再優(yōu)選范圍為5-10，最優(yōu)選范圍為ρΗ7-9。這里可采用熟練技術(shù)人員已知的調(diào)節(jié)PH的緩沖系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選采用基于三(羥基甲基)氨基甲烷(TRIS)、嗎啉代丙磺酸(MOPS)或2-[4-(2_羥基乙基)-1-哌嗪子基]乙磺酸(HEPES)的緩沖系統(tǒng)，其所含緩沖組分的濃度范圍為0.5-lOOmmol/l，再優(yōu)選范圍為l-50mmol/l，最優(yōu)選范圍為
2.5-25mmol/L.也可使用基于堿金屬乙酸鹽/乙酸的緩沖系統(tǒng)或者堿金屬乙酸鹽/乙酸緩沖系統(tǒng)與三(羥基甲基)氨基甲烷緩沖系統(tǒng)的混合物。類似地，可采用的配位化合物可以是任何能夠與鈣離子特異性配位的化合物。優(yōu)選的配位化合物是乙二胺四乙酸(EDTA)，其在懸浮緩沖液中的含量優(yōu)選為0.01-20mmol/l，再優(yōu)選0.l-15mmol/l，最優(yōu)選0.5-5mmol/L.
所用懸浮緩沖液的量取決于提供的細(xì)胞數(shù)。通常，懸浮緩沖液的用量為每IO6個細(xì)胞 10-2000 μ I，更優(yōu)選 50-1000 μ I，最優(yōu)選 100-500 μ I。特別適用于本發(fā)明的懸浮緩沖液是含有0.5-100mmol/l，更優(yōu)選l-50mmol/l，最優(yōu)選約2.5-25mmol/l三(羥基甲基)氨基甲烷和0.01-20mmol/l，更優(yōu)選0.l_15mmol/l，最優(yōu)選0.5-5mmol/l EDTA的緩沖液，其pH范圍為7_9，更優(yōu)選約8。在方法步驟II)中，提供的細(xì)胞被裂解，可采用熟練技術(shù)人員已知的任何裂解方法裂解細(xì)胞，該方法適用于從細(xì)胞中釋放特定RNA材料?？刹捎玫牧呀夥椒ň唧w是通過加熱裂解、通過機械力裂解、通過諸如蛋白激酶K的酶裂解、通過使細(xì)胞接觸含去污劑或離液化合物的裂解緩沖液裂解、或通過低滲溶液裂解。適當(dāng)時，也可將上述方法結(jié)合，例如在含有去污劑或離液化合物的裂解緩沖液中機械破碎細(xì)胞，或者使用含有蛋白激酶K和離液化合物的裂解緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選用含有去污劑、酶、離液化合物或這些組分中至少兩種的混合物的裂解緩沖液裂解細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了大量合適的去污劑。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的去污劑選自下組:十二烷基硫酸鈉(SDS)，聚乙二醇-苯酚醚如TritonX-100、Tween、NP-40或其混合物，SDS和Triton X-100是特別優(yōu)選的去污劑。如果所用去污劑為SDS，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選每摩爾SDS使用l-30mol，優(yōu)選2_20mol，最優(yōu)選3_6molNa0H或Κ0Η，更優(yōu)選NaOH，以裂解細(xì)胞。如果裂解緩沖液含有去污劑，根據(jù)本發(fā)明在步驟II)中還優(yōu)選在每IO6細(xì)胞中存在0.01-100 μ mol，更優(yōu)選0.1-50 μ mol，最優(yōu)選0.25-5 μ mol去污劑時裂解細(xì)胞。當(dāng)采用去污劑來裂解細(xì)胞時，如果所述去污劑是室溫室壓下為液體的化合物，則通常在存在0.005-5%(v/v)，更優(yōu)選0.01-1%(v/v)，最優(yōu)選0.025-0.5%(v/v)去污劑時裂解細(xì)胞，如果所述去污劑是室溫室壓 下為固體的化合物，則通常在存在0.01-1重量％，更優(yōu)選0.25-5重量％，最優(yōu)選0.05-0.4重量％去污劑時裂解細(xì)胞。優(yōu)選的離液化合物尤其是離液鹽。出于本發(fā)明的目的，離液鹽優(yōu)選表示對水有高親和力(競爭力、吸引力)從而形成較大的緊密水化膜(hydration envelope)(外殼狀的水分子)的鹽。優(yōu)選的離液鹽尤其是異硫氰酸胍或鹽酸胍，特別優(yōu)選異硫氰酸胍。如果采用離液鹽來裂解細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選在離液鹽濃度為0.5-lOmol/l，更優(yōu)選為l-5mol/l，最優(yōu)選為2-3.5mol/l時在方法步驟II)中裂解細(xì)胞。如果裂解緩沖液中含有離液鹽，同樣有利的是所述裂解緩沖液可任選含有與水混溶的有機溶劑，如與水混溶的醇如乙醇或異丙醇，其含量為10-60體積％，更優(yōu)選20-50體積％。優(yōu)選的酶尤其是蛋白酶，其中更加優(yōu)選胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶Lys-C，最優(yōu)選蛋白酶K。每種情況下基于裂解緩沖液的總重，裂解緩沖液中的酶濃度范圍優(yōu)選為0.01-10重量％，更優(yōu)選0.1-5重量％，最優(yōu)選0.2-1重量％。裂解緩沖液中去污劑、離液鹽或酶的濃度也取決于要裂解的細(xì)胞量和方法步驟I)中提供所述細(xì)胞的方式。如果要裂解的細(xì)胞首先被懸浮于懸浮緩沖液，則裂解緩沖液所含去污劑、離液鹽或酶的濃度高于細(xì)胞裂解期間所需的所述組分的濃度。然后將這種富集的裂解緩沖液加入細(xì)胞懸液，加入量足以使所述細(xì)胞懸液中離液鹽、去污劑或酶的濃度能夠滿足盡可能完全裂解細(xì)胞的需要，并如上文所述。然而，例如，如果裂解緩沖液被直接用于貼壁細(xì)胞或接觸細(xì)胞團(tuán)，則所述裂解緩沖液所含去污劑、離液鹽或酶的濃度優(yōu)選為細(xì)胞裂解期間存在的濃度。根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，在存在0.1-lmol/l，更優(yōu)選0.2-0.8mol/1，最優(yōu)選0.3-0.7mol/l堿金屬鹽時裂解細(xì)胞,優(yōu)選氯化鈉、氯化鉀和氯化鋰,特別優(yōu)選氯化鈉。如果首先將要裂解的細(xì)胞懸浮于懸浮緩沖液，則適量的堿金屬鹽可以已經(jīng)加入所述懸浮緩沖液，或者可將含有相對較高濃度堿金屬鹽的裂解緩沖液加入懸浮緩沖液。然而，例如，如果將裂解緩沖液直接用于貼壁細(xì)胞或接觸細(xì)胞團(tuán)，則所述裂解緩沖液優(yōu)選含有上述濃度范圍內(nèi)的堿金屬鹽。特別適用于本發(fā)明并可加入細(xì)胞懸液的裂解緩沖液是含有l(wèi)-200mmol/l，更優(yōu)選
5-150mmol/l，最優(yōu)選約 10-100mmol/l NaOH 以及 0.01-1% (v/v)，更優(yōu)選 0.025-0.5% (v/v)，最優(yōu)選0.05-0.4%(v/v) SDS’且pH范圍為5_7，更優(yōu)選約5.5的緩沖液。在細(xì)胞懸液中加入該裂解緩沖液的體積比優(yōu)選為3:1-1:3，更優(yōu)選為2:1-1:2，最優(yōu)選的體積比為約1:1。特別適用于本發(fā)明并可加入細(xì)胞團(tuán)、加入貼壁細(xì)胞或者加入組織切片或組織片段的裂解緩沖液是:-含有0.1-lmol/l，更優(yōu)選 0.25-0.75mol/l，最優(yōu)選約 0.4-0.6mol/l NaCl 以及0.1-10%(v/v)，更優(yōu)選 0.5-5%(v/v)，最優(yōu)選 0.75-1.5%(v/v) Triton X-1OO 且 pH 范圍為
6-8，更優(yōu)選約7的緩沖液，或-含有0.5-10mol/l,更優(yōu)選l_5mol/l,最優(yōu)選約1.5_3mol/l異硫氰酸胍，l-50mmol/l,更優(yōu)選 5-40mmol/l,最優(yōu)選 10_20mmol/l 朽1 檬酸鈉以及 10-60%(v/v),更優(yōu)選20-50%(v/v)，最優(yōu)選30-40%(v/v)乙醇，且pH范圍為6-8，更優(yōu)選約7的緩沖液，要加入待裂解細(xì)胞的所述裂解緩沖液的量優(yōu)選為每IO6細(xì)胞50-2000 μ 1，更優(yōu)選100-1000 μ 1，最優(yōu)選 150-300 μ 1。如果細(xì)胞存在于組織切片或組織片段中，則方法步驟I)中的提供細(xì)胞優(yōu)選包括在從植物或動物中取出后使所述組織切片或所述組織片段立即接觸液氮。然后優(yōu)選使所述組織切片或組織片段立即接觸裂解緩沖液，適當(dāng)?shù)脑捒赏ㄟ^合適的均化裝置將其均化。細(xì)胞在接觸裂解緩沖液之后，可在15-40°C的溫度范圍內(nèi)，然后尤其優(yōu)選室溫，將細(xì)胞裂解1-60分鐘，更優(yōu)選2-15分鐘。在方法步驟ii)中使細(xì)胞裂解物以水相P1的方式接觸陰離子交換基質(zhì)之前，根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，預(yù)先從細(xì)胞裂解物中分離出一種或多種不同于核酸(α I)的組分(α 2)也是有利的。原則上，所述分離可采用熟練技術(shù)人員已知的任何分離方法，如沉淀反應(yīng)、通過透析或色譜分離或者萃取，特別優(yōu)選萃取，尤其是用酸性苯酚或苯酚與氯仿的混合物萃取，最優(yōu)選用酸性苯酚萃取。這涉及使酸性苯酚與細(xì)胞裂解物接觸并例如用渦漩攪拌器將其徹底混合，其體積比優(yōu)選為3:1-1: 3，更優(yōu)選2:1-1: 2，最優(yōu)選約1:1。然后將組合物離心并將水相與有機相分離。通過這種方法，一種或多種不同于核酸(α )的組分便被稀釋于分開的水相，然后將其作為相P1對其進(jìn)行方法步驟ii)。在本發(fā)明方法的方法步驟ii)中，然后使水相P1接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α I)結(jié)合于所述陰離子交換基質(zhì)。原則上，這里可以采用任何在水相P1接觸陰離子交換基質(zhì)的條件下，尤其在pH條件下具有至少部分陽離子形式官能團(tuán)的材料作為陰離子交換基質(zhì)。陰離子交換基質(zhì)優(yōu)選含有電中性基質(zhì)的固體。根據(jù)大小、形式、孔隙率、機械特性以及優(yōu)選與固體骨架共價結(jié)合的正電官能團(tuán)定義這種基質(zhì)。三種最常用類型的基質(zhì)材料是原硅酸、多糖和合成聚烯烴，采用的聚烯烴主要是聚苯乙烯或聚(甲基)丙烯酸樹脂。聚(甲基)丙烯酸樹脂包括各種取代的(甲基)丙烯酰胺的聚合物(=聚(甲基)丙烯酰胺)和(甲基)丙烯酸酯的聚合物(=聚(甲基)丙烯酸酯)，(甲基)丙烯酸單體在C-2或C-3原子上可帶有烷基取代基。特別優(yōu)選的結(jié)合于該基質(zhì)的官能團(tuán)是選自下組的官能團(tuán):伯、仲或叔氨基，膦基，肼基和亞胺基。最優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)是共價結(jié)合有二乙基氨基乙基(DEAE，[CH3CH2)2N-CH2-CH2-]a)的骨架材料，尤其是DEAE纖維素，以及含有[-CH2-CH2-NH-]基團(tuán)和/或[-CH2-CH2-N(CH2CH2-NH2)-]基團(tuán)的直鏈或支鏈的聚乙烯亞胺(polyethylenimines)。陰離子交換基質(zhì)還可被用作填料，例如在單獨的分離柱子中。然而，也可將其用作并非由具有陰離子交換特性的材料構(gòu)成的其它材料一尤其是顆粒、濾器、膜、整料(monolith)或其它有機或無機表面如微滴定板一或具有陰離子交換基質(zhì)的其它反應(yīng)容器的涂層。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)的形式為磁性或非磁性顆粒上的涂層，然而尤其優(yōu)選磁性，最優(yōu)選超順磁性、亞鐵磁性或鐵磁性顆粒上的涂層。與非磁性顆粒相t匕，磁性顆粒的優(yōu)勢在于能形成磁性聚集體，使得它們能從水相P1中溫和、迅速且有效地除去。優(yōu)選的 可涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性顆粒購自，例如，丹尼爾公司(Dynal)，先進(jìn)磁體公司(Advanced megnitics Inc.),生物技術(shù)有限公司(Biotechnologies Ltd.),愛美沙公司(Amersham),帕瑪咖公司(Promega),賽金公司(Scigen),先進(jìn)遺傳技術(shù)公司(Advanced Genetic Technologies)和斯萊利奧公司(Seradyn)。合適的磁性顆粒具體是W0-A-83/03920中描述的顆粒以及由挪威奧斯陸的丹尼爾公司(Dynal AS)以DYNA-BEADS出售的顆粒。如果采用的陰離子交換基質(zhì)是聚乙烯亞胺，則尤其優(yōu)選環(huán)氧化物官能化的磁性顆粒，例如以商品名“M-PVA EOx”購自德國貝斯威勒的切默更公司(Chemagen AG，Baesweiler, Germany)的那些顆粒。還可以使用羧酸酯官能化的顆粒，它們同樣可以商品名“M-PVA CU”或“M-PVA C12”購自切默更公司。所述磁性顆粒的平均至今優(yōu)選為
0.1-100 μ m，更優(yōu)選0.5-50 μ m，最優(yōu)選1-10 μ m，而其比表面積范圍優(yōu)選為0.5_250m2/g，更優(yōu)選為l_50m2/g。根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，根據(jù)本發(fā)明，在方法步驟ii)中優(yōu)選在pH優(yōu)選為2-10，更優(yōu)選為3-7，最優(yōu)選為4-6時使核酸(α I)附著于陰離子交換基質(zhì)。如果用于方法步驟ii)的水相P1的pH不同于這些pH值，尤其當(dāng)使用含有SDS的堿性裂解緩沖液時會遇到這種情況，在使水相P1接觸陰離子交換基質(zhì)之前或期間可能需要例如加入中和緩沖液來調(diào)節(jié)水相的pH到所需的值。所述中和緩沖液優(yōu)選含有乙酸的堿金屬鹽，更優(yōu)選乙酸鉀，其濃度范圍為10-10，000mmol/l，更優(yōu)選為50-5000mmol/l，最優(yōu)選為100-1000mmol/l,中和液的pH優(yōu)選為2_8，更優(yōu)選為4_6。優(yōu)選通過加入乙酸將乙酸的堿金屬鹽溶液的PH調(diào)至上述范圍。根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，在方法步驟ii)中，還優(yōu)選在存在堿金屬鹽，優(yōu)選存在氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰，然而更優(yōu)選存在氯化鈉時使核酸(α )附著于陰離子交換基質(zhì)，附著期間所述堿金屬鹽的濃度范圍優(yōu)選為0.01-10mol/l,更優(yōu)選為
0.05-5mol/l，最優(yōu)選為0.25-0.75mol/l?？赏ㄟ^在最初加入的水相P1 (例如細(xì)胞裂解物)中加入適當(dāng)濃縮的鹽溶液，或者通過在存在懸浮緩沖液時懸浮細(xì)胞或在存在裂解緩沖液時裂解細(xì)胞，這兩種緩沖液都具有合適的鹽濃度，從而調(diào)節(jié)附著期間這些鹽的濃度。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個具體實施方式
，在方法步驟ii)中，還優(yōu)選在存在離液物質(zhì)，尤其是離液鹽如異硫氰酸胍時使核酸(α )附著于陰離子交換基質(zhì)，附著期間所述離液鹽的濃度優(yōu)選為0.l-10mol/l,更優(yōu)選為0.5-5mol/l,最優(yōu)選為l_3mol/l。在本發(fā)明方法的這個具體實施方式
中，在存在與水混溶的有機溶劑，尤其是存在濃度為10-70體積％，更優(yōu)選20-60體積％的醇類如乙醇或異丙醇時進(jìn)行附著也是有益的。在方法步驟ii)中，當(dāng)使用陰離子交換基質(zhì)作為柱填料時，優(yōu)選使水相P1通過柱材料以便使核酸(α )附著于陰離子交換基質(zhì)，所述水相P1如細(xì)胞裂解物，其具有上述有利PH條件并含有規(guī)定濃度的上述鹽，通過時的溫度優(yōu)選為1_30°C，更優(yōu)選2-25°C，例如室溫。適當(dāng)時，可通過過壓、真空、離心或通過毛細(xì)管力支持使水相P1通過柱材料。當(dāng)采用涂有陰離子交換基質(zhì)的顆粒時，進(jìn)行附著時優(yōu)選連續(xù)攪拌與顆粒接觸的水相P1，例如通過振蕩器攪拌，此時，所述附著也優(yōu)選在溫度約為1-30°C，更優(yōu)選為2-25°C，例如在室溫下進(jìn)行。在核酸(α I)已附著于陰離子交換基質(zhì)之后，在方法步驟iii)中可任選地通過洗滌緩沖液洗滌后者。如果陰離子交換基質(zhì)已被用作柱填料，則優(yōu)選使洗滌緩沖液通過柱子進(jìn)行洗滌，這里還可以采用過壓、真空、離心或毛細(xì)管力。例如，如果采用涂有陰離子交換基質(zhì)的非磁性顆粒，則首先通過例如過濾或離心將所述顆粒從水相P1中除去，然后用洗滌緩沖液洗滌。當(dāng)采用涂有陰離子交 換基質(zhì)的磁性顆粒時，優(yōu)選使含有與水相P1接觸的磁性顆粒的反應(yīng)容器暴露于磁體，使所述磁性顆粒在磁場作用下附著于反應(yīng)容器內(nèi)壁，從而進(jìn)行洗滌。在這些條件下可方便地除去水相P1并用洗滌緩沖液代替。適用于該過程的裝置可購自，例如，挪威奧斯陸的丹尼爾公司。洗滌緩沖液例如可以是不含RNA酶的水，水和水溶性有機溶劑的混合物，如水和1-80體積％的水溶性醇，例如和1-80體積％的乙醇或異丙醇的混合物，或是鹽的水溶液，尤其是乙酸鹽水溶液，例如乙酸鈉水溶液，該溶液的濃度為l-50mmol/l，更優(yōu)選5-25mmol/l，尤其優(yōu)選所述洗滌緩沖液的PH為4-9。洗滌步驟可按需重復(fù)一次、兩次、三次，適當(dāng)時甚至更多次，每次都采用新鮮的洗滌緩沖液。在方法步驟ii)中使核酸(α I)附著于陰離子交換基質(zhì)并在方法步驟iii)中任選洗滌之后，在方法步驟iv)中可將結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(α I)從陰離子交換基質(zhì)上除去，得到含有核酸(α I)的流體相，優(yōu)選水相Ρ2。所述除去優(yōu)選通過洗脫使陰離子交換基質(zhì)接觸能解除陰離子交換基質(zhì)的官能團(tuán)與核酸(α )之間的結(jié)合的洗脫緩沖液來進(jìn)行，得到的洗出液為流體相P2，其含有核酸
OI)。如果陰離子交換基質(zhì)被用作柱填料，則優(yōu)選使洗脫緩沖液流過該柱來進(jìn)行洗脫，還可以利用過壓、真空、離心或毛細(xì)管力。例如，如果采用涂有陰離子交換基質(zhì)的非磁性顆粒，則例如先通過過濾或離心從水相P2或從洗滌緩沖液中除去這些顆粒，然后與洗脫緩沖液接觸。當(dāng)采用涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性顆粒時，優(yōu)選使含有與水相P1或洗滌緩沖液接觸的磁性顆粒的反應(yīng)容器暴露于磁體，使所述磁性顆粒在磁場作用下附著于反應(yīng)容器內(nèi)壁，從而進(jìn)行洗滌。在這些情況下可方便地除去水相P1或洗滌緩沖液并用洗滌緩沖液代替。所述洗脫緩沖液優(yōu)選是鹽的水溶液，尤其是含有堿金屬鹵化物如NaCl、KCl或LiCl，堿土金屬鹵化物如CaCl2或MgCl2，銨鹽如氯化銨或硫酸銨，或者這些鹽中至少兩種的混合物的水溶液，所述洗脫緩沖液還可以任選含有緩沖系統(tǒng)如堿金屬乙酸鹽/乙酸或者基于三(羥基甲基)氨基甲烷的緩沖系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明方法的一 個具體實施方式
，洗脫緩沖液含有水溶性鈣鹽如CaCl2，水溶性鎂鹽如MgCl2,水溶性銨鹽如硫酸銨或氯化銨，或者這些鹽中至少兩種的混合物。如果洗脫緩沖液含有CaCl2，則該鹽的濃度優(yōu)選為l-1000mmol/l，更優(yōu)選為5-500mmol/l，最優(yōu)選為10-100mmol/l。如果所述洗脫緩沖液含有MgCl2，則該鹽的濃度優(yōu)選為1-1OOOmmol/1，更優(yōu)選為5-500mmol/l，最優(yōu)選為10-100mmol/l。如果所述洗脫緩沖液含有硫酸銨和/或氯化銨，則這些鹽的總濃度優(yōu)選為l-1000mmol/l，更優(yōu)選為5-500mmol/l，最優(yōu)選為20-300mmol/l。洗脫緩沖液的pH優(yōu)選為5_12，優(yōu)選為6_10，更優(yōu)選為7_10。所述洗脫緩沖液優(yōu)選只含鈣鹽，尤其是CaCl2,和/或銨鹽，優(yōu)選硫酸銨和/或氯化銨，這是因為相比tRNA這些鹽特別適合選擇性富集miRNA。從而通過采用由水和CaCl2構(gòu)成的洗脫緩沖液以及使用由水和硫酸銨或氯化銨構(gòu)成的洗脫緩沖液可以良好富集miRNA并同時稀釋tRNA，CaCl2的濃度優(yōu)選最高達(dá)60mmol/l，硫酸銨或氯化銨的濃度優(yōu)選最高達(dá)170-200mmol/l，且因此，這些洗脫緩沖液特別適合從含有miRNA和tRNA的組合物中選擇性富集miRNA。特別適用于本發(fā)明的洗脫緩沖液是:-洗脫緩沖液EP1，其含有l(wèi)-10000mmol/l,更優(yōu)選10-5000mmol/l,最優(yōu)選50-1 OOOmmol / I TRIS, 1 ~1 OOOmmol / I ,優(yōu)選 5-800mmol/l,最優(yōu)選 10-500mmol/l 喊金屬鹽，優(yōu)選 NaCl 或 KCl，l-400mmol/l，更優(yōu)選 10-300mmol/l，最優(yōu)選 50-200mmol/l 銨鹽，優(yōu)選硫酸銨或氯化銨，以及0.l-200mmol/l，更優(yōu)選0.5-100mmol/l，最優(yōu)選l-50mmol/l鎂鹽，優(yōu)選氯化鎂，都溶于水，且PH優(yōu)選為7-11，更優(yōu)選8-10 ；-洗脫緩沖液EP2,其含有l(wèi)-1000mmol/l，更優(yōu)選5-500mmol/l，最優(yōu)選10-100mmol/l鎂鹽，優(yōu)選氯化鎂，溶于水，且pH優(yōu)選為6_10，更優(yōu)選7_9 ；-洗脫緩沖液EP3,其含有l(wèi)-1000mmol/l，更優(yōu)選5-500mmol/l，最優(yōu)選10-100mmol/l鈣鹽，優(yōu)選氯化鈣，溶于水，且pH優(yōu)選為6_10，更優(yōu)選7_9 ；-洗脫緩沖液EP4,其含有l(wèi)-1000mmol/l，更優(yōu)選5-500mmol/l，最優(yōu)選20-300mmol/l銨鹽，優(yōu)選氯化銨或硫酸銨，溶于水，且pH優(yōu)選為6_10，更優(yōu)選7_9 ；-洗脫緩沖液EP5,其含有l(wèi)-2000mmol/l，更優(yōu)選lO-lOOOmmol/l，最優(yōu)選100-500mmol/l堿金屬鹽，優(yōu)選氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰，都溶于水，且pH優(yōu)選為6-10，更優(yōu)選 7-9。更具體地說，洗脫緩沖液EP1-EP4適合從含有miRNA和tRNA的組合物中純化miRNA,而洗脫緩沖液EP5特別適合從含有除長度小于300個核苷酸的核酸，尤其是小于100個核苷酸的核酸外還含有長鏈核酸的組合物中大致純化所述核酸。此外，還可以通過升高洗脫緩沖液EP2-EP4中Mg2+、Ca2+和NH4+的濃度來選擇性調(diào)節(jié)從含有miRNA和tRNA的組合物中富集的miRNA對tRNA的富集度。根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施方式
，基于所述相P2中RNA總量的所述相P2中長度小于300個核苷酸,優(yōu)選小于100個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸的RNA的相對量比基于所述相P1中RNA總量的所述相P1中長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于100個核苷酸，最優(yōu)選小于25個核苷酸的RNA的相對量優(yōu)選大至少2倍，更優(yōu)選至少4倍，再優(yōu)選至少6倍，再優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少20倍。在本發(fā)明方法的其它具體實施方式
中，尤其是采用洗脫緩沖液EP1-EP4中任何一種的實施方式中，基于水相P2中miRNA和tRNA總量的水相P2中miRNA的相對量比基于水相P1中miRNA和tRNA總量的水相P1中miRNA的相對量優(yōu)選大至少2倍，更優(yōu)選至少4倍，再優(yōu)選至少6倍，再優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少20倍。一種用于富集長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于100個核苷酸，最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸的試劑盒也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)，所述試劑盒中裝有:(β I)裂解緩沖液或裂解緩沖液濃縮物，(β 2)陰離子交換基質(zhì)，(β 3)洗脫緩沖液，( β 4)任選的懸浮緩沖液，( β 5)任選的中和緩沖液，( β 6)任選的 洗滌緩沖液，和( β 7)任選的提取劑，例如苯酚、醇如乙醇，或其混合物。這種試劑盒可用于進(jìn)行上述方法。優(yōu)選的懸浮緩沖液(β 4)、裂解緩沖液(β I)、中和緩沖液(β 5)、洗滌緩沖液(β6)和洗脫緩沖液(β3)是上文描述的可與本發(fā)明方法有關(guān)的優(yōu)選緩沖液的那些緩沖液。裂解緩沖液濃縮物是含有可有效裂解的化合物，尤其是去污劑或離液鹽的緩沖液，其濃度高于細(xì)胞裂解期間的濃度。如果要將細(xì)胞懸液用作分離短鏈核酸的原料，則這種類型的裂解緩沖液濃縮物尤其有用，可通過加入規(guī)定量的所述裂解緩沖液濃縮物來調(diào)節(jié)裂解所需的裂解條件。適合作為陰離子交換基質(zhì)(β2)的是上述作為富集核酸的本發(fā)明方法中的優(yōu)選陰離子交換基質(zhì)的類似材料，尤其例如涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性或非磁性顆粒。根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個具體實施方式
，所述試劑盒含有涂有陰離子交換基質(zhì)的磁性顆粒作為陰離子交換基質(zhì)(β 2)以及選自EPp EP2, EP3或EP4中的任何緩沖液作為洗脫緩沖液(β3)。此外，將上述試劑盒用于本發(fā)明的方法以純化長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸,更優(yōu)選小于100個核苷酸,再優(yōu)選小于50個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)。將陰離子交換基質(zhì)用于純化長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸，更優(yōu)選小于100個核苷酸,再優(yōu)選小于50個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)，其中，所述陰離子交換基質(zhì)和所述核苷酸優(yōu)選為一開始提到的作為純化核酸的本發(fā)明方法的優(yōu)選組分的那些化合物。
最后，一種治療疾病的方法也為解決一開始提到的問題做出了貢獻(xiàn)，所述方法包括以下步驟:( y I)根據(jù)開頭描述的純化方法，通過包括富集長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸,更優(yōu)選小于100個核苷酸,再優(yōu)選小于50個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸的核酸的診斷方法診斷疾病，和( Y 2)治療性處理診斷出的疾病。要治療的疾病可以是其病因或進(jìn)程以任何方式與特定體細(xì)胞或體液中存在的核酸的種類和數(shù)量相關(guān)的任何疾病，所述核酸的長度小于300個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸，更優(yōu)選小于100個核苷酸,再優(yōu)選小于50個核苷酸,最優(yōu)選小于25個核苷酸,且尤其是與miRNA的種類和數(shù)量相關(guān)的疾病，與健康人相比，無論是這些核酸種類和數(shù)量的改變都是造成疾病的原因，或者與健康人相比，無論是這些核酸種類和數(shù)量的改變都是所述疾病的結(jié)果。將根據(jù)非限制性的附圖和實施例更加詳細(xì)地闡述本發(fā)明。

圖1描述了用于分離實施例1所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠；a=第一次洗滌后的洗滌緩沖液，b=第二次洗滌后的洗滌緩沖液，C=洗出液)。 圖2描述了用于分離實施例2所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。圖3描述了用于分離實施例3所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。圖4描述了用于分離實施例4所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。圖5描述了用于分離實施例5所得洗出液的硝酸銀染色的、濃度為15%的聚丙烯酰胺凝膠(一式兩份用于凝膠)。
實施例在以下實施例中，miRNA在細(xì)胞背景中形成尖峰。實施例1將IO6 個 Jurkat 細(xì)胞與 I μ g miR177 反義 miRNA 混合并在 550 μ I 含(λ 5Μ NaCl，l%(v/v) Triton X-1OO的裂解緩沖液的幫助下裂解細(xì)胞。冰上培育10分鐘之后加入550 μ I酸性苯酚。渦漩攪拌，然后20800 Xg離心5分鐘，將水相除去并與652 μ g涂有聚乙烯亞胺的磁性顆?；旌?。將4g環(huán)氧化物官能化磁性顆粒(購自德國貝斯威勒的切默更公司的M-PVA EOx顆粒)懸浮于50mll0%高分子量聚乙烯亞胺(西格瑪奧爾德利希公司(Sigma-Aldrich),Aldrich編號40，872-7)的水溶液，pHIO，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶并在60°C邊攪拌邊加熱10小時，從而獲得顆粒。然后解除磁性，用脫鹽水將該混合物洗滌6次。在平板振蕩器上振蕩5分鐘之后，棄去上清液，之后用500 μ I水洗滌2次，將pH調(diào)至4.7、5.5、7.0或8.5(圖1凝膠的&和13道)。用 20μ1 含 lmol/1 Tris/Cl, pH9.5,400mmol/l KC1，100mmol/l硫酸銨和30mmol/l MgCl2的緩沖液進(jìn)行洗脫。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖1的C道)。采用0.5mol/l NaCl作為裂解緩沖液，它可以有效純化miRNA，使洗脫后的洗出液中僅保留miRNA和tRNA，而所有其它核酸類型都已通過純化過程被稀釋。實施例2如實施例1所述,將IO6個Jurkat細(xì)胞與I μ g let7a反義RNA混合,裂解并結(jié)合于磁性顆粒。用水洗漆兩次之后，用20 μ I含100mmol/l NaCl, 250mmol/lNaCl, 400mmol/lNaCl,100mmol/l KCl, 250mmol/l KCl和400mmol/l KCl的緩沖液作為洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖2)。該實驗揭示，洗脫時可采用不同摩爾濃度的鹽。當(dāng)采用NaCl、KC1和LiCl (數(shù)據(jù)未顯示)作為洗脫緩沖液時，可以高產(chǎn)量地同時純化tRNA和miRNA。實施例3其過程如實施例2所述，用含lO-lOOmmol/l MgCl2的緩沖液作為洗脫緩沖液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖3)。該實驗證實，用MgCl2作為洗脫緩沖液也可純化miRNA。如果采用低摩爾濃度的MgCl2作為洗脫緩沖液，則可相當(dāng)?shù)叵♂宼RNA和較長核酸，同時可以非常好的產(chǎn)率回收miRNA。實施例4其過程如實施例2所述，用含10-85mmol/l CaCl2的緩沖液作為洗脫緩沖液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖4)。當(dāng)CaCl2的摩爾濃度最高達(dá)約50mmol/l時，可以非常好的回收率洗脫miRNA，同時洗出液中僅含有痕量tRNA。如果進(jìn)一步升高摩爾濃度，還有可能以良好的回收率洗脫tRNA ο實施例5其過程如實施例2所述，用含25-400mmol/l硫酸銨或25-400mmol/l氯化銨的緩沖液作為洗脫緩沖液。在15%聚丙烯酰胺凝膠上加入等分洗出液并用硝酸銀染色(圖5)。尤其是銨鹽，與氯化鈣一起，在洗脫時顯示出最佳特性，可實現(xiàn)高的miRNA產(chǎn)率同時獲得非常低的tRNA產(chǎn)率。當(dāng)洗脫液中的銨鹽濃度最高達(dá)約170-200mmol/l時，tRNA的產(chǎn)率仍舊相對較低，而這些摩爾濃度下mi RNA的產(chǎn)率非常好。當(dāng)濃度升高到約400mmol/l時，在洗出液中也可發(fā)現(xiàn)非常大量的tRNA。
權(quán)利要求
1.一種從復(fù)雜的生物組合物中富集長度小于300個核苷酸的核酸的方法，所述生物組合物中除長度小于300個核苷酸的核酸外還包含其它組分，所述方法包括以下步驟: i)提供流體相，優(yōu)選水相P1，其中含有 (ol)至少一種長度小于300個核苷酸的核酸,和 (α 2)至少一種不同于所述核酸(α I)的組分， )使所述相P1接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α I)結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)上，其中所述核酸在3-7的pH值范圍下結(jié)合所述陰離子交換基質(zhì)，其中所述陰離子交換基質(zhì)具有官能團(tuán)，所述官能團(tuán)在水相P1接觸所述陰離子交換基質(zhì)的條件下至少部分為陽離子形式，且其中所述陰離子交換基質(zhì)以磁性顆粒上的涂層形式存在， iii)任選地用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì)，其中所述核酸(αI)仍舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)，和 iv)從所述陰離子交換基質(zhì)上洗脫結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(αI)以獲得含有核酸(α 1)的水相P2。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸(αI)是RNA。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述RNA選自下組:miRNA，前miRNA，siRNA，snRNA, snoRNA, tRNA, 5S-rRNA, 5.8S_rRNA，或其中至少兩種的混合物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述RNA是miRNA、前miRNA、tRNA或者miRNA和tRNA的混合物。
5.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換基質(zhì)具有選自下組的官能團(tuán):氣基、勝基，餅基和亞胺基。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫通過所述陰離子交換基質(zhì)與能將所述陰離子交換基質(zhì)的官能團(tuán)與所述核酸(α I)之間的結(jié)合解除的洗脫緩沖液所接觸來進(jìn)行，得到的洗出液為含核酸U I)的水相P2，其中所述洗脫緩沖液優(yōu)選鹽的水溶液。
7.如權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液是含堿金屬鹵化物、堿土金屬鹵化物、銨鹽或這些鹽中至少兩種的混合物的水溶液，所述洗脫緩沖液還可包含緩沖系統(tǒng)。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液含有水溶性鈣鹽，優(yōu)選CaCl2、水溶性鎂鹽，優(yōu)選MgCl2、水溶性銨鹽，優(yōu)選硫酸銨或氯化銨、或所述鹽中至少兩種的混合物。
9.如權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液含有氯化鈣且具有下述特征之一: a)所述CaCl2濃度范圍為l-1000mmol/l； b)所述CaCl2濃度范圍為5-500mmol/l； c)所述CaCl2濃度范圍為10-100mmol/l。
10.如權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液含有氯化鎂且具有下述特征之一: a)所述MgCl2濃度范圍為l-1000mmol/l； b)所述MgCl2濃度范圍為5-500mmol/l；c)所述MgCl2濃度范圍為10-100mmol/l。
11.如權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液含有硫酸銨和/或氯化銨且具有下述特征之一: a)所述鹽總濃度范圍為l-1000mmol/l； b)所述鹽總濃度范圍為5-500mmol/l； c)所述鹽總濃度范圍為20-300mmol/l。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液的pH值范圍為 5-12。
13.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，使用只含鈣鹽，優(yōu)選CaCl2、和/或銨鹽，優(yōu)選硫酸銨和/或氯化銨的洗脫緩沖液。
14.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,使用由水和濃度多至60mmol/l的CaCl^l成的洗脫緩沖液或由水和濃度多至170-200mmol/l的硫酸銨或氯化銨組成的洗脫緩沖液。
15.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，選用來自下述的洗脫液: a)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP1:i)1-1OOOOmmo1/1、10-5000mmo1/1 或 50-1000mmol/l TRIS,ii)1-1OOOmmo 1/1 >5-800mmo 1/1 或 10-500mmol/l 喊金屬鹽，優(yōu)選 NaCl 或 KCl,`iii)l-400mmol/l> 10-300mmol/l 或 50-200mmol/l 銨鹽,優(yōu)選硫酸銨或氯化銨,和iv)0.l-200mmol/l、0.5-1 OOmmol / I 或 1 -SOmmol / I 續(xù)鹽,優(yōu)選氯化續(xù)， 且其PH值范圍優(yōu)選為7-11，更優(yōu)選8-10 ； b)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP2: l-1000mmol/l、5-500mmol/l或10-100mmol/l鎂鹽，優(yōu)選氯化鎂，且其pH值范圍優(yōu)選為6-10，更優(yōu)選7-9 ； c)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP3: l-1000mmol/l、5-500mmol/l或10-100mmol/l鈣鹽，優(yōu)選氯化鈣，且其pH值范圍優(yōu)選為6-10，更優(yōu)選7-9 ； d)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP4: l-1000mmol/l、5-500mmol/l或20-300mmol/l銨鹽，優(yōu)選氯化銨或硫酸銨，且其pH值范圍優(yōu)選為6-10，更優(yōu)選7-9 ； e)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP5: l-2000mmol/l>IO-1OOOmmo 1/1或100-500mmol/l堿金屬鹽,優(yōu)選氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰，且其pH值范圍優(yōu)選為6-10，更優(yōu)選7-9。
16.如上述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，方法步驟i)中提供的水相Pl是細(xì)胞裂解物，且其中所述細(xì)胞裂解物可通過包括以下步驟的方法獲得: I)提供細(xì)胞， II)裂解細(xì)胞以獲得細(xì)胞裂解物，和 III)任選地從所述細(xì)胞裂解物中至少部分地分離至少一種不同于核酸(Ci1)的組分(Ct 2)。
17.如權(quán)利要求2-16中任一項所述的方法，其特征在于，基于所述相P2中RNA總量的所述相P2中長度小于300個核苷酸的RNA的相對量比基于所述相P1中RNA總量的所述相P1中長度小于300個核苷酸的RNA的相對量大至少2倍或 其中基于水相P2中miRNA和tRNA總量的水相P2中miRNA的相對量比基于水相P1中miRNA和tRNA總量的水相P1中miRNA的相對量大至少2倍。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，在方法步驟ii)中，存在堿金屬鹽，優(yōu)選存在氯化鈉時所述核酸(α )附著于陰離子交換基質(zhì)，附著期間所述堿金屬鹽的濃度范圍優(yōu)選為0.01-10mol/l，更優(yōu)選為0.05_5mol/l，最優(yōu)選為0.25-0.75mol/l。
19.一種用于富集長度小于300個核苷酸的核酸的試劑盒，其中裝有: (β I)裂解緩沖液或裂解緩沖液濃縮物； (β2)陰離子交換基質(zhì)，其中所述陰離子交換基質(zhì)以磁性顆粒上的涂層形式存在； (β3)選自以下的洗脫緩沖液， (β3.1)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP1: i)1-1OOOOmmo1/1、10-5000mmo1/1 或 50-1000mmol/l TRIS,ii) 1 -1 OOOmmol / 1.5-800mmo1 / I 或 10-500mmol/l 喊金屬鹽，優(yōu)選 NaCl 或 KCl, iii)l-400mmol/l> 10-300mmol/l 或 50-200mmol/l 銨鹽,優(yōu)選硫酸銨或氯化銨,和iv)0.l-200mmol/l、0.5-1 OOmmol / I 或 1 -SOmmol / I 續(xù)鹽,優(yōu)選氯化續(xù)， (β 3.2)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP2: 1-1OOOmmo 1/1、5-500mmo 1/1 或 lO-lOOmmol/l 鎂鹽，優(yōu)選氯化鎂，(β 3.3)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP3:1-1OOOmmo 1/1 >5-500mmo 1/1 或 10-1 OOmmol / I I丐鹽,優(yōu)選氯化隹丐， (β 3.4)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP4: 1-1OOOmmo 1/1 >5-500mmo 1/1 或 20-300mmol/l 銨鹽,優(yōu)選氯化銨或硫酸銨， (β 3.5)含溶于水的下述成份的洗脫緩沖液EP5: l-2000mmol/l>IO-1OOOmmo 1/1或100-500mmol/l堿金屬鹽,優(yōu)選氯化鉀、氯化鈉或氯化鋰， (β4)任選的懸浮緩沖液； (β 5)任選的中和緩沖液； (β6)任選的洗滌緩沖液；和 (β7)任選的提取劑。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其特征在于， 所述洗脫緩沖液EP1的pH值范圍為7-11，優(yōu)選為8-10 ； 所述洗脫緩沖液EP2的pH值范圍為6-10，優(yōu)選為7-9 ； 所述洗脫緩沖液EP3的pH值范圍為6-10，優(yōu)選為7-9 ； 所述洗脫緩沖液EP4的pH值范圍為6-10，優(yōu)選為7-9 ； 所述洗脫緩沖液EP5的pH值范圍為6-10，優(yōu)選為7-9。
21.如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其特征在于，所述陰離子交換基質(zhì)(β2)具有選自下組的官能團(tuán):氣基、勝基，餅基和亞胺基。
22.權(quán)利要求19-21中任一項所述的試劑盒在權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及富集長度小于300個核苷酸的核酸的方法，該方法包括以下步驟i)提供流體相，優(yōu)選水相P1，其中含有(α1)至少一種長度小于300個核苷酸的核酸，和(α2)至少一種不同于所述核酸(α1)的組分，ii)使所述相P1接觸陰離子交換基質(zhì)以使所述核酸(α1)結(jié)合在陰離子交換基質(zhì)上，iii)任選用洗滌緩沖液洗滌所述陰離子交換基質(zhì)，其中所述核酸(α1)仍舊結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)，和iv)從所述陰離子交換基質(zhì)上除去，優(yōu)選洗脫，結(jié)合于陰離子交換基質(zhì)的核酸(α1)以獲得含有核酸(α1)的流體相，優(yōu)選水相P2。本發(fā)明還涉及用于富集長度小于300個核苷酸的核酸的試劑盒，涉及所述試劑盒的用途，涉及陰離子交換基質(zhì)的用途，并涉及治療疾病的方法。
文檔編號C12N15/113GK103173436SQ20131005061
公開日2013年6月26日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者C·瑞特, R·西麥爾里奇, M·韋伯 申請人:恰根有限公司