專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及準(zhǔn)確檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度的基因，具體涉及一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
辣椒中辣味的主要成分是辣椒堿(capsaicin)。辣椒堿最早由Thresh在1876年從辣椒果實(shí)中分離出來(lái)并命名，如今在食品工業(yè)中作為添加劑和醫(yī)藥工業(yè)中作為抗菌、抗腫瘤和鎮(zhèn)痛藥物而被廣泛使用。同時(shí)它還可用作防污漆添加劑、生物農(nóng)藥以及制造催淚彈和警用防衛(wèi)武器等。其用途廣泛，備受重視。此外，辣椒堿含量也是評(píng)估辣椒一類(lèi)果實(shí)品質(zhì)的指標(biāo)之一。1.辣味基因的鑒定
辣椒堿(capsaicin),在分類(lèi)學(xué)上看,只能在爺科辣椒屬Q(mào)Capsicum)植物的果實(shí)中，特別是其中的子房隔膜(placental dissepiment)中通過(guò)生物合成獲得。早期的遺傳學(xué)研究認(rèn)為，辣椒辣味的產(chǎn)生是由單一顯性基因C (Punl)控制的，在純合隱性基因c (punl)作用下表現(xiàn)為辣味缺失，并且該基因?qū)λ衅渌睦蔽断嚓P(guān)基因具有上位作用。Tanksley等最先找到了一個(gè)與C基因連鎖的分子標(biāo)記⑶35，但遺傳距離大于10 CM。Ben等最先C基因位點(diǎn)定位于辣椒的第2號(hào)染色體上。后 來(lái)，Blum等以甜椒品種Maor {Capsicum annimm、與高辣辣椒BG2816 {Capsicum frutescens)為條本，構(gòu)建了包含242個(gè)單株的F2群體,通過(guò)RFLP標(biāo)記方法，遺傳作圖證實(shí)C基因位于第2號(hào)染色體上，并首次獲得了與C基因緊密連鎖的3個(gè)RFLP標(biāo)記和I個(gè)離C基因位點(diǎn)僅0.4 CM的CAPS標(biāo)記。隨后，Blum等在前期構(gòu)建的F2群體基礎(chǔ)上，利用BSA法篩選到3個(gè)在不辣基因池與辣味基因池之間表現(xiàn)多態(tài)性的RAPD標(biāo)記位點(diǎn)，通過(guò)成功轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記后，將其中的一個(gè)主效QTL位點(diǎn)cap定位于辣椒的第7號(hào)染色體上，實(shí)驗(yàn)證明該QTL位點(diǎn)可解釋在不同生境條件下表型變異的34% 38%。Lee等在一年生辣椒annuum)中分離到一個(gè)與Cr基因共分離的辣椒素合成酶基因(Capsaicin Synthase，^，序列分析表明甜椒的G基因5’上游區(qū)域存在一段2529 bp堿基缺失。Ben-Chaim等以微辣辣椒品種NuMex RNaky (,Capsicum與高辣品種
BG2814-6//YZie1Scefl1S)為親本,構(gòu)建了包含396個(gè)單株的F2群體及相應(yīng)的F3
群體，同時(shí)構(gòu)建了包括SSR、AFLP、RFLP共728個(gè)標(biāo)記的分子圖譜，找到了 6個(gè)與辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，并分別定位于第3、4和7號(hào)染色體上。分析表明，辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量表型變化主要貢獻(xiàn)(24% 42%)來(lái)自于主效QTL位點(diǎn)cap7.1和定位于2號(hào)染色體無(wú)主效作用的標(biāo)記(NP0326)間的二基因作用，而QTL位點(diǎn)cap7.2很可能是Blum等證實(shí)的對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量有顯著影響的QTL位點(diǎn)cap。Stewart等在C cAifleflse辣椒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Punl基因的等位基因位點(diǎn)，并命名為punl2。序列分析發(fā)現(xiàn)punl2位點(diǎn)存在4個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生移碼突變(frameshift)，最終導(dǎo)致辣椒辣味的散失。王巖等通過(guò)同源克隆法，從不同基因型辣椒中克隆了 C基因的全長(zhǎng)，序列比對(duì)分析證實(shí)，甜椒C基因5’端約689 bp的堿基缺失可能是造成其辣味散失的原因。最近，Stellari等(2010)又在另一個(gè)辣椒種Capsicum frutescens中發(fā)現(xiàn)了新的等位基因位點(diǎn)punl3,實(shí)驗(yàn)證明punl3轉(zhuǎn)錄本的缺失與辣椒辣味的散失相關(guān)。Wyatt等在前人研究基礎(chǔ)上發(fā)展了一套標(biāo)記，用以區(qū)別不同辣椒種中Punl、punl、punl2和punl3基因型，這些標(biāo)記的獲得為辣椒種質(zhì)資源的鑒定與辣椒育種提供了很好的參考。
2.Punl基因的不同突變類(lèi)型
2.1 punl
punl型突變會(huì)形成一個(gè)約2.5kb的片斷缺失，導(dǎo)致Punl基因的啟動(dòng)子和大部分的外顯子I (exonl)的缺失，最終阻止Punl基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。見(jiàn)圖4。
2.2 punl2·
punl2型突變是移碼突變，由位于exonl中的4個(gè)bp的堿基缺失造成，該突變基因可以被轉(zhuǎn)錄，但不會(huì)形成相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物。見(jiàn)圖5。
2.3 punl3
punl3型突變會(huì)造成Punl基因3’端大段的基因缺失，該突變基因不會(huì)被表達(dá)轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)圖6。
3.保持辣椒辣度的原理
辣椒的辣度跟其中所含辣椒堿的量成正比。目前已知的影響辣椒果實(shí)中辣椒堿合成的基因只有Punl基因。因此一旦該基因產(chǎn)生突變，就會(huì)極大地影響辣椒堿的合成和積累，造成辣椒的辣度逐代下降。在辣椒基因組中含有兩條Punl基因等位基因，根據(jù)孟德?tīng)柕牡任换蚍蛛x規(guī)律，如果親本的辣椒為野生型Punl/Punl純合體，則子代的辣椒都為Punl/Punl基因型，其辣度會(huì)長(zhǎng)時(shí)間的保持下去。如果親本辣椒基因型為Punl/punl (或punl2、punl3)雜合子，則其子I代會(huì)形成Punl/Punl、Pun I/pun I和punl/punl這三種基因型，比例為1:2:1，子2代三種基因型的比例大致為1:3:1?？梢钥闯?，對(duì)保持辣椒辣度最為有利的Punl/Punl基因型純合子的比例會(huì)逐代下降，從而導(dǎo)致辣椒的辣度逐漸下降。而如果親本辣椒的基因型為punl/punl突變型純合子，則后代基本不會(huì)有辣度。綜上所述，如果需要長(zhǎng)久保持辣椒的辣度，則需要其親本都為野生型純合子。因此對(duì)現(xiàn)有的辣椒對(duì)其中的PunUpunl突變、punl2突變和punl3突變的基因進(jìn)行檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)其快速檢測(cè)辣度，即通過(guò)上面的鑒定Punl基因不同基因型的方法，就可以篩選出合適的親本，預(yù)防辣椒的辣度隨種植時(shí)間的推移而逐漸下降。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:
本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒可以快速和準(zhǔn)確檢測(cè)有關(guān)辣度的基因。技術(shù)方案
一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒，其特征在于含有如下引物:punl A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punl B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punl C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punl2F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punl2R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punl3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punl3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punl3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。所述的引物的濃度為10 μ Μ，各個(gè)引物體積為0.25 μ L
作為進(jìn)一步說(shuō)明:所述的一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒包括PCR緩沖溶液IOx PCRbuffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl,15 mM MgCl2,0.8% [v/v] Nonidet P40),2.5 μ L ；2.5 mM dNTPs, I μ L ；Taq polymerase 0.25 μ L ； , 10 μ L ;;引物(10 μ M):punl突變:punl A, punl B, punl C各0.25 μ L ;punl2突變:punl2 F, punl2 R各0.25 μ L ；punl3突變:punl3 D, punl3 E, punl3 F 各 0.25 μ L ;加 H2O 至 25 μ L。上述一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒的所有試劑分別置于不同容器中，如EP管內(nèi)。一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括盒體，11個(gè)試劑管，其中第 1-8 分別放置引物 punl A, punl B, punl C、punl2 F, punl2 R、punl3 D, punl3 E, punl3F ;第9試劑管放置PCR緩沖液；第10管放置dNTPs ;第11管放置聚合酶Taq polymerase0上述的一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒的應(yīng)用，其特征在按如下步驟實(shí)現(xiàn):
A、提取辣椒基因DNA:
B、IOxP CR buffer 2.5 μ L,2.5 mM dNTPs,I μ L；Taq polymerase 0.25 μ L,20 ng/μ L基因組DNA,引物為10 μΜ;力口 H2O至25 μ L ;其中IOx PCR buffer為含有100 mMTris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl, 15 mM MgCl2,0.8% v/v Nonidet P40 的混合物；
引物:punl 突變:punl A, punl B, punl C 各 0.25 μ L ；punl2 突變:punl2 F, punl2 R各 0.25 μ L ；punl3 突變:punl3 D, punl3 E, punl3 F 各 0.25 μ L。C、PCR 反應(yīng)條件:94。CA min ；[ 94。C，30 s ;60。C，I min ;72。C，2 min ]，35x ；72° C，10 min, PCR結(jié)果通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。有益效果:
本發(fā)明使用特殊設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增提取到的辣椒基因組DNA中的Punl、punl突變、punl2突變和punl3突變的基因片段，能夠?qū)崿F(xiàn)其快速檢測(cè)有關(guān)辣度相關(guān)基因，即通過(guò)上面的鑒定Punl基因不同基因型的方法，就可以篩選出合適的親本，預(yù)防辣椒的辣度隨種植時(shí)間的推移而逐漸下降，避免品種退化及發(fā)展優(yōu)良品種。


圖1為Punl突變基因的檢測(cè)，其中圖1a為Punl基因突變檢測(cè)原理示意圖，圖1b為電泳結(jié)果。圖2為punl2突變基因的檢測(cè)，其中圖2a為punl2基因突變檢測(cè)原理示意圖，圖2b為電泳結(jié)果。圖3為punl3突變基因的檢測(cè)，其中圖3a為punl3基因突變檢測(cè)原理示意圖，圖3b為電泳結(jié)果。圖4-6分別為punl, punl2, punl3突變示意圖。圖7為本發(fā)明試劑盒示意圖，其中1-11為試劑管，12為盒體。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.辣椒基因組DNA的提取
參照宗憲春等(2009)報(bào)道的方法，具體步驟:①稱(chēng)取新鮮的辣椒葉片(3 4片真葉期)10(T200 mg，用無(wú)菌水沖洗2 3次，用滅菌濾紙吸干水分后在液氮中快速研磨成粉末；轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中。②迅速加700 μ L經(jīng)65° C預(yù)熱的提取緩沖液，搖動(dòng)使粉末充分散開(kāi)后加入78 UL 20%的SDS在65° C水浴中I h，間隔晃動(dòng)2_3次。③取出樣品，冷卻至室溫后加入160 uL ,5 mo I/L的KAc于-20 ° C冰浴30 min。④樣品經(jīng)12000 rpm離心5 min，小心吸取上清液(注意不要吸起位于中間的蛋白質(zhì)層必要時(shí)可適當(dāng)棄去部分上清液)。⑤將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入等體積的酚:氯仿(1:1)輕輕顛倒數(shù)次，放置片刻后12000 rmp離心10 min，此步驟重復(fù)2次。⑥吸取上清液加入等體積的氯仿:異戊醇(23:1) 12000 rpm離心10 min (輕輕顛倒靜止5 min再離心)。⑦吸取上清液,加入1/5體積、3 mo I/L的NaAC (pH 5.2)，充分混勻后加入2.5倍上清液體積的無(wú)水乙醇輕輕搖勻，觀察DNA沉淀的生成,室溫放置10 min后10000 rpm離心5 min,傾上清。⑧用80%的乙醇洗2 3次，吹干或室溫晾干，后加入20 40 μ L ddH20。⑨加入3-5 μ L RNaseA，混勻并在37° C下保溫30 min，然后置-20° C下保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2.試劑盒 一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括盒體，11個(gè)試劑管，其中試劑管 1-8分別放置引物punl A,punl B,punl C、punl2 F,punl2 R、punl3 D,punl3 E,punl3 F ；試劑管9放置PCR緩沖液；試劑管10放置dNTPs ;試劑管11放置聚合酶Taq polymerase0具體如下:
引物序列:
punl A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punl B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punl C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punl2F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punl2R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punl3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punl3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punl3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’
分別使用上述特殊設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增提取到的辣椒基因組DNA中的Punl、punl突變、punl2突變和punl3突變的基因片段，具體方法和條件如下:
IOx PCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl,15 mM MgCl2,0.8% [v/v]Nonidet P40), 2.5 μ L ;2.5 mM dNTPs, I μ L ;Taq polymerase 0.25 μ L ；20 ng/yL 基因組 DNA, 10 μ L ;引物(10 μ M):punl 突變:punl A, punl B, punl C 各 0.25 μ L ;punl2 突變:punl2 F, punl2 R 各 0.25 μ L ；punl3 突變:punl3 D, punl3 E, punl3 F 各 0.25 μ L ；Η20至 25 μ L0PCR反應(yīng)條件:94。CA min ；[ 94。C，30 s ;60。C，I min ;72。C，2 min ]，35x ;72。 C，10 min。PCR結(jié)果通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。
實(shí)施例3.Punl基因突變檢測(cè)
1.punl突變
punl突變是由Punl基因5’端約2.5kb基因片段缺失造成的，根據(jù)這個(gè)特性設(shè)計(jì)特殊PCR引物A、B和C。如圖1a所示，引物A位于Punl基因exonl及punl缺失片斷區(qū)域，因此在使用引物對(duì)A-C進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，punl突變基因無(wú)法被擴(kuò)增；而引物B則覆蓋了 2.5kb缺失片段上游及下游區(qū)域，所以只有在punl突變存在的情況下，使用引物對(duì)B-C才能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)鑒別使用A-C引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(1271 bp)和B-C引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物(970bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的不同大小的產(chǎn)物，就可以將Punl和punl區(qū)別開(kāi)來(lái)(圖lb)。
2.punl2 突變
punl2突變是由Punl基因exonl中的4個(gè)堿基對(duì)的缺失造成的，因此可以設(shè)計(jì)特殊引物序列，具體為:punl2 F,punl2 R，分別位于該4堿基缺失為點(diǎn)上、下游(圖2a)，使用該引物對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的punl2 656 bp片段與Punl相比，有4bp的差別(圖2b)，可以通過(guò)電泳后銀染鑒別，或者直接通過(guò)測(cè)序鑒別；另外該引物對(duì)無(wú)法擴(kuò)增punl突變類(lèi)型的基因片段。通過(guò)這種引物設(shè)計(jì)方式，就可以達(dá)到區(qū)別Punl/punl2的目的。3.punl3 突變
pun 13突變是由Punl基因3’端大段的基因片段缺失造成的，這導(dǎo)致了該突變基因編碼的蛋白質(zhì)缺失了其C端的70個(gè)氨基酸，從而喪失了該蛋白質(zhì)正常的生物學(xué)功能。根據(jù)該特性，可以設(shè)計(jì)特殊的PCR引物序列，正向引物D (punl3 D)位于Punl基因exonl和exon2之間的內(nèi)含子區(qū)域，反向引物E (punl3 E)識(shí)別正常Punl基因的exon2中的一段基因序列，由于punl3缺少了該引物E (punl3 E)識(shí)別的序列，所以無(wú)法被使用引物D-E的PCR反應(yīng)擴(kuò)增。另外，設(shè)計(jì)反向引物F (punl3 F)，特異性識(shí)別punl3突變基因3’端的序列，從而使用引物對(duì)D-F時(shí)PCR反應(yīng)可以擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段(圖3a)。引物對(duì)D-E所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為490 bp，而D-F所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為965 bp (圖3b)。序列表
SEQUENCE LISTING<110>常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司〈120〉一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒及其檢測(cè)方法〈130〉
〈160〉 8
<170> PatentIn version 3.3
〈210〉 I
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 punl A
〈400〉 I
attcttgatc atcctcatgc ate23
〈210〉 2〈211〉 23〈212〉 DNA〈213〉 punl B〈400〉 2`cacaaatttt gtccgatctc aac23
〈210〉 3
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 punl C
〈400〉 3
tttgttgctt gtgcaacatc acc23
〈210〉 4
〈211〉 24
〈212〉 DNA`
〈213〉 punI2 F
〈400〉 4
aaggtggtaa tttgcttgta gttc24
〈210〉 5
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 punI2 R
〈400〉 5
caccttcaat cccaaattaa tgtc2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒，其特征在于含有如下引物: punI A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punI B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punI C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punI2 F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punI2 R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punI3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punI3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punI3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒，其特征包括PCR緩沖液 IOx PCR buffer 2.5 μ L, 2.5 mM dNTPs, I μ L ;聚合酶 Taq polymerase 0.25 μ L, 20ng/yL 基因組 DNA，引物為 10 μ MjpH2O 至 25 yL； 其中 IOx PCR buffer 為含有 100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl，15 mM MgCl2,0.8% v/v Nonidet P40 的混合物；引物:punl A, pun I B, pun I C 各 0.25 μ L ；punl2 F, punl2 R 各 0.25 μ L ；punl3 D, punl3 Ε, punl3 F 各 0.25 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括盒體，11個(gè)試劑管，其中第1-8分別放置引物punl A,punl B, punl C、punl2 F,punl2 R、punl3 D，punl3 E，punl3 F ;第9試劑管放置PCR緩沖液；第10管放置dNTPs ;第11管放置聚合酶 Taq polymerase。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一種檢測(cè)辣椒辣度的試劑盒的方法，其特征在按如下步驟實(shí)現(xiàn): A、提取辣椒基因DNA:B、IOxPCR buffer 2.5 μ L,2.5 mM dNTPs,I μ L；Taq polymerase 0.25 μ L,20 ng/μ L基因組DNA，引物為10 μΜ;力口 H2O至25 μ L ;其中IOx PCR buffer為含有100 mMTris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl, 15 mM MgCl2,0.8% v/v Nonidet P40 的混合物；引物:punl 突變:punl A, punl B, punl C 各 0.25 μ L ；punl2 突變:punl2 F, punl2 R各 0.25 μ L ；punl3 突變:punl3 D, punl3 E, punl3 F 各 0.25 μ L ； C、PCR反應(yīng)條件:94° CA min ；[ 94° C，30 s ；60° C，I min ；72° C，2 min ]，35x ;72° C，10 min, PCR結(jié)果通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)有關(guān)辣椒辣度基因的試劑盒及其檢測(cè)方法；具體含有如下引物pun1A、pun1B、pun1C；pun12F、pun12R；pun13D、pun13E、pun13F；本發(fā)明使用特殊設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增提取到的辣椒基因組DNA中的Pun1、pun1突變、pun12突變和pun13突變的基因片段，能夠?qū)崿F(xiàn)其快速檢測(cè)有關(guān)辣度相關(guān)基因，即通過(guò)上面的鑒定Pun1基因不同基因型的方法，就可以篩選出合適的親本，預(yù)防辣椒的辣度隨種植時(shí)間的推移而逐漸下降，避免品種退化及發(fā)展優(yōu)良品種。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074442SQ201310046988
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者李永忠, 滕凌, 張娟, 路易斯伊格納羅, 葉亞?wèn)|, 朱文華, 王潤(rùn)華, 全利, 潘鸝, 胡娟, 肖慧, 葉汝章, 楊紫俊, 張俊, 霍世元 申請(qǐng)人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司