專利名稱：重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組鯉魚PKC S基因、蛋白及其制備與檢測(cè)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)與許多細(xì)胞生物效應(yīng)有關(guān)，在細(xì)胞信息傳遞中具有重要作用。由于P K C是促癌劑佛波酯在細(xì)胞內(nèi)的高親和力受體，因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用引起人們重視，已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中PKC含量高于正常。到目前為止，在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)已確定10種PKC亞類(8-3)，分為A、B、C三組，A組稱為典型或傳統(tǒng)的 PKC (classicalor conventional PKC，CPKC),包括 a、0 1、II 和Y亞類,其中@1和P II有高度的同源性,是由同一 mRNA的不同剪接而成，A組成員分子量在 76_78kDa。B 組為新型 PKC (atypical PKC，aPKC)，包括 S、e、n (L)和 0 亞類，分子量在77_83kDa。C組為非典型PKC(atypicalPKC，aPKC)，由(和入亞類組成，分子量較小為67kDa。其中，PKC S在調(diào)控人和鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)和抗氧化中起著重要作用。迄今，關(guān)于PKC S在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和抗氧化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中開展，并取得了許多成果，但未見有鯉魚PKC S基因的cDNA核苷酸序列和與它對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組鯉魚PKC 6基因、蛋白及其制備與檢測(cè)方法和應(yīng)用。 本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是一種重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No I所不的基因序列；2)將SEQ ID NO :1所不的基因序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代、缺失或添加且與SEQ ID No :1所示的基因序列表達(dá)的氨基酸序列相同的基因序列。一種重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由權(quán)利要求I所述重組鯉魚PKC A基因所表達(dá)的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白質(zhì)。一種上述重組鯉魚PKC 6基因的制備方法，包括下述步驟
1)采集鯉魚的總RNA并以其腸道組織總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA第一
鏈；
2)以步驟I)中的cDNA第一鏈為模板，利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQID NO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步驟2)中以P1、P2為引物，利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)的50 u I PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為CDNA第一鏈，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25 U I ;501^的卩2，0. 25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8. Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反應(yīng)循環(huán)條件94°C 預(yù)變性 lmin ；94°C變性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min,反應(yīng)完成。一種上述制備的重組鯉魚PKC 6基因的檢測(cè)方法，包括下述步驟
1)將Pl和P2的PCR回收產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增采用2XTaqPCR MasterMix進(jìn)行，50 y IPCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的PKCS回收產(chǎn)物，l.Oiil ;50iiM的P3，0. 25u I ；50uM 的 P4，0.25ii I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反應(yīng)循環(huán)條件94°C預(yù)變性lmin ;94°C變性30sec, 6CTC退火30sec, 72°C延伸lmin,共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 min，反應(yīng)完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列；
2)取5ill PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。具體地，該檢測(cè)方法中，所述50倍稀釋的PKC 6回收產(chǎn)物指重組鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列的制備方法中所制備的重組鯉魚PKC 8基因cDNA序列。一種上述制備的重組鯉魚PKC 6基因的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟
1)將Pl和P2PCR回收產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增采用2XTaq PCR Master Mix進(jìn)行，50 PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((8回收產(chǎn)物，l.Oiil ;50iiM的P5，0. 25iil ；50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反應(yīng)循環(huán)條件94°C預(yù)變性 lmin ;94°C變性 30sec,60°C (P5, P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，反應(yīng)完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQ ID NO :8所示的序列； 2)取5ill PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。上述重組鯉魚PKC S基因在檢測(cè)鯉魚PKC S基因的表達(dá)情況中的應(yīng)用。具體地，鯉魚PKC S基因的表達(dá)情況包括鯉魚PKC S基因在各類細(xì)胞和組織、早期胚胎、個(gè)體在不同狀態(tài)下的表達(dá)情況。為了檢測(cè)上述應(yīng)用的表達(dá)情況，根據(jù)SEQ ID NO :1所示序列設(shè)計(jì)上游引物ro1、下游引物ro2，所述roi具有seq id no :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用熒光定量PCR擴(kuò)增，20 PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為cDNA，2.0iil ；10uM 的 NDl，1.0iil ；10uM 的 ND2，1.0iil ；
SYBR Premh Es Tag n (2X), 10. Ou I ；dH2o,6. o u I;反應(yīng)循環(huán)條件％°C 預(yù)
變性30sec ;95°C變性5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸2min，反應(yīng)完成。本發(fā)明研究和開發(fā)與鯉魚PKC S蛋白相關(guān)的基因克隆及其重組表達(dá)具有極其重要的作用，因?yàn)檠芯壳宄庺~的PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高細(xì)胞培養(yǎng)存活率、提高細(xì)胞抗氧化能力，以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等方面，由重組PKCS蛋白制備的抗體可以檢測(cè)PKC 6基因在不同種類的細(xì)胞、不同的細(xì)胞周期及個(gè)體的不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。
本發(fā)明獲得的重組PKC S基因的編碼區(qū)長(zhǎng)2061bp，并且確定了其核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列。通過比對(duì)已知的斑馬魚、人、大鼠、小鼠的PKC S基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)斑馬魚胚胎的PKC S基因(NM_214708. l)cDNA編碼區(qū)的序列，在不打破氨基酸編碼的前提下設(shè)計(jì)上游引物(5’_從起始密碼子ATG的開始)，下游引物5’端起始于斑馬魚PKC 6基因的天然終止密碼子TGA，設(shè)計(jì)出了一對(duì)用于通過RT-PCR方法擴(kuò)增鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區(qū)片段的引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應(yīng)用這對(duì)引物擴(kuò)增出了特異性片段，測(cè)序后得到了鯉魚PKC 6基因的cDNA編碼區(qū)2061bp片段，序列分析表明與斑馬魚的序列(NM_214708.1)同源性為88%，且保持了正確的編碼。這一 cDNA片段稱為 “cPKCS ”。所以，本發(fā)明的目的是通過己知的不同物種的PKC S的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，然后通過RT-PCR方法得到重組鯉魚PKC S基因的cDNA編碼區(qū)片段。對(duì)該片段測(cè)序后提供編碼鯉魚PKC 6蛋白的基因的cDNA的編碼區(qū)2061bp的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。綜上所述，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的重組鯉魚PKC S蛋白相關(guān)的基因克隆及其重組表達(dá)具有極其重要的作用，因?yàn)檠芯壳宄亟M鯉魚PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高細(xì)胞培養(yǎng)存活率、提高細(xì)胞抗氧化能力，防止細(xì)胞氧化損傷，以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等方面，由重組PKC S蛋白制備的抗體可以檢測(cè)PKC S基因在不同種類的細(xì)胞、不同的細(xì)胞周期及個(gè)體的不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。


圖1是重組鯉魚PKC 8基因序列的電泳 圖2是以P3、P4為引物進(jìn)行PCR鑒定的電泳 圖3是以P5、P6為引物進(jìn)行PCR鑒定的電泳圖； 圖4是鯉魚不同腸段信號(hào)分子PKC 6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)示意 圖5是肌醇對(duì)幼建鯉前腸PKC 6磷酸化的影響的檢測(cè)示意 圖6是肌醇對(duì)幼建鯉中腸PKC 6磷酸化的影響的檢測(cè)示意 圖7是肌醇對(duì)幼建鯉后腸PKC 6磷酸化的影響的檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 :
本實(shí)施例的重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)將SEQ ID NO :1所示的基因序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代、缺失或添加且與SEQ ID No :1所示的基因序列表達(dá)的氨基酸序列相同的基因序列。如903位的C替換成G，序列編碼的氨基酸序列是相同。本實(shí)施例的重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由權(quán)利要求1所述重組鯉魚PKC A基因所表達(dá)的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白質(zhì)。如323位的K替換成L，蛋白質(zhì)的生物活性不會(huì)發(fā)生改變。實(shí)施例2
為了獲取實(shí)施例1中所述的重組鯉魚PKC 6基因序列，可以采用本實(shí)施例的方法，具體如下
首先按照提取總RNA的標(biāo)準(zhǔn)要求采集鯉魚(Common carp, Cyprinus carpio)的各類組織樣本。現(xiàn)場(chǎng)宰殺鯉魚后立即取腎臟、腸道、肌肉、脾臟及肝胰臟等組織塊，放入冷凍管后立即入液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓罄肨aKaRa的總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取鯉魚腸道、肌肉、腎臟、肝胰臟及脾臟等組織的總RNA，最后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的哺乳動(dòng)物PKC S基因在各類組織中的表達(dá)情況和總RNA提取結(jié)果，選定以腸道組織總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第一鏈為模板，利用特異性引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段。之后將電泳后分離的目的片段切膠回收，測(cè)定雙鏈cDNA的濃度，以巢式PCR方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。Pl和P2引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物通過P3和P4、P5和P6的PCR擴(kuò)增，電泳鑒定的得到預(yù)期大小的DNA片段，初步驗(yàn)證了 Pl和P2擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性。將Pl和P2引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。作為結(jié)果，獲得了 2061bp的鯉魚cPKC 6基因cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列。 顯示上面提到的特征的本發(fā)明的特異性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法擴(kuò)增出鯉魚的cPKC 6基因的cDNA編碼區(qū)片段。根據(jù)本發(fā)明獲得的鯉魚PKC 6基因cDNA的核苷酸序列可進(jìn)一步通過RT-PCR或雜交的方法檢測(cè)PKC 6基因的組織表達(dá)特異性，也可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)鯉魚PKC S基因全長(zhǎng)cDNA的克隆。將本發(fā)明的cDNA重組到表達(dá)載體上可能會(huì)表達(dá)出完整的PKC S蛋白，進(jìn)而可用于抗體生產(chǎn)，檢測(cè)鯉魚各類細(xì)胞和組織、早期胚胎、個(gè)體在不同狀態(tài)下的PKC 6基因的表達(dá)情況等等。鯉魚PKC 8基因的cDNA編碼區(qū)2061bp片段的克隆
為了克隆來自鯉魚腸道組織細(xì)胞的PKC 6基因包含2061bp編碼區(qū)的cDNA，根據(jù)斑馬魚公開的核苷酸序列(NM_214708.1),首先設(shè)計(jì)合成允許擴(kuò)增2061bp的cDNA的PCR引物對(duì)，即
上游引物 5’- ATGGCCCCTTTCCTGAGGATTGCT -3’(Pl)
下游引物 5’-GACCACAirGTGTCTCACITTTGCA -3’(P2)。然后設(shè)計(jì)合成了另外兩對(duì)用于鑒別Pl和P2擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，即
上游引物 P3，5’ -AAATCCACCAAGCGACCTGA-3’，
下游引物 P4，5’ -TACCCACAATCCCTAACCGG-3’ ；
上游引物 P5，5’ -ACCTCTACTCCACTITTCAA-3’，
下游引物 P6，5’ -ATATTACCCACAATCCCTAA-3’ ；
為了利用RT-PCR方法克隆PKC S基因的cDNA，從鯉魚腸道組織提取總RNA，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取鯉魚腸道組織總RNA，進(jìn)行電泳檢測(cè)和紫外測(cè)定RNA濃度后置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。然后，利用TaKaRa的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶并按照使用說明書的操作程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA
第一鏈。
以上面得到的cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，利用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。50ii I PCR 擴(kuò)增體系cDNA，2. 5 u I ；P1 (50uM),0. 25 u I ；P2 (50 uM),
0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；dNTP Mixture (each 2.5 mM),
8.0 ill ；ddH20, 33. 5 u1-,TaKaRa LA Taq (5 U/u 1),0. 5 u I0 反應(yīng)循環(huán)條件94°C 預(yù)變性lmin ;94°C變性30sec，60 °C退火30sec，72°C延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min，反應(yīng)完成。取5iil PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(100V，10 min)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。作為結(jié)果，得到了 2061bp的特異性目的片段(SEQ ID NO :1所示序列)。Pl 和 P2 PCR 回收產(chǎn)物的 PCR 擴(kuò)增采用 2 X Taq PCR Master Mix (KT201)進(jìn)行，50 u I PCR 擴(kuò)增體系PKCS 回收產(chǎn)物(50X 稀釋)，1. Oii I ;P3 (50 y M)，0. 25 y I 和 P4(50iiM)*P5(50iiM)，0. 25 u I 和 P6(50 y M)，0. 25 u I ；2XTaq PCR Master Mix, 25. Ou I ；ddH20,23. 5 u I0 反應(yīng)循環(huán)條件94°C預(yù)變性 lmin ;94°C變性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，反應(yīng)完成。取5 PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(100V，lOmin)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。作為結(jié)果，分別得到了約900和約550 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。其大小與P3P4引物對(duì)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物922bp和P5P6引物對(duì)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物556bp相符，表明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。經(jīng)過兩次鑒定的P1P2擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司用測(cè)序。作為結(jié)果，獲得了 2061bp的鯉魚PKC 6基因的cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列。鯉魚PKC 6基因的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO:1顯示了本實(shí)施實(shí)·例所獲得的cDNA克隆的核苷酸序列，SEQ ID NO: 2是由此推斷的氨基酸序列。PKC 6基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA編碼區(qū)的2061bp的開放閱讀框，該開放閱讀框編碼686個(gè)氨基酸殘基，分子量為78498. 36Da。本發(fā)明所獲得的重組鯉魚PKC S基因cDNA的核苷酸序列與斑馬魚(NM_214708.1)、人(NM_001090993.1)、小鼠(NM_0111)和大鼠(NM_133307.1)的 PKC S 基因cDNA的核苷酸序列的比較。結(jié)果表明鯉魚PKC S與斑馬魚、人、小鼠和大鼠的同源性分別為 90. 1%、70. 7%、71. 0% 和 70. 3%。正如清楚說明的和如上說明，本發(fā)明提供利用RT-PCR法克隆鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區(qū)的引物和編碼鯉魚的PKC S蛋白質(zhì)的2061bp的cDNA和由此推斷的氨基酸序列。此cDNA包括了 2061bp的核苷酸序列，它編碼含有686個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)過進(jìn)一步的改造后它可以亞克隆到如PET或pcDNA3.1等原核或真核表達(dá)載體上進(jìn)行表達(dá)。重組的cDNA片段可能會(huì)表達(dá)出完整的PKC S蛋白多肽段，進(jìn)而可用于抗體生產(chǎn)，檢測(cè)鯉魚各類細(xì)胞和組織、早期胚胎、個(gè)體在不同狀態(tài)下的PKC 6基因的表達(dá)情況等等。實(shí)施例3
本實(shí)施例為實(shí)施例1和實(shí)施例2記載的重組鯉魚PKC S蛋白在測(cè)定鯉魚不同腸段PKC 6基因表達(dá)的應(yīng)用。本實(shí)例以熒光定量PCR技術(shù)研究PKC 6基因在鯉魚各腸段的表達(dá)情況。選取體重接近的6尾健康鯉魚取樣。試驗(yàn)魚腸道依據(jù)Villanueva等(1997)的方法分成幾乎等長(zhǎng)的7腸段，分別測(cè)定各腸段PKC 6 mRNA豐度。樣品液氮研磨，提取總RNA。熒光定量用鯉魚腸道cDNA第一鏈采用Prime Script RT reagent Kit (寶生物工程(大連)有限公司，DRR037AS)合成，按試劑盒說明書的方法操作。PKC 6 cDNA熒光定量擴(kuò)增根據(jù)本發(fā)明克隆得到的重組鯉魚PKC S基因的cDNA編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)成一對(duì)PKC S特異性定量擴(kuò)增引物
上游引物 PDl，5’- AAATCCACCAAGCGACCT -3’ ；
下游引物 PD2，5’- CGAACCCTCCCACAGACG -3’ ；
熒光定量PCR擴(kuò)增采用 SYBR Pllllie Scupt RT-PCR Kit II (Perfect Real
Time)(寶生物工程(大連)有限公司，DRR083A)進(jìn)行，20iil PCR擴(kuò)增體系cDNA，2. Oyl ；PD1
(10uM),1.0u I ；PD2( 10 u M),1. 0 u I ；Premh E-yII(2X),10.0u I ；
dH20,6. Ou I。反應(yīng)循環(huán)條件95°C預(yù)變性 30sec ;95°C變性 5sec，55°C退火 15sec，72°C延伸15sec，共44個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸2min，反應(yīng)完成。結(jié)果表明鯉魚各腸段均有PKC S mRNA表達(dá)，第I和第4腸段顯著其他各腸段Gd< 0.05)，第6腸段最低，其余腸段差異不顯著Gd > 0.05)。實(shí)施例4
本實(shí)施例為實(shí)施例1和實(shí)施例2記載的重組鯉魚PKC 6蛋白在測(cè)定肌醇對(duì)鯉魚腸道PKC 6蛋白磷酸化影響的應(yīng)用。本實(shí)例根據(jù)PKC S蛋白序列篩選的磷酸化抗體，檢測(cè)量肌醇對(duì)鯉魚不同腸段PKC 6蛋白磷酸化的影響。結(jié)果表明肌醇顯著提高了前腸和中腸中PKC S的磷酸化水平CF < 0. 05);肌醇對(duì)后腸PKC S磷酸化水平?jīng)]有影響0° > 0.05)。通過檢測(cè)鯉魚PKC 6基因在各類細(xì)胞和組織、早期胚胎、個(gè)體在不同狀態(tài)下的表達(dá)情況，可以對(duì)檢測(cè)的中間數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析和研究，對(duì)鯉魚PKC S基因的表達(dá)情況、其表達(dá)蛋白的磷酸化及相關(guān)情況，做進(jìn)一步研究，進(jìn)而可用于抗體生產(chǎn)。如上所述， 可以較好的實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種重組鯉魚PKC S基因，為下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)將SEQ ID NO:1所示的基因序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代、缺失或添加且與SEQID No 1所不的基因序列表達(dá)的氣基酸序列相同的基因序列。
2.一種重組鯉魚PKC S氨基酸序列，為下述序列之一 1) SEQ ID N0:2所示的由權(quán)利要求I所述重組鯉魚PKC A基因所表達(dá)的氨基酸序列；2)將SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ ID N0:2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID N0:2序列衍生的蛋白質(zhì)。
3.一種權(quán)利要求1所述重組鯉魚PKC S基因的制備方法，其特征在于，包括下述步驟 1)采集鯉魚的總RNA并以其腸道組織總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA第一鏈； 2)以步驟I)中的cDNA第一鏈為模板，利用引物PUP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ IDNO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步驟2)中以P1、P2為引物，利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)的50iU PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為cDNA第一鏈，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25yl ;501^的卩2，0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8.Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反應(yīng)循環(huán)條件94°C 預(yù)變性 Imin ；94°C變性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min,反應(yīng)完成。
4.一種權(quán)利要求3所述制備的重組鯉魚PKC S基因的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟 1)將Pl和P2的PCR回收產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增采用2XTaqPCR MasterMix進(jìn)行，50 ii IPCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((6回收產(chǎn)物，l.Oiil ;5011|1的？3，0.25u I ；50uM 的 P4，0. 25 u I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反應(yīng)循環(huán)條件94°C預(yù)變性Imin ;94°C變性30sec, 60°C退火30sec, 72°C延伸lmin,共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5 min，反應(yīng)完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列； 2)取5ill PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組鯉魚PKCS基因的檢測(cè)方法，其特征在于，所述50倍稀釋的PKC 6回收產(chǎn)物指重組鯉魚PKC 6基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列的制備方法中所制備的重組鯉魚PKC S基因cDNA序列。
6.一種權(quán)利要求3所制備的重組鯉魚PKC S基因的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟 I)將Pl和P2 PCR回收產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增采用2XTaq PCR Master Mix進(jìn)行，50 PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為50倍稀釋的？1((8回收產(chǎn)物，l.Oiil ;50iiia^P5，0.25iil ；·50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反應(yīng)循環(huán)條件·94°C預(yù)變性 lmin ;94°C變性 30sec，60°C (P5P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，反應(yīng)完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQID NO :8所示的序列；2)取5 ill PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠在100V，10 min的條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。
7.權(quán)利要求1所述重組鯉魚PKCS基因在檢測(cè)鯉魚PKC S基因的表達(dá)情況中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，鯉魚PKCS基因的表達(dá)情況包括鯉魚PKC 6基因在各類細(xì)胞和組織、早期胚胎、個(gè)體在不同狀態(tài)下的表達(dá)情況。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，在檢測(cè)中，根據(jù)SEQID NO :1所示序列設(shè)計(jì)上游引物ro1、下游引物PD2，所述roI具有SEQ ID NO :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用熒光定量PCR擴(kuò)增，20 ill PCR擴(kuò)增體系中各組分及其比例為cDNA，2. Ou I ；10uM 的 ND1，1. 0 y I ;10 y M 的 ND2，l.Oul Premix Ex TagmII (2X)，10. Oii I ；dH20,6. Ou I ;反應(yīng)循環(huán)條件95°C預(yù)變性 30sec ;95°C變性 5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸2min，反應(yīng)完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測(cè)方法和應(yīng)用。重組鯉魚PKCδ基因具有SEQ ID NO:1所示的序列。重組鯉魚PKCδ蛋白具有SEQ ID NO:2所示的序列。本發(fā)明的重組鯉魚PKCδ蛋白相關(guān)的基因克隆及其重組表達(dá)具有極其重要的作用，因?yàn)檠芯壳宄亟M鯉魚PKCδ基因和蛋白的功能，可以用在提高細(xì)胞抗氧化能力，防止細(xì)胞氧化損傷，以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等方面，由重組PKCδ蛋白制備的抗體可以檢測(cè)PKCδ基因在不同種類的細(xì)胞、不同的細(xì)胞周期及個(gè)體的不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103060347SQ20131004651
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者周小秋, 姜維丹, 馮琳, 姜俊, 劉揚(yáng), 李樹紅 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)