專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其微生態(tài)制劑和在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌，特別是公開一種含有該枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑以及在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
飼料添加劑對(duì)強(qiáng)化飼料營養(yǎng)價(jià)值、改善飼料品質(zhì)、節(jié)約飼料成本以及促進(jìn)動(dòng)物健康生長有非常重要的作用。抗生素被用作飼料添加劑后，為動(dòng)物生產(chǎn)提供了一定的防疫保障，也給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是隨著社會(huì)的發(fā)展與科技的進(jìn)步，利用抗生素作為飼料添加劑的弊端也逐步暴露，表現(xiàn)為病原微生物的抗藥性逐漸增強(qiáng)，動(dòng)物產(chǎn)品藥物殘留[1]，對(duì)人類的健康和生態(tài)環(huán)境的安全帶來了潛在的威脅。因此，抗生素替代品益生菌制齊U、酸制劑、酶制劑以及一些復(fù)合生態(tài)制劑等的研究與應(yīng)用，逐漸成為了畜牧工作者關(guān)注的
執(zhí)占[2_5]。枯草芽孢桿菌是公認(rèn)的腸道有益菌[6]，其代謝過程產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，作用表現(xiàn)為:
1、枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用；
2、枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長；
3、刺激動(dòng)物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力；
4、枯草芽孢桿菌菌體自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用；
5、能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。枯草芽孢桿菌具有耐高溫高壓，利于飼料加工，易于貯存的特點(diǎn)，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用一直是畜牧業(yè)科研人員研究的重點(diǎn)。目前我國飼料行業(yè)微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌種較為滯后，微生態(tài)制劑的生產(chǎn)較為單一 [7_8]，急需篩選出更多更優(yōu)秀的菌種以滿足畜牧業(yè)發(fā)展的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種枯草芽孢桿菌及其微生態(tài)制劑和在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌耐酸、耐堿，可較長時(shí)間承受一定程度的高溫高壓，可抑制大腸桿菌的生長繁殖。本發(fā)明含有上述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑能替代抗生素用于動(dòng)物飼料，用以維持 動(dòng)物腸道正常的微生物區(qū)系，從而促進(jìn)動(dòng)物生長、提高飼料報(bào)酬。。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的枯草芽孢桿^Bacillus subtilis,保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.3532。所述的枯草芽孢桿菌(.Bacillus subtilis) CGMCC N0.3532為革蘭氏陽性菌，在LB培養(yǎng)基上的菌落為白色、扁平、表面粗糙、邊緣不整齊，細(xì)胞直徑小于I微米、細(xì)胞形態(tài)為桿狀，形成芽孢但不產(chǎn)生伴孢晶體。在PH為5.(T8.5之間生長良好，在pH為3.5的環(huán)境中，培養(yǎng)5h內(nèi)的存活率在90%以上，在pH為9.0的環(huán)境中，培養(yǎng)5h，存活率亦在85%以上。在90°C恒溫水浴處理30分鐘以后，存活率在70%以上。該枯草芽孢桿菌能夠很好的適應(yīng)動(dòng)物消化道環(huán)境，對(duì)飼料加工過程的熱處理不敏感，有利于制粒和膨化等工藝?！N含有枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑，采用上述枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基中充分培養(yǎng)、發(fā)酵后得到的代謝產(chǎn)物與吸附劑、稀釋劑混合均勻后，經(jīng)烘干、粉碎后得到微生態(tài)制劑。所述枯草芽孢桿菌的制備方法:
菌株原種的分離培養(yǎng):①固體平板培養(yǎng)基配方為蛋白胨log、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，培養(yǎng)條件為pH6_8、溫度為35°C、培養(yǎng)24-48h !②液體培養(yǎng)基為蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸鈣0.lg、加去離子水到總體積1000ml，挑取①得到的単菌落進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為PH6-8、溫度為37°C、恒溫?fù)u床160rpm/min、培養(yǎng)15_18h ;③發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂
0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，接種②得到的培養(yǎng)基菌液混合液3-5%進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為PH6-8、溫度為35°C、發(fā)酵罐攪拌器轉(zhuǎn)速120rpm/min，發(fā)酵時(shí)間為 30-84h。、
所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質(zhì)碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任何一種或一種以上的組合。所述培養(yǎng)、發(fā)酵后 得到的代謝產(chǎn)物與吸附劑、稀釋劑以質(zhì)量比1:1:2比例混合。所述枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，包括動(dòng)物日糧和枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的添加量為動(dòng)物飼料重量的
0.05%-0.15%。飼用動(dòng)物包括單胃動(dòng)物、反芻動(dòng)物以及水產(chǎn)動(dòng)物。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的枯草芽孢桿菌心subtilis ) CGMCCN0.3532具有耐酸、耐堿、耐熱、抑制腸道有害菌群(如大腸桿菌)的生長和繁殖，該枯草芽孢桿菌制劑作為動(dòng)物飼料添加劑，可替代現(xiàn)有動(dòng)物飼料中的抗生素，可改善動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系、促進(jìn)動(dòng)物健康生長、增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能、提供營養(yǎng)因子、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、降低動(dòng)物腹瀉率，可提高仔豬、仔雞的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )CGMCC N0.3532及其微生態(tài)制劑無耐藥性，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成破壞，也不會(huì)對(duì)人類的健康造成危害，是一種環(huán)境友好型微生態(tài)飼料添加劑。保藏說明
菌株:枯草芽抱桿菌subtilis 保藏日期:2009年12月17日
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào) 保藏編號(hào):CGMCC N0.353具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(^3ci77tts subtilis ),保藏號(hào):CGMCC N0.3532微生態(tài)制劑在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果。實(shí)施例1:
本實(shí)施例為保藏號(hào)為CGMCC N0.3532的枯草芽孢桿菌的篩選過程，具體步驟如下:
(I)、菌種的初步篩選
取仔豬十二指腸、回腸和直腸內(nèi)容物進(jìn)行生物篩選。將所取的腸道內(nèi)容物在80-90°C的水域中熱處理15分鐘，用滅菌去離子水分別作I倍稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋、20倍稀釋、100倍稀釋、1000倍稀釋后，LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)。篩選用LB 培養(yǎng)基，既蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g、瓊脂粉15_20g，加去離子水IOOOmL, 115°C高壓滅菌15min。(2)、菌種的復(fù)篩
將初篩出的枯草芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為液體培養(yǎng)基為蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸|丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml，37°C、210rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)15_18h。將得到的菌液在80°C水浴中處理5min后復(fù)篩，復(fù)篩培養(yǎng)基為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g、蔗糖25g、瓊脂粉15-20g,加去離子水IOOOmL, 115°C高壓滅菌15min。(3)、菌種耐酸堿的實(shí)驗(yàn)
將復(fù)篩得到的枯草芽孢桿菌菌液分別在PH為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,6.5,7.0、
7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h后，該枯草芽孢桿菌在pH為3.5處理組中存活率為91.5%，在pH為9.0處理組中存活率為86.2%。實(shí)施例2:
將實(shí)施例1所得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )，保藏號(hào):CGMCC N0.3532接種于固體斜面培養(yǎng)基上，所述固體斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，35°C恒溫培養(yǎng)36h，得到種子培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸|丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml,37°C、160rpm/min恒溫培養(yǎng)15_18h,取得到的菌液按體積比3_5%于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)及配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，35°C、發(fā)酵罐攪拌器轉(zhuǎn)速120rpm，發(fā)酵時(shí)間為72h，將得到的培養(yǎng)物與二氧化硅和輕質(zhì)碳酸鈣按1:1:2重量比混合，經(jīng)干燥、粉碎得到枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。實(shí)施例3:
將實(shí)施例:1所得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )，保藏號(hào):CGMCC N0.3532接種于固體斜面培養(yǎng)基上，所述固體斜面培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、瓊脂粉15 — 20g、氯化鈉5g、加去離子水到總體積1000ml，35°C恒溫培養(yǎng)36h，得到種子培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸I丐0.lg、加去離子水到總體積1000ml, 37°C、160rpm/min恒溫培養(yǎng)15_18h,取得到的菌液按體積比3_5%于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)及配方為玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂
0.05%、氯化鐵0.01%、2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%，35 °C、發(fā)酵罐攪拌器轉(zhuǎn)速120rpm，發(fā)酵時(shí)間為72h，將得到的培養(yǎng)物與二氧化硅和麩皮按1:1:2的重量比混合，經(jīng)干燥、粉碎得到枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。實(shí)驗(yàn)例:
本實(shí)驗(yàn)例是實(shí)施例2所得到的枯 草芽孢桿菌微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響，用日齡一致、體重接近的杜長大斷奶仔豬60頭，觀察枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響。仔豬分三個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)I組，為對(duì)照組，試驗(yàn)II組飼喂基礎(chǔ)日糧和添加0.05%的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，處理III組飼喂基礎(chǔ)日糧和添加0.1%的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑。I材料與方法
1.1微生態(tài)制劑
枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，采用實(shí)施例2的枯草芽孢桿菌制劑。1.2試驗(yàn)動(dòng)物
選擇日齡一致、體重接近的(杜長大)斷奶仔豬60頭，公母各半，按完全隨即分組設(shè)計(jì)分為3組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭仔豬，公母分開飼喂。1.3試驗(yàn)日糧
試驗(yàn)分為3個(gè)處理組，即對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)日糧+55mg/kg金霉素)，試驗(yàn)I組(飼喂基礎(chǔ)日糧+0.05%的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑)，試驗(yàn)II組(基礎(chǔ)日糧+0.1%的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑)?；A(chǔ)日糧原料組成及營養(yǎng)成分見表I。表I為試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平比較表。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于:該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的枯草芽孢桿菌Bacillus保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.3532。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于: 1)在pH為3.5的環(huán)境中，培養(yǎng)5h內(nèi)的存活率在90%以上； 2)在pH為9.0的環(huán)境中，培養(yǎng)5h，存活率亦在85%以上； 3)在90°C恒溫水浴處理30分鐘以后，存活率在70%以上。
3.一種含有權(quán)利要求1或2所述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑，其特征在于:枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基中經(jīng) 充分培養(yǎng)、發(fā)酵之后所得到的代謝產(chǎn)物與吸附劑/稀釋劑按1:1:2比例混合，經(jīng)烘干、粉碎后得到的微生態(tài)制劑，所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質(zhì)碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一種或一種以上的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，其特征在于:所述培養(yǎng)過程將枯草芽孢桿菌接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利3或4所述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑，其特征在于:所述的液體培養(yǎng)基為適合枯草芽孢桿菌生長的任何培養(yǎng)基，其優(yōu)選培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氫二鉀3g、硫酸鎂0.5g、碳酸鈣0.lg、加去離子水到總體積IOOOml0
6.根據(jù)權(quán)利3所述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為適合枯草芽孢桿菌生長的任何培養(yǎng)基；其優(yōu)選培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氫二鉀0.45%、硫酸鎂0.05%、氯化鐵0.01%,2.8%濃度的硫酸錳溶液0.1%。
7.根據(jù)權(quán)利3-6中任意一項(xiàng)所述枯草芽孢桿菌的微生態(tài)制劑,其特征在于:所述培養(yǎng)基是在溫度為35-37°C的條件下，培養(yǎng)15-72h ;其優(yōu)選枯草芽孢桿菌接種于固體斜面培養(yǎng)基,在35°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36h作為種子培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)物接種于液體擴(kuò)大培養(yǎng)基，在溫度為35-37°C下，培養(yǎng)15-18h ;擴(kuò)大培養(yǎng)的代謝產(chǎn)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在35°C下，培養(yǎng)72h。
8.一種含有權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)所述枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，包括動(dòng)物日糧和枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的添加量為動(dòng)物飼料重量的0.05%-0.15%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，其特征在于:所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的添加量?jī)?yōu)選為動(dòng)物飼料重量的0.1%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，其特征在于:所述動(dòng)物日糧包括豬用日糧、雞用日糧、水產(chǎn)動(dòng)物用日糧和反芻動(dòng)物用日糧。
全文摘要
本發(fā)明為一種枯草芽孢桿菌及其微生態(tài)制劑和在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，其特征在于該枯草芽孢桿菌為2009年12月17日保藏在《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》的枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCNo.3532?？莶菅挎邨U菌在培養(yǎng)基中經(jīng)充分培養(yǎng)、發(fā)酵之后所得到的代謝產(chǎn)物與吸附劑和稀釋劑按1:1:2比例混合，經(jīng)烘干、粉碎后得到的微生態(tài)制劑，所述的吸附劑為特制二氧化硅，所述的稀釋劑為輕質(zhì)碳酸鈣、麩皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一種或一種以上的組合。所述的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物飼料中的添加量為動(dòng)物飼料重量的0.05%-0.15%，提高動(dòng)物免疫機(jī)能，可有效替代抗生素。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103087964SQ201310040239
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者王海東, 潘寶海, 陳 峰 申請(qǐng)人:上海三維同力生物科技有限公司