專利名稱：一種基于mso/go的水體環(huán)境汞離子檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于汞離子特異性寡核苷酸探針(mercury-specific oligonucleotide, MS0)和氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)的萊離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，由汞引起的環(huán)境污染和中毒事件頻繁爆發(fā)。工業(yè)“三廢”的排放、城鄉(xiāng)垃圾的制造、農(nóng)藥的不合理使用等，使得這個“隱形殺手”正威脅著我們的生活、侵蝕著我們的軀體。其中，我國水體環(huán)境汞污染問題較為突出，據(jù)農(nóng)業(yè)部調(diào)查，我國污灌區(qū)面積約140X 104hm2，遭受重金屬污染的土地面積占污染總面積的64.8%，其中以汞等的污染面積最大。全國目前約有3.2X 104hm2的耕地受到汞的污染，涉及15個省市的21個地區(qū)。2012年4月，全國污染防治工作會議在南京召開，從公布的2011年《重金屬規(guī)劃》考核結(jié)果中看，2011年重金屬污染治理結(jié)果不理想，全國廢水中汞排放量增幅最大，上升26.1%。汞作為引起 全球性環(huán)境污染的重金屬之一，其在環(huán)境中主要以兩種形態(tài)存在，表現(xiàn)為無機(jī)汞和有機(jī)汞。汞離子(Hg2+)長時間沉積不僅會造成土壤和環(huán)境的不可逆性污染，而且Hg2+通過食物鏈傳遞富集，進(jìn)而進(jìn)入人體，蓄積在骨骼與各器官中對大腦、神經(jīng)系統(tǒng)等造成嚴(yán)重的破壞，嚴(yán)重危害著人類健康。因此，Hg2+的定性分析和定量檢測對環(huán)境監(jiān)測、食品工業(yè)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都具有重要的意義。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有許多靈敏性和特異性的Hg2+檢測方法逐漸運(yùn)用到實(shí)踐中。傳統(tǒng)的檢測方法有原子吸收分光光度法、原子熒光分光光度法、高效液相色譜法和質(zhì)譜法等，這些檢測法都需要大型儀器，成本昂貴，操作復(fù)雜耗時，且需要有熟練的人員操作；而近年來發(fā)展的光化學(xué)分析技術(shù)、電化學(xué)傳感器技術(shù)等，由于在靈敏度、特異性或操作簡便性等上的缺陷，往往只能對被檢物定性或半定量檢測，仍然無法滿足當(dāng)前對Hg2+檢測的要求。而新近發(fā)展的納米生物傳感器法具有體積小、簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，很大程度上彌補(bǔ)了這些缺陷，特別是其中利用Hg2+可與MSO之間形成特異錯配結(jié)合(T-Hg2+-T)這一特性構(gòu)建的系列Hg2+生物傳感器近年來逐漸成為研究的熱點(diǎn)，在環(huán)境Hg2+監(jiān)測中有十分廣闊的應(yīng)用前景。GO是由石墨經(jīng)化學(xué)氧化，超聲制備所得。它是一種二維的碳材料，具有電學(xué)性能優(yōu)、導(dǎo)熱性能好、力學(xué)強(qiáng)度高、比表面積大和水溶性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別是它具有很好地區(qū)分單雙鏈DNA和極高的熒光猝滅能力，因此也為生物分子的檢測提供了新的思路。GO與生物分子之間的相互作用得到了廣泛的研究。黃維等人設(shè)計(jì)了一種利用MSO和GO檢測汞離子的突光檢測方法(Xingfen Liu, Likun Miao, Xu Jiang, Yanwen Ma, Quli Fan and WeiHuang.Highly Sensitive Fluorometric Hg2+Biosensor with a Mercury (II)-SpecificOligonucleotide(MSO)Probe and Water-Soluble Graphene Oxide (WSGO).ChineseJournal of Chemistry2011, 29:1031-1035 ;利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測萊離子的突光檢測方法，專利申請?zhí)?201010223065.4.)，但所用MSO是具有28個堿基的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，含有不與Hg2+結(jié)合的環(huán)結(jié)構(gòu)和部分莖結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的汞離子檢測方法存在的不足，提供一種基于MS0/G0的痕量汞離子檢測方法及用于水體環(huán)境汞離子超靈敏檢測的試劑盒。為了能夠降低DNA的合成成本，并提高汞離子檢測的靈敏度，本研究者發(fā)現(xiàn)短序列寡核苷酸比長序列寡核苷酸與GO吸附速率更快而且更緊密，本發(fā)明對MSO進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)并提供一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法和試劑盒，以滿足實(shí)際環(huán)境監(jiān)測中高效率低成本的要求。本發(fā)明的第一個目的是公開兩條優(yōu)化的MSO序列，去除原有MSO非特異的環(huán)部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，序列分別為5 ’ -TTCTTTCTT-3 ’(熒光標(biāo)記)和5，-TTGTTTGTT-3’ (未熒光標(biāo)記)。本發(fā)明的第二個目的是公開一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法。這種新方法可包括以下步驟:(I)將熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MSO、GO在緩沖液中混合，室溫反應(yīng)；(2)將待測水溶液加入到上述溶液中，室溫反應(yīng)；(3)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光波長曲線的掃描，觀察熒光強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。本發(fā)明的第三個目的是提供一種基于MS0/G0的水中汞離子快速檢測的試劑盒，它含有:(1)60，濃度為0.58/1;(2)熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MS0，濃度均為I μ mo I/L ；(3)含有金屬離子的Tris-HCl緩沖液，濃度為20mM，PH為7.4 ;(4)陽性對照溶液和陰性對照溶液；(5)說明書。本發(fā)明的有益效果:(I)靈敏度高，最低檢測限為IOpM ；(2)特異性強(qiáng)，與除Hg2+以外的其它10種金屬離子交叉反應(yīng)低；(3)價(jià)格低廉，優(yōu)化設(shè)計(jì)后的MSO僅截取原MSO兩端的莖部分(9bp)；(4)操作便捷，無需樣本前處理；(5)具有一定的可重復(fù)使用性。

我們成功構(gòu)建了一種基于MSO/和GO的汞離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。具體涉及通過非共價(jià)鍵(η-η疊加)作用力將熒光修飾和未熒光修飾的兩種MSO吸附到GO的表面，利用MSO與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標(biāo)記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復(fù)，通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，實(shí)現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的兩條截短的MS0(9bp)，序列更短、成本更低；利用GO對熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MSO的影響，實(shí)現(xiàn)對Hg2+的定量檢測，且靈敏度更高(IOpM)，與黃維和劉興奮等人報(bào)道結(jié)果(最低檢測限為187pM)相比提高了 18倍。本發(fā)明涉及的汞離子檢測方法，在其他金屬離子存在的情況下，依然擁有良好的選擇性，并且實(shí)現(xiàn)了可重復(fù)使用的實(shí)際利用價(jià)值。該汞離子檢測方法和試劑盒在不使用任何特殊儀器條件下就可以實(shí)現(xiàn)對Hg2+便捷分析，操作簡便，分析速度快，靈敏度高，特異性強(qiáng)，對很多非特異性金屬離子的響應(yīng)都非常小，特別適合于推廣利用。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MSO用量優(yōu)化設(shè)計(jì)圖2緩沖液優(yōu)化設(shè)計(jì)(注=Bufferl表示含有金屬離子Tris-HCl緩沖液，Buffer2表示不含有金屬離子Tris-HCl緩沖液)圖3 GO與Hg2+加樣順序探究圖4 GO用量優(yōu)化設(shè)計(jì)圖5最佳反應(yīng)時間確定 圖6 Hg2+熒光檢測靈敏度分析圖7 Hg2+熒光檢測特異性評價(jià)圖8熒光檢測混合溶液(注:A為一價(jià)金屬離子混合組；B為二價(jià)金屬離子混合組；C為堿土金屬混合組；D為一價(jià)金屬離子混合組+100 μ M Hg2+ ；Ε為二價(jià)金屬離子混合組+100 μ M Hg2+ ；F 為堿土金屬混合組 +100 μ M Hg2+ ；G 為 100 μ M Hg2+)圖9熒光檢測河水模擬標(biāo)本(注:Α:空白對照組組；Β:河水組；C:10 μ M Hg2+河水組)圖10可重復(fù)利用性研究(注:1:去離子水組；2:第一次加入Hg2+ ；3:第一次加入Na2S2O3 ；4:第二次加入 Hg2+)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。以下是部分本發(fā)明實(shí)施例中所用的儀器和設(shè)備，其他未注明的實(shí)驗(yàn)條件按照常規(guī)或以其制造廠商所建議的條件:RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；MiniSpin個人型高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);Centrifuge5417R小型臺式高速冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；Thermo Scientific NanoDrop2000 分光光度計(jì)(美國 ThermoScientific 公司)；PURELAB Classic 超純水儀(英國 ELGA LabWater 公司);PHS_3C 型 PH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子天平BSA224S (德國sartorius公司)；通風(fēng)櫥(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；高壓鍋(日本ALP公司)。實(shí)施例1 MSO優(yōu)化設(shè)計(jì)本發(fā)明選用的MSO序列見表1，其中MSO1為黃維等人報(bào)道的汞離子特異性寡核苷酸探針(莖環(huán)結(jié)構(gòu))。為了能夠提高汞離子檢測的靈敏度，并降低DNA的合成成本，對MSO1進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，去除非特異的環(huán)部分(4bp)，截取兩端的莖部分(9bp)，分別標(biāo)記為1^02和MSO3。
表I汞離子特異性寡核苷酸
權(quán)利要求
1.一種基于MSO/GO汞離子檢測用的熒光標(biāo)記MSO序列:5’ -TTCTTTCTT-3’和未熒光標(biāo)記 MSO 序列:5’ -TTGTTTGTT-3’。
2.一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，依次包括以下步驟: (1)將突光標(biāo)記和未突光標(biāo)記的MSO、GO在緩沖液中混合,室溫反應(yīng)； (2)將待測水溶液加入到上述溶液中，室溫反應(yīng)； (3)用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光波長曲線的掃描，觀察熒光強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，將熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MS0，通過非共價(jià)鍵(J1-Ji疊加)作用力吸附到GO表面，如果溶液中不存在汞離子，熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MSO會無規(guī)則卷曲，通過強(qiáng)烈的π-π疊加作用而吸附于GO的表面，使得標(biāo)記于MSO末端的熒光基團(tuán)由于染料與GO之間的高效電子或能量轉(zhuǎn)移而嚴(yán)重猝滅；如果溶液中存在汞離子，這兩種MSO會與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標(biāo)記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復(fù)；通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，可以實(shí)現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的突光標(biāo)記和未突光標(biāo)記的MSO的序列為權(quán)利要求1所述的序列，突光標(biāo)記的MSO的序列5’ -TTCTTTCTT-3’和未熒光標(biāo)記的MSO的序列5’ -TTGTTTGTT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的MSO的濃度均為I μ Μ,熒光標(biāo)記的染料為熒光素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的GO用量為5 μ 1，濃度 為0.5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的緩沖液為含有IOOmM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2的Tris-HCl緩沖液，PH為7.4，Tris-HCl 濃度為 20mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(I)所述的室溫反應(yīng)時間為5分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，所有步驟均需在避光條件下進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的室溫反應(yīng)時間為30分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于MS0/G0的汞離子檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的熒光波長掃描，所用的激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為522nm。
12.—種用于特異性檢測汞離子檢測的MS0/G0試劑盒，其特征在于，試劑盒中含有: (1)G0，濃度為0.5g/L； (2)熒光標(biāo)記和未熒光標(biāo)記的MS0，濃度均為Iμ mo I/L ； (3)含有金屬離子的Tris-HCl緩沖液，濃度為20mM，PH為7.4 ; (4)陽性對照溶液和陰性對照溶液； (5)說明書。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特異性檢測汞離子的MS0/G0試劑盒，其特征在于，步驟(4)所述的陽性對照溶液為10iimol/LHgCl2溶液，陰性對照為去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于汞離子特異性寡核苷酸探針(mercury-specific oligonucleotide，MSO)和氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)的汞離子檢測方法及用于水中汞離子快速檢測的試劑盒。利用非共價(jià)鍵(π-π疊加)作用力將熒光修飾和未熒光修飾的優(yōu)化MSO吸附到GO的表面，利用MSO與汞離子形成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，使熒光標(biāo)記的MSO從GO表面釋放和熒光信號得到恢復(fù)，通過檢測溶液中熒光信號的變化情況，實(shí)現(xiàn)溶液中汞離子的定量檢測。本發(fā)明所述的方法在不需要任何特殊條件下即可實(shí)現(xiàn)對汞離子便捷分析，最低檢測限為10pM，靈敏度大幅提高，并降低了DNA合成成本，為監(jiān)測水中汞離子的污染提供一種簡便、高效、靈敏、高性價(jià)比的解決方案，易于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK103173540SQ201310037728
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月3日
發(fā)明者呂建新, 吳文鶴 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院