專利名稱：一種利用ssr分子標記對五節(jié)芒與荻雜交種進行快速鑒定的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物雜交種鑒定技術領域，具體涉及一種芒屬植物雜交種分子鑒定方法。
背景技術：
芒屬植物(Miscanthus)為禾本科、多年生高大草本C4植物,作為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉粗参锶找媸艿疥P注。中國是芒屬植物的起源與分布中心，具有豐富的野生資源、生態(tài)類型多。芒屬植物適應性廣、抗逆性強、產(chǎn)量高、凈能產(chǎn)出高、生物質(zhì)品質(zhì)好、轉(zhuǎn)化利用途徑廣、生態(tài)價值好等特點，適合在邊際土地上種植利用，是一種兼具生態(tài)效益與經(jīng)濟效益的草本能源植物。芒屬植物中的荻(Miscanthus Sacchariflorus)在我國東北、西北、華北及華東均有分布，抗逆性強，自然衰老，在耐鹽堿方面表現(xiàn)顯著，可作為改良鹽堿的先鋒植物，但生物質(zhì)產(chǎn)量較低。五節(jié)芒(Miscanthus Floridulus)分布于長江中下游及以南區(qū)域,具有植株高大，生物質(zhì)產(chǎn)量高，其莖及葉可為造紙原料，葉幼嫩時可做飼料，但抗旱、耐寒能力較弱，且不能自然衰老等特點。作為能源植物必須具備高生物質(zhì)產(chǎn)量、高環(huán)境適應能力、低生產(chǎn)成本和產(chǎn)品的低含水量等特性，因此荻和五節(jié)芒單獨作為能源植物的利用價值不大。開展五節(jié)芒和荻作的人工雜交研究，是利用荻和五節(jié)芒的各自優(yōu)良性狀，培育出抗逆性強、高產(chǎn)、廣適應性等綜合性狀優(yōu)良新品種的最佳途徑。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)芒屬植物的自交結(jié)實率在不同基因型芒屬植物中存在較大的差異，因此有可能在雜交種后代中存在自交苗，必須要準確的鑒定真假雜交種植株，避免在遺傳分析和育種選擇中出現(xiàn) 誤差。形態(tài)學性狀是雜交種鑒定的基礎，尤其一些父本所特有的性狀在雜種中的表現(xiàn)，是鑒別雜交種的重要形態(tài)學標記，但其鑒定耗時長，占用大量土地資源，形態(tài)學性狀受環(huán)境影響等，不利于雜交種的快速鑒定。本發(fā)明方法利用SSR分子標記對芒屬植物五節(jié)芒與荻人工雜 交種真實性進行鑒定，具有快速、準確、重復性好，不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，為開展芒屬植物分子育種奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效快速的五節(jié)芒與荻雜交種的鑒定方法，該方法操作簡便、具有快速、重復性好、不受環(huán)境因素影響、鑒定結(jié)果準確可靠，非常適合五節(jié)芒與荻雜交種群體的早期鑒定。本發(fā)明的目的是通過下述方式實現(xiàn)的:一種利用SSR分子標記對五節(jié)芒與荻雜交種進行快速鑒定的方法，包括以下步驟:I)基因組DNA的提取待測的五節(jié)芒與荻雜交種植株提取DNA ；2) SSR-PCR 反應
加入HAU-170號引物進行SSR-PCR，引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGTTGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ；3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR反應產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)銀染和條帶分析。步驟I)的具體過程為:待測的五節(jié)芒與荻雜交種植株長到4-5葉時，采用CTAB法提取葉片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。步驟2)的SSR-PCR反應體系為:PCR 反應體積為 15 μ L，其中包括:10XBufferl.5 μ L, 25mmo1.171 的 MgCl2L 5 μ L，IOmmol.Γ1 的 dNTPs0.3 μ L，5U.μ Γ1 的 Taq 聚合酶 0.1 μ L, 20_25ng.μ Γ1 的 DNA 模板2yL,2ymol.L-1的引物1.5 μ L，超純水補足；PCR反應程序為:94°C預變性5min，35個循環(huán):94°C變性30s，54°C退火溫度下復性30s，72°C延伸lmin，最后72°C延伸7min后4°C保存。步驟3)的具體過程為:PCR產(chǎn)物在非變 性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測，用IXTBE作為電泳緩沖液；在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 μ L的6X上樣緩沖液混合，加入2 μ L至點樣孔中，電泳2小時。步驟4)的具體過程為:固定:將電泳完的凝膠放入400mL的固定液中固定5min，然后用蒸餾水清洗一次；銀染:在400mL的銀染液中銀染12min，然后用蒸餾水清洗一次；清底:在400mL的硫代硫酸鈉溶液里面洗30s，變黃倒掉，用蒸餾水清洗一次；顯影:然后將凝膠放入400mL的顯影液中6 lOmin，待顯出條帶后再用蒸餾水清洗一次；終止:用400mL的終止液終止顯影，在膠片燈下觀察拍照；分析:在五節(jié)芒與荻雜交種植株中包含一個大小IOObp左右的特異性條帶和一個大小為123bp左右的特異性條帶；確定為真實雜交種。所述的五節(jié)芒與荻雜交種是利用湖南邵陽五節(jié)芒和陜西鳳縣的荻為親本培育出的雜交群體。本發(fā)明提出的對五節(jié)芒與荻雜交種分子鑒定方法，利用特異性SSR引物，使得五節(jié)芒與荻的雜交種在苗期就可以進行快速鑒定。在特異性引物的篩選過程中，提取了全國不同地區(qū)五節(jié)芒和荻的DNA樣本，材料分布范圍廣，驗證了 HAU-170引物的廣適用性。在五節(jié)芒和荻的雜交群體鑒定中，HAU-170號引物在雜交后代中表現(xiàn)出良好的互補性，且鑒定出的真雜交種植株在田間也被鑒定為真雜種。本發(fā)明為五節(jié)芒與荻的雜交種群體提供了一種操作簡單、快速準確、重復性好、不受環(huán)境因素影響的鑒定方法。


圖1:五節(jié)芒與荻的HAU-170引物的標記結(jié)果；
圖2:利用HAU-170號引物進行雜交種群體鑒定的標記結(jié)果。
具體實施例方式實施例1:引物篩選I)基因組DNA的提取選取各個地區(qū)的五節(jié)芒與荻及已獲得的五節(jié)芒與荻人工雜交種植株(實驗材料保存于湖南農(nóng)業(yè)大學芒屬植物資源圃)，待植株長到4-5葉時，選取幼嫩無病斑的葉片，用蒸餾水沖洗2 3遍，再采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，溶解DNA的TE溶液pH值為8.0 ;4°C保存?zhèn)溆?。待基因組DNA完全溶解后，DNA濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測來確定。2 )基于PCR的SSR分子標記分析
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PCR 反應體積為 15ii L，其中包括:10 X Bufferl.5 ii L，MgCl2 (25mmol.171)1.5u L,dNTPsdOmmol -L—1) 0.3 y L，Taq 聚合酶(5U u L-1) 0.1 y L，DNA 模板(20_25ng.u L-1) 2u L,引物(2 u mo1-LlLSiiL,超純水補足。PCR反應程序為:94°C預變性5min，35個循環(huán)(94 °C變性30s，54°C退火溫度下復性30s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min后4°C保存。反應在 Biometra Tgradient PCR 儀中進行。引物序列如下:正向引物序列:5’-TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’，反向引物序列:5’ -ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3'；3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠(配方見表I)電泳上檢測，用I X TBE作為電泳緩沖液。在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 ii L的6X上樣緩沖液(0.25% (W/V)溴酚藍，0.25%(W/V)二甲苯青FF，40% (W/V)蔗糖水溶液)混合，用IOii L的tip頭加入2 y L至點樣孔中，電泳恒定電壓為200V，電泳2小時后，硝酸銀染色。表I非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳配方
權利要求
1.一種利用SSR分子標記對五節(jié)芒與荻雜交種進行快速鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)基因組DNA的提取 待測的五節(jié)芒與荻雜交種植株提取DNA ； 2)SSR-PCR 反應 加入HAU-170號引物進行SSR-PCR，引物序列如下: 正向引物序列:5’ -TGCATGGITGCTTCAGCAGT-3’， 反向引物序列:5’-ACAGAA ACCAATGCATGTGATGAG-3’ ； 3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR反應產(chǎn)物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4)銀染和條帶分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟I)的具體過程為: 待測的五節(jié)芒與荻雜交種植株長到4-5葉時，采用CTAB法提取葉片DNA，所提取的DNA溶解于pH8.0的TE溶液中，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟2)的SSR-PCR反應體系為: PCR 反應體積為 15ii L，其中包括=IOXBufferL 5u L,25mmol I71 的 MgCl2L 5 u L,IOmmol L-1 的 dNTPs0.3u L,5U u L-1 的 Taq 聚合酶 0.1 y L, 20_25ng.u L-1 的 DNA 模板2uL,2umol L-1的引物1.5 yL，超純水補足；PCR反應程序為:94°C預變性5min，35個循環(huán):94°C變性30s，54°C退火溫度下復性30s，72°C延伸lmin，最后72°C延伸7min后4°C保存。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟3)的具體過程為: PCR產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測，用I X TBE作為電泳緩沖液；在SSR-PCR產(chǎn)物體系中加入2 ii L的6X上樣緩沖液混合，加入2u L至點樣孔中，電泳2小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟4)的具體過程為: 固定:將電泳完的凝膠放入400mL的固定液中固定5min,然后用蒸懼水清洗一次； 銀染:在400mL的銀染液中銀染12min，然后用蒸餾水清洗一次； 清底:在400mL的硫代硫酸鈉溶液里面洗30s，變黃倒掉，用蒸餾水清洗一次； 顯影:然后將凝膠放入400mL的顯影液中6 lOmin，待顯出條帶后再用蒸餾水清洗一次； 終止:用400mL的終止液終止顯影，在膠片燈下觀察拍照； 分析:在五節(jié)芒與荻雜交種植株中包含一個大小IOObp左右的特異性條帶和一個大小為123bp左右的特異性條帶；確定為真實雜交種。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于， 所述的五節(jié)芒與荻雜交種是利用湖南邵陽五節(jié)芒和陜西鳳縣的荻為親本培育出的雜交群體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用SSR分子標記對草本能源植物五節(jié)芒與荻的種間遠緣雜交種進行快速鑒定的方法。選取植株的幼嫩葉片，蒸餾水清洗后采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，基于PCR的SSR分子標記分析各個地區(qū)五節(jié)芒和荻分別具有的特異性條帶，篩選出1對合適的SSR標記，該標記在五節(jié)芒中產(chǎn)生一個特異性條帶(100bp左右)，同時在荻中產(chǎn)生另一個特異性條帶(123bp左右)，而在兩者的雜交后代中則表現(xiàn)為共顯性，因此該SSR標記可用于五節(jié)芒與荻雜交后代的分子鑒定。利用本發(fā)明的方法可以快速準確地鑒定五節(jié)芒和荻的雜交種的真實性。本發(fā)明為五節(jié)芒與荻的雜交提供了一種操作簡單、快速準確、重復性好、不受環(huán)境因素影響的鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK103074440SQ201310037209
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月31日 優(yōu)先權日2013年1月31日
發(fā)明者易自力, 朱玉葉, 艾辛, 蔣建雄 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學