專利名稱：一株高產(chǎn)丙三醇及微量副產(chǎn)物的突變株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)丙三醇的突變株及應(yīng)用，特別是一株高產(chǎn)丙三醇及微量副產(chǎn)物的突變株及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國人均丙三醇耗用量遠(yuǎn)低于西方發(fā)達(dá)國家，而且我國丙三醇的消費(fèi)構(gòu)成與發(fā)達(dá)國家相差甚大，國內(nèi)丙三醇的消費(fèi)大戶是涂料工業(yè)，占總消費(fèi)量的49%，而美國還不到10%，涂料工業(yè)用量較高的日本，也不到20%。然而成明顯反差的是，美國在藥品和食品方面丙三醇用量占54%，而我國還不到10%。從發(fā)展角度來講，我國丙三醇消費(fèi)的構(gòu)成是會向發(fā)達(dá)國家靠攏的，可以預(yù)測丙三醇的消費(fèi)量和應(yīng)用范圍在我國將會增加。發(fā)酵生產(chǎn)丙三醇采用的是淀粉質(zhì)原料，安全性好，綠色環(huán)保，因此其在藥品和食品上使用的競爭優(yōu)勢是顯而易見的。我國好氧發(fā)酵生產(chǎn)甘油的生產(chǎn)水平已經(jīng)較高，但從目前研究情況看，生產(chǎn)水平的提高、成本的降低和質(zhì)量的改進(jìn)等諸方面的潛力仍是不小的。發(fā)酵法生產(chǎn)丙三醇的難點(diǎn)之一是發(fā)酵甘油的提取。高沸點(diǎn)、稠粘、易焦化有機(jī)物質(zhì)蒸餾問題一直是國際上公認(rèn)的難題，因此從發(fā)酵液中提取高沸點(diǎn)的丙三醇非常困難，常規(guī)水蒸汽蒸餾丙三醇損失率達(dá)50%，這就影響了生物技術(shù)生產(chǎn)丙三醇的應(yīng)用。在發(fā)明專利ZL99111308.X中，本發(fā)明人研究確立的載體蒸餾技術(shù)將甘油蒸餾效率從50%提高到90%。但是，高產(chǎn)丙三醇假絲酵母在菌體生長和發(fā)酵過程中生物代謝極其復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)了 8種有機(jī)酸組分:乙酸、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、酮戊二酸、丙酸、戊酸、丁酸。因此，降低丙三醇發(fā)酵液中有機(jī)物質(zhì)如有機(jī)酸含量將是繼續(xù)提聞收率的主要關(guān)鍵因素，特別是有利于提聞丙二醇成品的質(zhì)量、降低提取成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株高產(chǎn)丙三醇及微量副產(chǎn)物的突變株及應(yīng)用，發(fā)明人利用遺傳育種技術(shù)，以亞硝基胍和紫外線為誘變因子，對產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)進(jìn)行了復(fù)合誘變，成功提高了甘油合成關(guān)鍵酶胞衆(zhòng)3_磷酸甘油脫氫酶CtGPD酶活，在30%溶氧條件下CtGPD在36h和72h出現(xiàn)了峰值，分別為較原菌株的50mU/mg和45mU/mg提高到70mU/mg和71mU/mg Pr,分別提高了 40%和58%,進(jìn)而加速了甘油的合成，并有效減少了菌株生長及發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機(jī)酸量，取得了較好的效果。所述菌株于2012年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6830，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)丙三醇的方法。本發(fā)明采用的發(fā)酵條件:糖濃度為20-35%(w/v)、尿素含量為0.1-0.3%(w/v)、玉米漿含量為
0.1-0.4%(w/v)，調(diào) 節(jié)pH為3.0-5.0，接種量1_6%(ν/ν)，在30_100m3發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧發(fā)酵，溶氧保持25%-35%，發(fā)酵溫度為29-33°C，發(fā)酵時(shí)間為70_120h。該突變株在上述發(fā)酵條件下產(chǎn)丙三醇濃度達(dá)11_18%，而發(fā)酵過程產(chǎn)雜質(zhì)如乙酸、乳酸、丙酮酸、酮戊二酸、蘋果酸等，分別從9.17g/L、13.74g/L、2.18g/L、3.96g/L和4.82g/L 下降至 3.54g/L、4.42g/L、l.65g/L、0.49g/L 和 1.lOg/L,分別下降為原濃度的 38.6%、32.1%、75.6%、12.3% 和 22.8%。采用本發(fā)明提供的菌株，發(fā)酵液經(jīng)去菌體、濃縮和真空度為-0.1MPa -0.09MPa進(jìn)行水蒸汽真空載體蒸餾后，加入原工藝2/3量的活性炭脫臭和脫色即獲得成品一級丙三醇，其丙三醇含量為>95%。
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1以亞硝基胍和紫外線為誘變因子，對C.glycerinogenes進(jìn)行了復(fù)合誘變，以甘油合成關(guān)鍵酶胞漿3-磷酸甘油脫氫酶CtGPD酶活性、丙三醇轉(zhuǎn)化率及濃度和副產(chǎn)物濃度為篩選依據(jù)，從1200個(gè)突變株中獲得I株高產(chǎn)丙三醇痕量副產(chǎn)物的突變株，2012年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心，編號CGMCC N0.6830。實(shí)施例2對發(fā)酵過程中C.glycerinogene突變株甘油合成關(guān)鍵酶胞衆(zhòng)3_磷酸甘油脫氫酶CtGPD酶活進(jìn)行跟蹤分析，測定方法如下:反應(yīng)體系由20mmol/L咪唑-HCl buffer(pH7.0)、ImmoI/LDTTUmmoI/L MgC12、0.09mmol/L NADH 和 0.67mmol/L DHAP 組成。反應(yīng)溫度 30°C，以加入DHAP為O時(shí)，線性范圍為2min。在340nm處測定30s和90s時(shí)的吸光度。一個(gè)單位酶活定義為在30°C溫度下的上述反應(yīng)體系內(nèi)一分鐘消耗I μ mol NADH所需的酶量。結(jié)果為在30%溶氧條件下CtGPD在36h和72h出現(xiàn)了峰值，較原菌株分別提高了 40%和58%。實(shí)施例3
利用HPLC技術(shù)分析發(fā)酵液中副產(chǎn)物，方法為:首先將發(fā)酵液離心除去酵母細(xì)胞，上清液用0.22 μ m混合纖維素酯微孔膜過濾即可用于HPLC檢測。HPLC測定檢測條件:Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱；柱溫:60°C ;流動相:5mmol/L 硫酸；流速:0.6mL/min ;進(jìn)樣量:20 μ L ;檢測器=Dionex示差檢測器和210nm紫外檢測器，所有樣品先經(jīng)0.22 μ m纖維素微孔濾膜過濾處理。0.1%的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸溶液采用超純水配制，022 μ m微孔濾膜過濾后備用。標(biāo)準(zhǔn)品皆為優(yōu)級和純色譜級。結(jié)果為:發(fā)酵過程產(chǎn)雜質(zhì)如乙酸、乳酸、丙酮酸、酮戊二酸、蘋果酸等，分別從 9.17g/L、13.74g/L、2.18g/L、3.96g/L 和 4.82g/L 下降至 3.54g/L、
4.42g/L、l.65g/L、0.49g/L 和 1.10g/L，分別下降為原濃度的 38.6%,32.1%、75.6%、12.3%和22.8%。實(shí)施例4取玉米淀粉12000公斤，制成粉狀乳漿，每克淀粉加入8-12單位的食品級α -淀粉酶，在85-95°C下液化10-25min，再加入120-150單位/克淀粉的α -1, 4葡萄糖苷酶于55-65°C糖化15-25h，過濾后制得糖濃度為20%_30%的糖液35_40m3。向糖液中加入100-150公斤有機(jī)氮源，調(diào)節(jié)pH為4-5。添加10%(V/V)分級培養(yǎng)的產(chǎn)甘油假絲酵母CGMCC N0.6830種子培養(yǎng)液，在50m3的發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧發(fā)酵，通風(fēng)量為0.05-0.1:100，溫度30_33°C，發(fā)酵80-120h。發(fā)酵液濃丙三醇度達(dá)11-18%發(fā)酵液離心除去菌體，離心液真空濃縮獲得粗丙三醇，其丙三醇含量為75%-85%。將此粗丙三醇加入奧土載體，攪拌均勻。將該混合物吸入載體蒸餾器，在真空度為-0.1MPa -0.09MPa進(jìn)行水蒸汽真空載體蒸餾。得到粗丙三醇，最后經(jīng)脫臭和脫色(原工藝2/3量的活性炭處理)獲得成品一級丙三醇，其丙三醇含量>95%。實(shí)施例5取玉米淀粉9000公斤，制成粉狀乳漿，每克淀粉加入8-12單位的食品級α -淀粉酶，在85-95°C下液化10-25min，再加入120-150單位/克淀粉的α -1, 4葡萄糖苷酶于55-65°C糖化15-25h，過濾后制得糖濃度為25%_30%的糖液28_30m3。向糖液中加入80-120公斤有機(jī)氮源，調(diào)節(jié)pH為4-5。添加10%(V/V)分級培養(yǎng)的Candida glycerinogenes CGMCCN0.6830種子培養(yǎng)液，在40m3的發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧發(fā)酵，通風(fēng)量為0.05-0.1:100，溫度30-33°C，發(fā)酵80-120h。發(fā)酵液濃丙三醇度達(dá)11_18%發(fā)酵液離心除去菌體，離心液真空濃縮獲得粗丙三醇，其丙三醇含量為75%-85%。將此粗丙三醇加入奧土載體，攪拌均勻。將該混合物吸入載體蒸餾器，在真空度為-0.1MPa -0.09MPa進(jìn)行水蒸汽真空載體蒸餾。得到粗丙三醇，最后經(jīng)脫臭和脫色(原工藝2/3量的活性炭處理)獲得成品一級丙三醇，其丙三醇含量>95%?！?br> 權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)丙三醇及微量副產(chǎn)物的突變株，于2012年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6830。
2.權(quán)利要求1所述的突變株，其特征是通過誘變獲得的產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)的變種。
3.應(yīng)用權(quán)利I或2所述突變株發(fā)酵生產(chǎn)丙三醇的方法，其培養(yǎng)特征在于使用糖濃度20-35%(w/v)、尿素含量0.1-0.3%(w/v)、玉米漿含量0.1-0.4%(w/v)配制的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH為3.0-5.0，接種量1-6%(v/v)，在30-100m3發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧發(fā)酵，溶氧保持25%-35%，發(fā)酵溫度為29-33°C，發(fā)酵時(shí)間為70_120h。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述溶氧控制為30%。
5.如權(quán)利要求3所述 的方法，其特征在于所述pH為4.0-5.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)丙三醇及微量副產(chǎn)物的突變株及其應(yīng)用，于2012年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6830。將含20-30%的糖液，加入營養(yǎng)物質(zhì)，采用優(yōu)良的生產(chǎn)菌株在相應(yīng)的發(fā)酵罐中進(jìn)行好氧發(fā)酵，除菌體后，進(jìn)行真空濃縮，以載體蒸餾法提取丙三醇，經(jīng)精制后可獲得濃度為95-98%的不同系列與濃度的丙三醇產(chǎn)品。本發(fā)明的一株高產(chǎn)丙三醇副產(chǎn)物痕量的突變株是在保持原生產(chǎn)菌株高產(chǎn)特性基礎(chǔ)上，大大降低發(fā)酵過程中主要副產(chǎn)物——多種有機(jī)酸的產(chǎn)量，使發(fā)酵液產(chǎn)物更單一，有力提高產(chǎn)品的收率、簡化提取過程。
文檔編號C12P7/18GK103160443SQ201310034579
公開日2013年6月19日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者諸葛斌, 方慧英, 諸葛健, 宗紅 申請人:江南大學(xué)