專利名稱：使用丙三醇氧化途徑被阻斷的重組菌株生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)丙三醇氧化途徑被阻斷的重組菌株生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，更特別的是涉及通過重組菌株的兩步法培養(yǎng)生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述重組菌株中氧化代謝途徑中的產(chǎn)生副產(chǎn)物的丙三醇代謝途徑被阻斷。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇可用作合成聚酯、聚醚或聚氨酯的原材料，并用于各種應(yīng)用中，包括纖維(如高功能的衣服、地毯或汽車織物)及塑料薄膜。特別是，1，3-丙二醇與對(duì)苯二甲酸聚合產(chǎn)生的聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PPT)具有優(yōu)良的物理性能，且熔點(diǎn)為228 °C，低于聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)的熔點(diǎn)。因此，聚對(duì)苯二甲酸丙二酯具有強(qiáng)實(shí)用性且作為能夠替代 PET的下一代纖維材料。而且，相比較于丁二醇或乙二醇產(chǎn)生的產(chǎn)物，單體1，3-丙二醇產(chǎn)生的塑料和聚合物示出了極好的光學(xué)穩(wěn)定性。此外，1，3-丙二醇可用作聚乙二醇型潤滑劑和溶劑，從而其商業(yè)價(jià)值的評(píng)估高于丙三醇。1，3-丙二醇可通過化學(xué)合成或微生物發(fā)酵生產(chǎn)。生產(chǎn)1，3-丙二醇的化學(xué)過程包括通過加氫甲酰化將環(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的過程(美國專利號(hào)3，687，981)及通過水合作用將丙烯醛轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的過程(美國專利號(hào)5，015，789)。然而，這些化學(xué)過程存在的問題在于1，3-丙二醇的生產(chǎn)過程需要高溫或高壓，導(dǎo)致高生產(chǎn)成本并產(chǎn)生含有環(huán)境污染物的廢油。生物過程包括使用微生物由丙三醇生產(chǎn)1，3-丙二醇的過程，所述微生物如檸檬酸細(xì)菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬等，它們都是兼性厭氧菌株 (美國專利號(hào)5，254，467)。在使用上述微生物將丙三醇轉(zhuǎn)化到1，3-丙二醇的代謝過程中，產(chǎn)生了大量的各種氧化代謝產(chǎn)物。特別是，丙三醇的氧化代謝產(chǎn)物2，3 -丁二醇與1，3-丙二醇的沸點(diǎn)相似，因此作為1，3-丙二醇純化過程中的巨大障礙。以前，本發(fā)明人試圖使用代謝工程技術(shù)研發(fā)微生物，所述微生物在丙三醇代謝中只產(chǎn)生1，3-丙二醇，而不產(chǎn)生包括2，3-丙二醇的氧化代謝副產(chǎn)物，因此本發(fā)明人使用基因重組技術(shù)構(gòu)建了突變體，其中該突變體的丙三醇代謝途徑中產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化代謝途徑被阻斷以使該突變體只具有產(chǎn)生1，3-丙二醇的還原代謝途徑(韓國專利申請(qǐng)?zhí)?0-2008-0122166)。然而，盡管在普遍分批培養(yǎng)中不產(chǎn)生副產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的突變體的1，3-丙二醇產(chǎn)量低。因此，本發(fā)明人為了盡力增加重組菌株培養(yǎng)過程中1，3-丙二醇的產(chǎn)量，在所述重組菌株中，丙三醇代謝途徑中產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化代謝途徑被阻斷。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行兩步法培養(yǎng)過程時(shí)將增加1，3-丙二醇的產(chǎn)量，從而完成本發(fā)明，所述兩步法培養(yǎng)過程包括不添加丙三醇到培養(yǎng)基中的第一步培養(yǎng)過程，及添加丙三醇到培養(yǎng)基中的第二步培養(yǎng)過禾呈。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于改進(jìn)培養(yǎng)重組菌株的方法，在所述重組菌株中，丙三醇代謝途徑中產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化代謝途徑被阻斷，從而提供具有提高生產(chǎn)率的生產(chǎn)1，3_丙二醇的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，在所述微生物突變體中，轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因或二羥基丙酮激酶編碼基因被缺失或被失活，并且該微生物能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因的載體引入肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)中，該突變體缺失丙三醇脫氫酶基因 (DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、1，3_丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA》，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因插入到突變體 (AK菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3"丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶激活因子編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)中，該突變體缺失丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶激活因子II基因(DhaBA2)，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶再激活因子編碼基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3"丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AR菌株)中，該突變體缺失轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因 (DhaBA2)，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，該微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶再激活因子編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AR菌株)中，該突變體缺失轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，或其中將1，3_丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶再激活因子編碼基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。


圖1為示意圖，其示出了產(chǎn)生1，3-丙二醇的還原途徑和丙三醇代謝過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化途徑。圖2示出了使用dha調(diào)節(jié)子的結(jié)構(gòu)制備根據(jù)本發(fā)明的突變體的方法。圖3示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，其中質(zhì)粒DNA用于制備根據(jù)本發(fā)明的AK菌株， 并包含以下連接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動(dòng)子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因_ DhaK基因氨基端(dhaK，)。圖4示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，其中質(zhì)粒DNA用于制備根據(jù)本發(fā)明的AR菌株， 并包含以下連接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動(dòng)子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因_ DhaR基因氨基端(dhaR，)。圖5示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA包含IacZ啟動(dòng)子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因和DhaB再激活酶基因。圖6示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA只包含IacZ啟動(dòng)子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因。圖7示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA包含IacZ啟動(dòng)子下游的1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD(E)基因(源于大腸桿菌)和DhaB再激活酶基因。圖8示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA只包含IacZ啟動(dòng)子下游的1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD (E)基因(源于大腸桿菌)。圖9示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA包含IacZ啟動(dòng)子下游的1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD(K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)和DhaB再激活酶基因。圖10示出了構(gòu)建質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA只包含IacZ啟動(dòng)子下游的 1，3-丙二醇氧化還原酶活性YqhD(K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)。圖11是一組示出了培養(yǎng)液組分的圖表，所述培養(yǎng)液在本發(fā)明中使用的重組菌株的一步培養(yǎng)后獲得。圖12是一組示出了殘留丙三醇濃度和培養(yǎng)液中產(chǎn)生的1，3-丙二醇濃度的圖表， 所述培養(yǎng)液在本發(fā)明中使用的重組菌株的第二步培養(yǎng)后獲得。圖13示出了根據(jù)丙三醇濃度的本發(fā)明中使用的重組菌株的培養(yǎng)特征。圖14示出了本發(fā)明中使用的重組菌株根據(jù)吹氣速率的培養(yǎng)特征。圖15示出了本發(fā)明中使用的重組菌株根據(jù)PH的培養(yǎng)特征特征。圖16示出了本發(fā)明中使用的重組菌株根據(jù)微生物細(xì)胞數(shù)量的培養(yǎng)特征。通過以下的詳細(xì)描述和附屬的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方案將更清楚明白。
具體實(shí)施例方式
一方面，本發(fā)明針對(duì)通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，在所述微生物突變體中，轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因或二羥基丙酮激酶編碼基因被缺失或被失活，并且該微生物能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3"丙二醇，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二丙三醇代謝途徑由兩個(gè)代謝途徑組成氧化代謝途徑和還原代謝途徑(圖1)。在氧化代謝過程中，NAD+依賴型丙三醇脫氫酶將丙三醇氧化為二羥基丙酮(DHA)，同時(shí)產(chǎn)生 NADH，然后其被DHA激酶轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮磷酸(DHAP)。通過糖酵解使二羥基丙酮磷酸 (DHAP)代謝同時(shí)用作生長所需的碳源和能源。在氧化代謝過程中，產(chǎn)生包括2，3-丁二醇、 乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸的副產(chǎn)物。同時(shí)，在還原代謝過程中，通過脫水酶的作用將丙三醇轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛，然后通過NADH-依賴型氧化還原酶的作用還原為1，3-丙二醇，同時(shí)形成NAD+。在本發(fā)明中，培養(yǎng)的產(chǎn)生1，3-丙二醇的突變體是微生物菌株，其中丙三醇代謝過程的氧化途徑涉及的基因編碼蛋白被缺失或被失活，且其只通過還原途徑只產(chǎn)生1，3-丙二醇，不產(chǎn)生包括2，3 - 丁二醇、乙醇、乳酸和琥珀酸的副產(chǎn)物。丙三醇的氧化和還原代謝途徑相互聯(lián)系緊密以維持細(xì)胞中NAD+-NADH的平衡，且將編碼四種酶(即丙三醇脫水酶(dhaB)、l，3-丙二醇還原酶(dhaT)、丙三醇脫氫酶(dhaD) 和二羥基丙酮激酶(dhaK))的基因集群地排列在染色體上并通過共存的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因 DhaR在相同的調(diào)節(jié)子中調(diào)控。在本發(fā)明中，能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇的微生物可能是選自檸檬酸細(xì)菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和乳桿菌屬的菌株。優(yōu)選地，本發(fā)明使用的是肺炎克雷伯氏菌。本發(fā)明中使用的突變微生物是肺炎克雷伯氏菌，所述轉(zhuǎn)錄激活因子基因優(yōu)選為 DhaR,并且所述二羥基丙酮激酶基因優(yōu)選選自DhaK、DhaL, DhaM和DhaK’。在本發(fā)明中，所述突變體丙三醇氧化途徑涉及的蛋白優(yōu)選為丙三醇脫氫酶、轉(zhuǎn)錄激活因子和二羥基丙酮激酶。以下列方式構(gòu)建本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中使用的重組微生物且其中丙三醇氧化途徑被阻斷。通過刪除肺炎克雷伯氏菌株染色體中的丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因 (DhaBA2)構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)。用重組載體轉(zhuǎn)化突變體，該重組載體包含1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，這些基因涉及丙三醇還原途徑，從而恢復(fù)還原途徑。因此，構(gòu)建了只缺失1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)的突變體(圖2)。因此，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中使用的突變體的特征在于，丙三醇脫氫酶基因 (DhaD)和轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)被缺失或被失活。在該過程中，將IacZ啟動(dòng)子(Plaez)插入到涉及還原途徑的基因上游，以使所述基因不受DhaR調(diào)節(jié)子的調(diào)控，由此使用誘導(dǎo)物人工控制所述基因的表達(dá)。
以下列方式構(gòu)建本發(fā)明另一實(shí)施方案中使用的重組微生物且其中丙三醇氧化途徑被阻斷。通過刪除肺炎克雷伯氏菌株染色體中的轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌突變體(AR菌株)。用重組載體轉(zhuǎn)化突變體，所述重組載體包含1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶激活因子II基因(DhaBA2)，這些基因涉及丙三醇的還原途徑，從而恢復(fù)所述還原途徑。因此，構(gòu)建了只缺失轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)的突變體(圖 2)。因此，本發(fā)明另一實(shí)施方案中使用的突變體的特征在于，轉(zhuǎn)錄激活因子基因 (DhaR)被缺失或被失活。另一方面，本發(fā)明針對(duì)通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)中，所述突變體缺失丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)，或其中將1，3_丙二醇氧化還原酶編碼基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄激活因子基因 (DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌和轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌在含有丙三醇的培養(yǎng)基中產(chǎn)生1，3-丙二醇，且除了少量的乙酸外不產(chǎn)生氧化途徑的副產(chǎn)物，但是其產(chǎn)生1，3-丙二醇的能力低于野生型親代菌株產(chǎn)生1，3-丙二醇的能力。為了克服這個(gè)問題，在無丙三醇培養(yǎng)基中先培養(yǎng)重組菌株以使微生物細(xì)胞生長并在含有丙三醇的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)該重組菌株可產(chǎn)生高產(chǎn)量的1，3-丙二醇，且不產(chǎn)生副產(chǎn)物。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)兩步法培養(yǎng)肺炎克雷伯氏菌Cu菌株時(shí)，丙三醇到 1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率為35% (mol/mol)，然而，兩步法培養(yǎng)重組菌株時(shí)，丙三醇到1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率為70% (mol/mol)，其明顯提高。在本發(fā)明兩步法培養(yǎng)中，優(yōu)選添加的丙三醇的濃度為5-50 g/L，更優(yōu)選的為5-20 g/L，最優(yōu)選為10 g/L。本發(fā)明一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)吹氣速率為0 vvm時(shí)，消耗很少的丙三醇或不消耗丙三醇，且吹氣速率為0. 2 vvm.O. 5 vvm和1. 0 vvm時(shí)，丙三醇的消耗率與1，3-丙二醇的產(chǎn)量相似。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)至培養(yǎng)結(jié)束培養(yǎng)基的PH值分別維持在5、6、7和8 時(shí)，PH值為6的1，3-丙二醇的產(chǎn)量最高。而且，指示菌株生長程度的0D_值分別達(dá)到0、 0. 5、1、2和3時(shí)，添加丙三醇至終濃度為20 g/L。在這種情況下，如圖12所示，OD600值越高，1，3-丙二醇的產(chǎn)量越高。為了制備本發(fā)明一實(shí)施方案中使用的突變體，通過同源重組方法使用質(zhì)粒DNA消除(cured)的肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株(在下文中稱為“Cu”)作為親代菌株，將DhaB 酶再激活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)基因和dha調(diào)節(jié)子的DhaD基因替換為阿泊拉霉素抗性基因，從而制備了丙三醇氧化和還原途徑均缺失的重組菌株(在下文中稱為“AK”菌株)。 為了恢復(fù)AK菌株的丙三醇還原途徑，制備用于恢復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒DNA。通過擴(kuò)增DhaB再激活酶基因(orfW)-orfX DNA片段和1，3-丙二醇氧化還原酶活性基因dhaT或 YQhD (源于大腸桿菌)或yqhD同源基因(源于肺炎克雷伯氏菌)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物插入到 pGEM TEasy載體的IacZ啟動(dòng)子下游而制備質(zhì)粒DNA。因此，用于恢復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒DNA將AK菌株轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生1，3-丙二醇的重組菌株。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)丙三醇脫氫酶基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄激活因子基因 (DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌和轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)缺失的肺炎克雷伯氏菌在含有丙三醇的培養(yǎng)基中產(chǎn)生1，3-丙二醇，且除了少量的乙酸外不產(chǎn)生氧化途徑的副產(chǎn)物。為了制備本發(fā)明一實(shí)施方案中使用的突變體，通過同源重組方法使用質(zhì)粒DNA消除的肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株(在下文中稱為“Cu”)作為親代菌株，將dha調(diào)節(jié)子的 DhaB酶再激活因子、DhaT基因和DhaR調(diào)節(jié)基因替換為阿泊拉霉素抗性基因，從而制備了丙三醇氧化和還原途徑均缺失的重組菌株(在下文中稱為“AR”菌株)。為了恢復(fù)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中制備的AR菌株的丙三醇還原途徑，用于恢復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒DNA將 AK菌株轉(zhuǎn)化為重組菌株，該重組菌株能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇且不產(chǎn)生副產(chǎn)物。使用常規(guī)的分離技術(shù)從突變體的培養(yǎng)液中回收1，3-丙二醇，所述分離技術(shù)例如， 蒸餾、電滲析法、蒸發(fā)、色譜法、溶劑萃取、反應(yīng)萃取，且這些技術(shù)在分離高純物質(zhì)時(shí)一般可結(jié)合使用。本文中所使用的術(shù)語基因“缺失”是指基因從染色體或質(zhì)粒中被刪除的狀態(tài)，以使該基因編碼的蛋白質(zhì)不能產(chǎn)生。術(shù)語基因“失活”是指基因處于插入、易位或部分刪除的狀態(tài)，以使該基因編碼的蛋白質(zhì)不能產(chǎn)生。使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)基因操作方法將基因插入宿主細(xì)胞的染色體中。例如，可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體、痘病毒載體、慢病毒載體和非病毒載體進(jìn)行基因插入。
實(shí)施例在下文中，本發(fā)明將參照具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在以下實(shí)施例中，制備了肺炎雷伯氏菌菌株的丙三醇氧化和還原途徑均阻斷的突變體，并且再次恢復(fù)了丙三醇還原途徑，從而制備能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇而沒有副產(chǎn)物的突變體。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可通過阻斷微生物的丙三醇氧化途徑而制備能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇而沒有副產(chǎn)物的突變體，所述微生物能夠從丙三醇產(chǎn)生1，3-丙二醇，并且培養(yǎng)這種突變體能帶來相同的結(jié)果。同樣，在以下實(shí)施例中，用含有涉及丙三醇還原途徑的基因的載體轉(zhuǎn)化的菌株，去恢復(fù)丙三醇氧化和還原途徑均阻斷的突變體菌株的丙三醇還原途徑。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，使用常規(guī)插入方法將丙三醇還原途徑的基因插入到突變體的染色體中，從而獲得的菌株能夠帶來相同的結(jié)果。實(shí)施例1:制備丙三醇氧化和還原代謝途徑均被阻斷的重組菌株
為了重新設(shè)計(jì)丙三醇代謝途徑，制備了重組菌株(AK和AR)，其中在肺炎克雷伯氏菌 MGH 78578 (ATCC 700721)中的丙三醇代謝途徑完全被阻斷。使用質(zhì)粒DNA消除的肺炎克雷伯氏菌MGH 78578菌株(取名為"Cu")作為親代菌株，利用同源重組方法，將DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)基因和dha調(diào)節(jié)子的DhaD基因替換為阿泊拉霉素抗性基因(圖2)，從而制備丙三醇氧化和還原途徑均缺失的重組菌株AK。與此同時(shí)，通過使用阿泊拉霉素抗性基因替代DhaB酶再激活因子、DhaT基因和DhaR調(diào)節(jié)基因來制備重組菌株AR。此處，使用人工可控制的IacZ啟動(dòng)子替代DhaB 基因上游的DhaR依賴型啟動(dòng)子。無抗生素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)幾次肺炎克雷伯氏菌MGH 78578，之后從培養(yǎng)液中選擇菌落接種到含有或不含四環(huán)素的培養(yǎng)基中。從菌落中選擇由于缺失質(zhì)粒DNA不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長的菌落并取名為“肺炎克雷伯氏菌MGH78578 Cu”。將選擇的菌落用于制備重組菌株的親代菌株。使用肺炎克雷伯氏菌MGH78578菌株的染色體DNA作為模板，并使用以下引物，通過PCR擴(kuò)增用于制備同源重組的質(zhì)粒的DNA片段(圖2)。用于擴(kuò)增dhaBI基因片段的引物
SEQ ID NO: 1: 5，-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3， (dhaBI XbaI_480bpF) SEQ ID NO: 2: 5，-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3， (dhaBI BamHI-480bpR) 用于擴(kuò)增dhaK基因片段的引物
SEQ ID NO: 3: 5，-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3， (dhaK HindII1-200-700 bpF) SEQ ID NO: 4: 5，-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3， (dhaK BglII-200_700bpR) 用于擴(kuò)增dhaR基因片段的引物
SEQ ID NO: 5: 5，-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3， (dhaR bglII-200_700bpF) SEQ ID NO: 6: 5，-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3， (dhaR HindIII-200_700bpR) 用于擴(kuò)增Apr基因片段的引物
SEQ ID NO: 7: 5，-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3’ Apr HpaI F SEQ ID NO: 8: 5’-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3’ Apr HindIII-BglIIR 將擴(kuò)增的DNA片段克隆到pGEM TCasy載體中并測序。然后，如圖3和圖4所示，使用所述載體構(gòu)建了質(zhì)粒DNAs。在如圖3所示的方法中，構(gòu)建用于制備AK菌株的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA包含以下連接構(gòu)建DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動(dòng)子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因-DhaK 基因氨基端(dhaK’)。在如圖4所示的方法中，構(gòu)建用于制備AR菌株的質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒 DNA包含以下連接DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ啟動(dòng)子(Plaez)-阿泊拉霉素抗性基因-DhaR基因氨基端(dhaR')。用BamHI-Bgl II處理各質(zhì)粒，并且收集的DNA片段通過電穿孔法引入到肺炎克雷伯氏菌Cu菌株中。然后，從Cu菌株細(xì)胞中分離在補(bǔ)充添加阿泊拉霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的重組菌株。從而，獲得了缺失DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)基因和dha 調(diào)節(jié)子的DhaD基因并且插入IacZ啟動(dòng)子和阿泊拉霉素抗性基因的重組菌株AK，以及缺失 DhaB酶再激活因子、DhaT基因、DhaR調(diào)節(jié)基因并插入IacZ啟動(dòng)子和阿泊拉霉素抗性基因的重組菌株AR。實(shí)施例2:制備恢復(fù)丙三醇還原途徑的菌株 (1)制備用于恢復(fù)丙三醇還原途徑的質(zhì)粒DNA
使用以下示出的引物序列擴(kuò)增DhaB再激活酶基因(OrfW)-OrfX DNA片段和1，3 -丙二醇氧化還原酶活性基因dhaT或yqhD (源于大腸桿菌)或yqhD同源基因(源于肺炎克雷伯氏菌)。將擴(kuò)增的所述基因克隆到PGEM TEasy載體中并測序。然后，如圖5所示，使用所述載體制備質(zhì)粒DNA。SEQ ID NO: 95' -AGATCTATGAGCTATCGTATGTTTGA-3' (dhaT-Bglll F) SEQ ID NO: 10 :5’-CTCGAGAAGCTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-
3， (dhaT-Hindlll/XhoI R)
SEQ ID NO: 11:5，-AGATCTATGAACAACTTTAATCTGCAC-3， (yqhD-BglII F)
SEQ ID NO: 12: 5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3， (yqhD-HindIII/Xhol R)
SEQ ID NO: 13: 5，-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3， (yqhD Kle BglII F) SEQ ID NO: 14: 5’-CTCGAGAAGCTTAGCGTGCAGCCTCGTAAAT-3’ (yqhD Kle HindIII， XhoI R)
圖5和6既示出了構(gòu)建含有IacZ啟動(dòng)子下游的肺炎克雷伯氏菌的DhaT基因和DhaB 再激活酶基因的質(zhì)粒DNA的過程，也示出了構(gòu)建僅含有IacZ啟動(dòng)子下游DhaT基因的質(zhì)粒 DNA的過程。圖7和8既示出了構(gòu)建含有1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD(E)基因(源于大腸桿菌)和IacZ啟動(dòng)子下游的DhaB激活酶基因的質(zhì)粒DNA的過程，也示出了僅含有 IacZ啟動(dòng)子下游YqhD(E)基因的質(zhì)粒DNA的過程。圖9和10既示出了構(gòu)建含有1，3_丙二醇氧化還原酶活性YqhD (K)基因(源于肺炎克雷伯氏菌)和IacZ啟動(dòng)子下游DhaB再激活酶基因的質(zhì)粒DNA的過程，也示出了僅含有IacZ啟動(dòng)子下游YqhD(K)基因的質(zhì)粒DNA 的過程。(2)制備恢復(fù)丙三醇還原途徑的重組菌株
以上構(gòu)建的六種質(zhì)粒DNAs的每一種含有基因編碼1，3-丙二醇氧化還原活性酶，并通過電穿孔法將含有PBR322和DhaB再激活酶基因的質(zhì)粒DNAs引入到每個(gè)AK和AR菌株中， 其中所述菌株的丙三醇厭氧代謝途徑被阻斷，從而制備了恢復(fù)丙三醇還原途徑的重組菌株 (表1)。在重組菌株中，引入到親代菌株Cu中的每個(gè)質(zhì)粒被作為對(duì)照。在該實(shí)施例中構(gòu)建的重組菌株保藏在韓國生命工學(xué)研究院生物資源中心(表2)。表1 本發(fā)明中使用的或構(gòu)建的重組菌株和質(zhì)粒DNAs
權(quán)利要求
1.一種通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其中在所述微生物突變體中， 轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因或二羥基丙酮激酶編碼基因被缺失或被失活，并且該微生物能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇的微生物選自檸檬酸細(xì)菌屬(以trobac ter)、梭狀芽胞桿菌屬ipios iridium)、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬{Klebsiella)禾口乳桿菌屬 Hactobacillus)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中微生物突變體中丙三醇脫氫酶-編碼基因缺失或失活。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇的微生物是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella / ^腫twiae)，所述轉(zhuǎn)錄激活因子編碼基因是DhaR，且二羥基丙酮激酶編碼基因選自DhaK、DhaL, DhaM和DhaK'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物突變體中丙三醇脫氫酶編碼基因(DhaD)和轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)被缺失或被失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物突變體中轉(zhuǎn)錄激活因子基因 (DhaR)被缺失或被失活。
7.—種通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)中，該突變體的丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II 基因(DhaBA》被缺失，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3_丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇濃度為5-50g/L。
9.一種通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶激活因子編碼基因的載體引入到肺炎克雷伯氏菌突變體(AK菌株)中，該突變體的丙三醇脫氫酶基因(DhaD)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因 (DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶激活因子編碼基因插入到突變體(AK菌株)的染色體中， 所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇濃度為5-50g/L。
11.一種通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因的載體引入肺炎克雷伯氏菌突變體(AR菌株)中，該突變體的轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3_丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇濃度為5-50g/L。
13.—種通過培養(yǎng)微生物突變體生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，所述微生物突變體能夠使用丙三醇作為碳源產(chǎn)生1，3-丙二醇，且其中將含有1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶再激活因子編碼基因的載體引入肺炎克雷伯氏菌突變體(AR菌株)中，該突變體的轉(zhuǎn)錄激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化還原酶基因(DhaT)和丙三醇脫水酶再激活因子II基因(DhaBA2)被缺失，或其中將1，3-丙二醇氧化還原酶編碼基因和丙三醇脫水酶激活因子編碼基因插入到突變體(AR菌株)的染色體中，所述方法包括以下步驟(a)在無丙三醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物突變體以使微生物菌株的細(xì)胞生長；(b)將丙三醇添加到微生物細(xì)胞生長的培養(yǎng)液中，并進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生1，3-丙二醇；及(c)回收產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述添加的丙三醇濃度為5-50g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)丙三醇氧化途徑阻斷的重組菌株生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，更特別的是涉及通過重組菌株的兩步法培養(yǎng)生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，所述重組菌株中在丙三醇代謝途徑中產(chǎn)生副產(chǎn)物的氧化代謝途徑被阻斷。兩步法培養(yǎng)產(chǎn)生副產(chǎn)物的丙三醇氧化途徑被阻斷的重組菌株，可產(chǎn)生增加產(chǎn)量的1,3-丙二醇，且不產(chǎn)生增加純化成本的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102388141SQ200980156240
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者吳白祿, 崔珉鎬, 徐正又, 徐美渶, 許仙宴, 金哲鎬 申請(qǐng)人:韓國生命工學(xué)研究院