一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌及生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于農(nóng)藥殘留降解的復(fù)合菌菌劑及其生產(chǎn)方法，屬于環(huán)境微生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，復(fù)合菌由如下菌種組成：枯草芽孢桿菌30-40%、地衣芽孢桿菌30-40%、放線菌10-20%、反硝化細(xì)菌10-20%、光合細(xì)菌10-20%，具體產(chǎn)品中各微生物組合總數(shù)為100%.產(chǎn)品性狀為液體或固體；所述的農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，包括一級(jí)種子液的制備，二級(jí)種子液發(fā)酵，生產(chǎn)液發(fā)酵，單獨(dú)發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液罐步驟；所使用的微生物以異養(yǎng)菌為主，能夠產(chǎn)生生物活性酶。
【專利說(shuō)明】一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌及生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于應(yīng)用生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種農(nóng)藥殘留降解的微生物復(fù)合菌及其生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)環(huán)境的主要有機(jī)污染物全國(guó)每年使用的農(nóng)藥量達(dá)50萬(wàn)-60萬(wàn)t，使用農(nóng)藥的土地面積在2.8億hm2以上，農(nóng)田平均施用農(nóng)藥13.9 kg/hm2。直接進(jìn)入土壤的農(nóng)藥，大部分可被土壤吸附，殘留于土壤中的農(nóng)藥，由于生物和非生物的作用，形成具有不同穩(wěn)定性的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物無(wú)機(jī)物。噴施于作物體上的農(nóng)藥，除部分被植物吸收或逸入大氣外，約有1/2左右散落于農(nóng)田，又與直接施用于田間的農(nóng)藥構(gòu)成農(nóng)田土壤中農(nóng)藥的基本來(lái)源。農(nóng)作物從土壤中吸收農(nóng)藥，在植物根、莖、葉、果實(shí)和種子中積累，通過(guò)食物、飼料危害人體和牲畜的健康。截止2011年底，全國(guó)受污染的耕地約有1000萬(wàn)hm2，有機(jī)污染物污染農(nóng)田達(dá)3600萬(wàn)hm2，主要農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)率高達(dá)16%-20%;這些農(nóng)藥殘留廣泛分布于土壤、水體、大氣及農(nóng)產(chǎn)品中，難以利用大規(guī)模的工程措施消除污染。實(shí)際上，在自然界主要依靠微生物緩慢地進(jìn)行降解，這是依靠自然力量、不產(chǎn)生二次污染的理想途徑。但自然環(huán)境復(fù)雜，單位面積內(nèi)菌種的含量低，農(nóng)藥生物降解的效率低和時(shí)間漫長(zhǎng)，因此，加強(qiáng)農(nóng)藥的生物降解研究、解決農(nóng)藥對(duì)環(huán)境及食物的污染問(wèn)題，是人類當(dāng)前迫切需要解決的課題之一。
[0003]
本發(fā)明的目的是提供一種含多種微生物細(xì)菌的農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌。
[0004]微生物降解農(nóng)藥的過(guò)程就是通過(guò)微生物各種代謝途徑把有機(jī)農(nóng)藥完全礦化或降解成無(wú)毒的其他成分，人工構(gòu)建單位面積“工程菌”的種類和細(xì)菌含量，為微生物細(xì)菌降解農(nóng)藥提供必要的條件。
[0005]微生物細(xì)菌降解農(nóng)藥的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，化合物通過(guò)一定的方式進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，然后在各種酶的作用下，經(jīng)過(guò)一系列的生理生化反應(yīng)，最終將農(nóng)藥完全降解或分解成分子量較小的無(wú)毒或毒性較小的化合物的過(guò)程。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)表明，如莠去津作為假單胞菌ADP菌株的唯一碳源，有3種酶參與了降解莠去津的前幾步反應(yīng)。第一種酶是A tzA，催化莠去津水解脫氯的反應(yīng)，得到無(wú)毒的羥基莠去津，此酶是莠去津生物降解的關(guān)鍵酶；第二種酶是AtzB，催化羥基莠去津脫氯氨基反應(yīng)，產(chǎn)生N—異丙基氰尿酰胺；第三種酶是A tzC，催化N —異丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和異丙胺。最終莠去津被降解為C02和NH3。微生物所產(chǎn)生的酶系，有的是組成酶系，如門多薩假單胞菌DR — 8對(duì)甲單脒農(nóng)藥的降解代謝，產(chǎn)生的酶主要分布于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜 組分；有的是誘導(dǎo)酶系，由于降解酶往往比產(chǎn)生該類酶的微生物菌體更能忍受異
常環(huán)境條件，酶的降解效率遠(yuǎn)高于微生物本身，特別是對(duì)低濃度的農(nóng)藥，利用降解酶作
為凈
化農(nóng)藥污染的有效手段?，F(xiàn)在試驗(yàn)已經(jīng)證明，編碼合成這些酶系的基因多數(shù)在質(zhì)粒上，如2，4 一 D農(nóng)藥的生物降解，即由質(zhì)粒攜帶的基因所控制。通過(guò)質(zhì)粒上的基因與染色體上的基因的共同作用，在微生物體內(nèi)把農(nóng)藥降解。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述農(nóng)藥殘留降解微生物復(fù)合菌的生產(chǎn)方法。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的:
一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌，該復(fù)合菌各組分微生物在微生物總質(zhì)量中的質(zhì)量百分比為:枯草芽孢菌30~40%，地衣芽孢桿菌30~40%，放線菌10~20%，反硝化細(xì)菌10~20%，光合細(xì)菌10~20%。具體產(chǎn)品中所述個(gè)微生物組分之和為100%。
[0008]上述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌，每克或沒(méi)ml該微生物復(fù)合菌中菌含量不低于
6.0X IO8CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶海量不低于200U.上述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，該方法是將各組分微生物分別培養(yǎng)再按一定比例混合制成微生物復(fù)合菌
所述的農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，包括下述步驟:
a.一級(jí)種子液的制備:分別將活化的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產(chǎn)堿桿菌菌種接種到無(wú)菌的Ph7.0~7.5的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，放線菌接種在滅菌的淀粉液體培養(yǎng)基中，30 ~37
0C，150~200rpm，過(guò)夜培養(yǎng)；光合細(xì)菌在光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，30~37°C，光照培養(yǎng)4~7
天，光照強(qiáng)度1000~2000LX，獲得各菌種的一級(jí)種子液；
b.二級(jí)種子液發(fā)酵:分別將步驟a所培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產(chǎn)堿桿菌、放線菌一級(jí)種子液按發(fā)酵罐體積10~15%的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)基同步驟a所用，30~37°C，150~200rpm，通入經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾的過(guò)濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積0.5-1倍/min,壓力在0.1~IMPa,發(fā)酵12~18小時(shí)；
c.生產(chǎn)液發(fā)酵:分別將二級(jí)種子液打入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基同步a所用，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30~37°C，150~200rpm，通入經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾的過(guò)濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積0.8-1倍/min，壓力在0.5~1.0MPa,發(fā)酵24~36小時(shí)；光合細(xì)菌直接將一級(jí)種子液接種到透明的裝有光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐體積的8~12%，30~37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強(qiáng)度1000-2000LX ；
d.單獨(dú)發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液罐，按照各組分微生物在微生物總質(zhì)量的質(zhì)量百分比取枯草芽孢桿菌30%~40%，地衣芽孢桿菌30%~40%，放線菌10~20%，反硝化細(xì)菌10~20%，光合細(xì)菌10~20%混合制成液體微生物復(fù)合菌劑；
所述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，步驟d中液體微生物復(fù)合菌劑的菌含量 不低于6.0X108CFU/ml，蛋白酶活性不低于300U/ml，淀粉酶海量不低于200U/ml。
[0009]本發(fā)明有益效果:
采用本發(fā)明獲得農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌有以下優(yōu)點(diǎn):
I)所使用的微生物能夠產(chǎn)生生物活性酶
通過(guò)現(xiàn)代微生物分離技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和酶工程技術(shù)篩選能過(guò)產(chǎn)生蛋白酶、淀粉
酶 的菌株作為農(nóng)藥殘留降解微生物復(fù)合菌的目的菌，這些菌能夠產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶.蛋白酶的含量不低于300U/g或者300U/ml，淀粉酶不低于200U/g或者200U/ml.這些酶能夠有效的對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生酶促反應(yīng)2)所使用的微生物以異養(yǎng)菌為主
不同的微生物繁殖方式和吸取營(yíng)養(yǎng)的途徑不同，就直接導(dǎo)致它們的繁殖速度不同，差異十分巨大，所選微生物為異養(yǎng)菌，因此進(jìn)入環(huán)境后，只要營(yíng)養(yǎng)充足就能快速繁殖，通過(guò)人工投放以后能迅速形成優(yōu)勢(shì)菌群。
[0010]3)所使用的微生物還能產(chǎn)生抗生素樣物質(zhì)
所選用的微 生物如芽孢桿菌、放線菌能產(chǎn)生抗生素樣物質(zhì)，對(duì)致病菌有抑制作用，從而減少其它致病菌在土壤.農(nóng)作物.水體和空氣中的繁殖數(shù)量
4)所選用的微生物為多種微生物的混合體，它們具有較強(qiáng)的針對(duì)性和組合能力，在載體中不互相排斥，在環(huán)境中相互協(xié)調(diào)，效果明顯提高。使用時(shí)不需要復(fù)雜的工程.工藝，對(duì)作物和土壤噴霧方式施用，使用方便
本發(fā)明所選用的菌株特性及功能如下:
I)枯草芽孢桿菌:能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶以及枯草桿菌素。
[0011]2)地衣芽孢桿:細(xì)菌的繁殖充分的利用土壤和空氣中的氮.磷.氨氮.硫化氫等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，耐高溫，同時(shí)能產(chǎn)生蛋白酶、桿菌肽等。
[0012]3)放線菌:充分的利用糞便.污水和空氣中的氮.磷.氨氮.硫化氫等作為自身繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)能夠生長(zhǎng)抗生素類物質(zhì)，抑制其它致病菌的生長(zhǎng)繁殖，但對(duì)其它五種菌不會(huì)產(chǎn)生抑制作用
4)反硝化產(chǎn)堿桿菌:通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，該菌種對(duì)六六六農(nóng)藥有降解作用，而六六六農(nóng)藥的自然降解需要三十年時(shí)間，而通過(guò)人工在單位面積制造工程菌，提高單位面積菌種的含量，就會(huì)加速農(nóng)藥的降解
5)光合細(xì)菌:能利用糞便尿液中的氨氮.硫化氫等作為自身繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而有效降解糞便.尿液和空氣中的氨氮、硫化氫等惡臭氣體
6)所選菌種屬于農(nóng)業(yè)部318公告范圍，對(duì)人.畜，農(nóng)作物和環(huán)境沒(méi)有傷害，沒(méi)有二次污
染
7)以上菌種均可以市購(gòu)或從各保藏單位獲得 復(fù)合菌的【具體實(shí)施方式】
一。施用時(shí)間:
1.在施用農(nóng)藥一周后，復(fù)合菌按照1:5的比例稀釋，然后用噴霧器對(duì)作物和土壤進(jìn)行均勻噴霧。每畝復(fù)合菌用量在五公斤
2.在農(nóng)作物收獲后，土地整理后，對(duì)土壤進(jìn)行噴灑，畝用三公斤復(fù)合菌
3.在冬季溫度低于10度或夏天室外氣溫達(dá)到40度時(shí)，不能施用菌種
4.全年施用復(fù)合菌畝用8公斤，在農(nóng)藥殘留較重的區(qū)域可以加大用量 實(shí)施案例:
1.實(shí)施地點(diǎn):四川省都江堰市
2.用戶情況介紹:都江堰市獼猴桃種植戶
作為都江堰市特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，獼猴桃產(chǎn)業(yè)也成為了農(nóng)戶增收致富的一個(gè)重要途徑。目前，都江堰市共有獼猴桃種植面積約12萬(wàn)畝，掛果面積近7萬(wàn)畝，2011年產(chǎn)量達(dá)2.65萬(wàn)噸，產(chǎn)值超過(guò)2億元。全市已有10家專業(yè)從事獼猴桃生產(chǎn)和銷售的企業(yè)，12家獼猴桃專合組織，并建設(shè)了獼猴桃氣調(diào)保鮮庫(kù)近I萬(wàn)噸，一般性冷藏庫(kù)約5000噸，有效增加了獼猴桃產(chǎn)業(yè)附加值，延長(zhǎng)了產(chǎn)業(yè)鏈條。成功入選2008“奧運(yùn)推薦果品”，遠(yuǎn)銷日本、韓國(guó)、美國(guó)、歐盟等十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。都江堰也發(fā)展成為了全國(guó)最大的海沃特獼猴桃生產(chǎn)出口基地
為了保護(hù)都江堰獼猴桃品牌形象，都江堰市還制定并實(shí)施了《都江堰獼猴桃品牌保護(hù)工作方案》，即統(tǒng)一生產(chǎn)管理技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)；已有四個(gè)專業(yè)合作社進(jìn)行了有機(jī)食品認(rèn)證。
[0013]3.實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò):
通過(guò)市科技局科技計(jì)劃立項(xiàng)，2011年開始，獼猴桃協(xié)會(huì)組織三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的部分種植戶農(nóng)藥殘留降解實(shí)驗(yàn)，通過(guò)市土肥站的每次使用后監(jiān)測(cè)，通過(guò)使用復(fù)合菌以后，在使用農(nóng)藥后的七天使用后，在經(jīng)過(guò)五天左右(視天氣情況)，在作物表面基本上檢測(cè)不到藥物殘留。特別是在獼猴桃采摘前一個(gè)月，復(fù)合菌按照1:10的比例稀釋，對(duì)獼猴桃果子噴霧，完全降解了獼猴桃表面因空氣污染造成的藥物殘留，并對(duì)預(yù)防細(xì)菌性病變有很好的防止效果。
[0014]通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明復(fù)合菌在農(nóng)藥殘留降解方面技術(shù)的可靠性。
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌，其特征在于該復(fù)合菌各組微生物在微生物總質(zhì)量中的質(zhì)量百分比為:枯草芽孢桿菌30%~40%，地衣芽孢桿菌30%~40%，放線菌10%~20%，反硝化細(xì)菌10%~20%，光合細(xì)菌10%~20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌，其特征在于每克或每ml該微生物復(fù)合菌中菌含量不低于8.0X 108CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶含量不低于150U。
3.如權(quán)利要求1或2所述的農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，其特征在于該方法是將各組微生物分別培養(yǎng)再按一定比例混合制成微生物復(fù)合菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，其特征在于它包含下述步驟:
a.一級(jí)種子液的制備:分別將活化的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產(chǎn)堿桿菌菌種接種到無(wú)菌的PH7.0-7.5的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，放線菌接種在滅菌的淀粉液體培養(yǎng)基中，3(T37°C，150-200rpm，過(guò)夜培養(yǎng)；光合細(xì)菌在光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，30-37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強(qiáng)度1000-2000LX ;獲得各菌種的一級(jí)種子液；
b.二級(jí)種子液發(fā)酵:分別將步驟a所培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、反硝化產(chǎn)堿桿菌、放線菌一級(jí)種子液按發(fā)酵罐體積10-15%的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)基同步驟a所用，30^370C，150-200rpm，通入經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾的過(guò)濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積的0.5-1倍min，壓力0.1~1MPa，發(fā)酵12~18小時(shí)；
c.生產(chǎn)液發(fā)酵:分別將二級(jí)種子液打入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基同步驟所用，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30^37 0C，150-200rpm，通入經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾的過(guò)濾空氣，通氣量為發(fā)酵罐體積的0.8-1倍min，壓力0.5~1.0MPa,發(fā)酵24~36小時(shí)；光合細(xì)菌直接將一級(jí)種子液接種到透明的裝有光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐體積的8-12%，30~37°C，光照培養(yǎng)4-7天，光照強(qiáng)度1000-2000LX ； d.單獨(dú)發(fā)酵完成后將發(fā)酵液裝入貯液獾，按照各組分微生物在微生物總質(zhì)量中質(zhì)量百分比取枯草芽孢桿菌30~40%，地衣芽孢桿菌30~40%，放線菌10~20%，反硝化細(xì)菌10~20%，光合細(xì)菌10-20%混合制成液微生物復(fù)合菌； 或者將單獨(dú)發(fā)酵的發(fā)酵液通過(guò)離心或者加載體吸附，形成固體，按照各組分微生物在微生物總質(zhì)量中的質(zhì)量百分比取枯草芽孢桿菌30-40%，地衣芽孢桿菌30-40%，放線菌10~20%，反硝化細(xì)菌10~20%，光合細(xì)菌10~20%混合制成固體微生物復(fù)合菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種農(nóng)藥殘留降解復(fù)合菌的制備方法，，其特征在于步驟d中液體微生物復(fù)合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / ml，淀粉酶含量不低于200U / ml ;固體微生物復(fù)合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / g，蛋白酶活性不低于300U / g，蛋白酶含量不低于200 U/ml。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103966113SQ201310033585
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月29日
【發(fā)明者】李朝均 申請(qǐng)人:都江堰惠農(nóng)生物技術(shù)有限責(zé)任公司