產(chǎn)l-精氨酸的基因工程菌的構(gòu)建方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-精氨酸的基因工程菌的構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明公開(kāi)了一種新的生產(chǎn)L-精氨酸的基因工程菌菌株，為重組質(zhì)粒pXMJ19-argH先后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌和營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78中，然后將含重組質(zhì)粒的AN78中精氨酸琥珀酸酶過(guò)表達(dá)并且發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了上述工程菌的構(gòu)建方法及其用途?？梢岳帽景l(fā)明構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)L-精氨酸，提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】產(chǎn)L-精氨酸的基因工程菌的構(gòu)建方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及生產(chǎn)L-精氨酸的基因工程菌，其構(gòu)建方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]L-精氨酸(L-argnine，簡(jiǎn)稱L-Arg)是一種含有胍基的堿性氨基酸，是人體代謝的一種重要氨基酸，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝物，在醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等行業(yè)具有廣泛的用途，臨床上，除作為復(fù)方氨基酸輸液的主要組分之一外，L-精氨酸及其鹽類還廣泛用于治療各類肝昏迷忌用谷氨酸鈉者和病毒性肝類谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常者，對(duì)病毒性肝炎療效顯著。對(duì)腸道潰瘍、血栓形成和神經(jīng)衰弱等癥都有治療效果。另外，L-精氨酸是運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)飲料配方的重要組成部分，也是一種重要的飼料添加劑，在世界養(yǎng)殖業(yè)中有廣泛地應(yīng)用。
[0003]近年來(lái)，隨著人民生活水平的逐步提高，人們對(duì)健康方面給于越來(lái)越多的關(guān)注，L-精氨酸的需求量也在逐年上升。目前全世界L-精氨酸年需求量達(dá)15000噸以上，實(shí)際年產(chǎn)量不到8000噸左右，主產(chǎn)地集中在日本和歐洲等國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)目前實(shí)際年產(chǎn)量不到1200噸，產(chǎn)品主要出口到歐美等國(guó)家和地區(qū)，且其需求量每年以15%的速度遞增。
[0004]L-精氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)工藝主要有兩條:即蛋白質(zhì)水解提取技術(shù)工藝；生物發(fā)酵技術(shù)工藝。國(guó)際上著名的大公司如日本味之素、協(xié)和發(fā)酵和德國(guó)迪高沙主要采用生物發(fā)酵和基因工程技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)L-精氨酸產(chǎn)品。
[0005]由于L-精氨酸具有重要的應(yīng)用價(jià)值，國(guó)內(nèi)不少研究者正致力于L-精氨酸的開(kāi)發(fā)研究，如高產(chǎn)菌的選育、工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化等。這些研究的成功將促進(jìn)L-精氨酸水平的提高，有望徹底改變L-精氨酸依賴進(jìn)口的被動(dòng)局面，具有相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0006]L-精氨酸的整個(gè)代謝途徑如圖1.所示。由圖可知，從中間代謝產(chǎn)物谷氨酸到終產(chǎn)物精氨酸的代謝途徑是一個(gè)沒(méi)有分枝的合成途徑，L-精氨酸是合成途徑的最終產(chǎn)物，此段合成途徑有八步反應(yīng)。根據(jù)精氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可知:精氨酸是非支路代謝途徑的終產(chǎn)物，并且精氨酸本身是其合成代謝的調(diào)節(jié)因子，所以精氨酸發(fā)酵不能用阻斷代謝流或選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌種發(fā)酵方法。
[0007] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，它在精氨酸高產(chǎn)菌選育中的應(yīng)用有很多成功的例子。利用DNA重組技術(shù)將精氨酸生物合成有關(guān)的酶基因片段插入質(zhì)粒后再導(dǎo)入精氨酸產(chǎn)生菌，使目的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增，從而增加酶的合成量，提高精氨酸產(chǎn)量。1983年，滕亦等將精氨酸生物合成有關(guān)的基因進(jìn)行克隆。然后將含精氨酸生物合成酶系基因群及卡那霉素抗性基因的重組質(zhì)粒PEArgl導(dǎo)入到宿主谷氨酸棒桿菌ATCC 13032，哈庫(kù)利棒桿菌ATCC13868及黃色短桿菌ATCC 14067中，構(gòu)建精氨酸工程菌，經(jīng)72 h培養(yǎng)精氨酸產(chǎn)量分別為1.6 mg/ml、1.8 mg/ml>l.0 mg/ml。雖然利用基因工程構(gòu)建L-精氨酸高產(chǎn)菌株是一種高效率、理性化的育種手段，但迄今為止，尚未有高產(chǎn)重組菌的報(bào)道。[0008]黃色短桿菌屬于革蘭式陽(yáng)性菌，是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株。從精氨酸在黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌利用循環(huán)途徑由谷氨酸合成精氨酸(圖1)可以看出，精氨酸是由瓜氨酸透過(guò)胞質(zhì)酵素精氨基琥珀酸合成酶(AS)及精氨基琥珀酸裂解酶(AL)合成。精氨酸琥拍酸酶(Argininosuccinate E.C.4.3.2.1) (AL)是合成途徑中的最后一個(gè)酶，催化底物精氨酸琥珀酸合成精氨酸，如果我們將精氨酸琥珀酸酶基因過(guò)表達(dá)，從瓜氨酸到精氨酸的轉(zhuǎn)化可能就會(huì)加速或提高。按照這一思路，我們首先克隆來(lái)自于谷氨酸棒桿菌的精氨酸琥珀酸酶(AL)的編碼基因ar^H，與并在大腸桿菌BL21和黃色短桿菌AN78中高效表達(dá)。因此，構(gòu)建了重組黃色短桿菌/ pXMJ19-argH，在黃色短桿菌AN78中加強(qiáng)AL的本底表達(dá)，并對(duì)重組黃色短桿菌桿菌進(jìn)行酶活和發(fā)酵產(chǎn)精氨酸初步分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
總體技術(shù)方案是克隆包括谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸棒桿菌精氨酸琥珀酸酶的基因，利用合適的載體和限制性內(nèi)切酶片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將精氨酸琥珀酸酶基因克隆到合適的宿主細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。
[0010]1.基因模板提取:將待精氨酸琥珀酸酶基因的菌株在肉汁培養(yǎng)基等谷氨酸棒桿菌能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑盒方法提取菌體DNA，作為基因擴(kuò)增的模板。
[0011]2.精氨酸琥珀酸酶基因的克隆:根據(jù)出發(fā)菌株的堿基特征和精氨酸琥珀酸酶基因的保守序列，設(shè)計(jì)引物，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑個(gè)方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增精氨酸琥珀酸酶基因。
[0012]3.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選:按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、完全可與從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內(nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。
[0013]4.重組菌的搖瓶發(fā)酵:按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、方法，按照文獻(xiàn)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，紫外分光光度法檢測(cè)L-精氨酸的含量.發(fā)明效果
利用本技術(shù)方案涉及的方法，構(gòu)建了基于精氨酸琥珀酸酶與PXMJ19的重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21和篩選的高產(chǎn)突變株AN78中，誘導(dǎo)表達(dá)重組酶，以及搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)L-精氨酸，以期實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)菌株-黃色短桿菌AN78的重組菌中L-精氨酸產(chǎn)量的提聞。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1精氨酸生物合成途徑。
[0015]圖2精氨酸琥珀酸酶的系統(tǒng)進(jìn)化。利用已有的精氨酸琥珀酸酶序列和軟件clustalxl.83 的 treeTop 程序(www.genebee.msu.su/genebee.html)進(jìn)行比對(duì)(分支距離(X軸)代表利用BL0SUM62)取代矩陣獲得的親緣關(guān)系。
[0016]圖3 PCR產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析:1，2泳道是以AN78基因組為模板PCR產(chǎn)物；3泳道是以13032基因組為模板的PCR產(chǎn)物；4泳道是Marker，從上到下2000 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp ;5，6 泳道是陰性對(duì)照。
[0017]圖4重組質(zhì)粒pXMJ19_argH雙酶切檢測(cè):1泳道是Marker，從上到下分別為，10000bp, 7000 bp, 4000 bp, 2000 bp, 1000 bp, 500 bp, 250 bp;2 泳道為 I 單酶切的質(zhì)粒pXMJ19-argH ；3 )織％ BamH I單酶切的質(zhì)粒pXMJ19_argH ；4泳道為抽提的質(zhì)粒，5泳道為EcoR I熱BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pXMJ19_argH。
[0018]圖5 SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)精氨酸琥珀酸酶:1泳道是BL21誘導(dǎo)破碎后上清分析蛋白；2泳道是未誘導(dǎo)BL21破碎后上清分析蛋白；3泳道是低蛋白Marker，從上到下是97.2kD，66.4 kD，44.3 kD，29 kD，20.1 kD, 14.3 kD ;4 泳道是重組的 AN78 誘導(dǎo)后破碎上清分析；5泳道是重組AN78未誘導(dǎo)后破碎上清分析。
[0019]圖6 L-精氨酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020]1.材料與方法
1.1菌株與質(zhì)粒
黃色短桿菌fIavum)屬于革蘭式陽(yáng)性菌,是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株，該 細(xì)菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，以下簡(jiǎn)稱營(yíng)養(yǎng)缺陷型AN78菌；大腸桿菌{Escherichia co7i)DH5a、BL21 (DE3)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；含穿梭載體pXMJ119的大腸桿菌DH10B，購(gòu)于北大工學(xué)院紹興技術(shù)研究院；谷氨酸棒桿菌ATCC 13032購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。
[0021]1.2試劑和材料
試驗(yàn)試劑:Taq DNA Ploymerase, DNA marker III 和marker DL2000 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI熱BamH I)，T4 DNA連接酶和dNTP購(gòu)自Takara公司；IPTG購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；氯霉素購(gòu)自Genview公司；L_精氨酸購(gòu)自sigma公司，其余化學(xué)試劑為分析純,均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。
[0022]1.2.1基因組的抽提，
谷氨酸棒桿菌基因組抽提使用的是TaKaRa公司基因組抽提試劑盒，按照Kits說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作?；蚪MDNA溶于TE Buffer (PH 8.0)中。
[0023]1.2.2 質(zhì)粒 pXMJ19 和 pXMJ19_argH 抽提
從大腸桿菌DHlOB中抽提pXMJ19質(zhì)粒使用的是北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司的試劑盒。重組菌構(gòu)建成功后抽提質(zhì)粒的試劑盒產(chǎn)自O(shè)MEGA公司的革蘭氏陽(yáng)性菌抽提試劑盒。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。質(zhì)粒DNA溶于TE Buffer (PH8.0)中。
[0024]1.2.3目的基因argH編碼序列的擴(kuò)增
根據(jù) GeneBank 登錄的 ATCC13032 編碼序列(GeneID:GenbankBA000036)設(shè)ii對(duì)引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)一P2，P3，序列以及酶切位點(diǎn)如下:
P2:5/ -CGCGGATCCTTATCGACGTACCCCCGC-3' BamH I ^Ybp P3:5/ -CGCGAATTCATGGAACAGCACGGAACC3' EcoR I27bp
PCR反應(yīng)體系(25 μ I):
10XPCR Buffer (含 Mg2+)2.5 μ I ；引物 Ρ2/Ρ3 (10 μ Μ)各 I μ 1，模板 2 μ I, Taq 0.2μ I ；
PCR反應(yīng)條件:
94 °C 5 min ；94 °C I min，56 °C 50 s，72 °C I min ;35 個(gè)循環(huán)；72 °C, 10 min ；1.2
%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及純化PCR產(chǎn)物。
[0025]1.2.4目的基因在大腸桿菌DH5 α克隆與鑒定
用及^7? UWBamH I雙酶切PCR產(chǎn)物和pXMJ19載體(37°C )，瓊脂糖凝膠電泳純化，回收酶切的基因片段和載體，然后T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化萬(wàn).BL21 (熱激法)涂布于LB平板(含30 μ g/ml的氯霉素)上，37°C培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒pXMJ19-argH送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。
[0026]1.2.5重組pXMJ19_argH在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)
挑取重組菌BL21 (pXMJ19 -argH)接種于含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 1:震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于新鮮的含有氯霉素的LB中，接種量4%，振蕩培養(yǎng)至0D_=0.53，30°C下IPTG誘導(dǎo)(終濃度0.5mM )2 h后離心收集細(xì)胞；Buffer A重懸細(xì)胞，超聲破菌，離心分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析菌體，上清和沉淀。帶有pXMJ19空載體的BL21作對(duì)照。
[0027]1.2.6重組蛋白純化
按照優(yōu)化的表達(dá)條件，培養(yǎng)600 ml的表達(dá)菌液；離心(10000 rpm, 5 min)收集菌體；Buffer A重懸細(xì)胞沉淀，冰浴中超聲波破碎菌體，4 °C離心(10000 rpm, 10 min)，收集上清。上清液上樣于預(yù)先Buffer A平衡的Ni sepherose上，流蘇0.5 ml/min ；BufferA沖洗柱子，收集雜蛋白；Buffer B和Buffer C梯度洗脫并收集目的蛋白，4度保存；取經(jīng)SDS-PAGE分離得到的重組argH條帶，_20°C保存。
[0028]1.2.7搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸。
[0029]1.2.7.1種子培養(yǎng)基配方(％)
葡萄糖 3.0 g，尿素 0.3g，玉米漿粉 2.5g, KH2PO4 0.15g, K2HPO4.3H20 0.05g,MgSO4.7H20 0.04g, (NH4) 2S04 0.25g, His 0.003 g，生物素 0.0OOOlg。PH 7.11，115。。，15min。
[0030]1.2.7.2發(fā)酵培養(yǎng)基配方(％):
葡萄糖5g，(NH4)2S043 g (文獻(xiàn)中描述是4-7g)，玉米漿粉2.5g, KH2PO4 0.10g，MgSO4.7Η20 0.04g，尿素 0.lg，生物素:0.00001g，His: 0.0003g，CaCO3:1.0g，酚紅:
0.002g。PH 7.0，115 °C，15min。
[0031]1.2.7.3 搖瓶發(fā)酵
從斜面上挑取一環(huán)菌苔接種于種子培養(yǎng)基(200X 30mm的試管，其內(nèi)裝有30ml培養(yǎng)基)中，轉(zhuǎn)速為，115rpm，30 V，培養(yǎng)24小時(shí)，10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(250ml喇叭口三角瓶，兩瓶，其內(nèi)裝各50 ml培養(yǎng)基)中，轉(zhuǎn)速115rpm，30°C，培養(yǎng)4天(96小時(shí))。離心收集上清液，百里酚法檢測(cè)L-精氨酸的含量。
[0032]1.2.7.4 L-精氨酸的檢測(cè) 1.2.7.4.1顯色劑的配制
百里酚:稱取一定量的百里酚。溶于4%的氫氧化鈉中，配制成0.03%溶液次溴酸鈉:準(zhǔn)確吸取0.68ml純溴水溶于100mL 5%的氫氧化鈉溶液的，配制成2%的次溴酸鈉溶液。裝入棕色瓶4°C冷藏，用時(shí)以5%氫氧化鈉稀釋至合適的濃度(次溴酸鈉濃度為
0.7%，反應(yīng)在冰水浴中進(jìn)行)。
[0033]尿素溶液(40%):稱取40g尿素溶解在100mL純水中制成。
[0034]標(biāo)準(zhǔn)液的配制:
母液:準(zhǔn)確吸取L-精氨酸lOOmg，用純水定容至100ml。L-精氨酸的濃度為1000 μ g/
ml ο
[0035]100 μ g/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液:精確吸取母液IOml加水定容至100mL。
[0036]標(biāo)準(zhǔn)液的配制:精確吸取儲(chǔ)存液加水配制成8 μ g/ml, 12 μ g/ml, 16ug/ml, 20 μ g/ml, 24 μ g/ml的精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。
[0037]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液和對(duì)照(水)各5ml分置于已編號(hào)的比色管中，加入2ml 0.03%百里酚溶液，搖勻，置于冰水浴中20min后加入1ml冰水浴中的次溴酸鈉溶液，迅速搖勻，溶液呈黃色，30s內(nèi)加入1ml 40%尿素用力震蕩,使之混合均勻，置于冰水浴中反應(yīng)l_2min,此后在470nm處測(cè)吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0038]發(fā)酵液L-精氨酸含量的測(cè)定
發(fā)酵液過(guò)濾的濾液，純水稀釋至一定濃度(8-24μ g/ml)。準(zhǔn)確吸取稀釋的發(fā)酵液5ml，分置于比色管中加入2ml 0.03%百里酚液，對(duì)照管中加入2ml 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，置于冰水浴中20min，加入1ml 0.7%的次溴酸鈉迅速搖勻，溶液呈黃色。計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)L-精氨酸的基因工程菌株，其特征在于，該菌株為用重組基因工程質(zhì)粒pXMJ19-argH轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78 (p-argH)。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中大腸桿菌選自BL21、DH5a，營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78、谷氨酸棒桿菌ATCC 13032之一。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重組基因工程質(zhì)粒pXMJ19-argH含有谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的精氨酸琥珀酸酶基因核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括下列步驟: a)以谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得編碼精氨酸琥珀酸酶基因argH，利用穿梭質(zhì)粒pXMJ19表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒p XMJ19_argH ；b)將pXMJ19-argH轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α和BL21中，鑒定重組質(zhì)粒的正確性； c)再將重組質(zhì)粒pXMJ19-agH轉(zhuǎn)化導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型黃色短桿菌AN78中，鑒定重組質(zhì)粒的正確性以及含有重組質(zhì)粒的黃色短桿菌AN78中質(zhì)粒遺傳的穩(wěn)定性。
5.如權(quán)利要求1-4所述的任一權(quán)利要求所述基因工程菌主要用于生產(chǎn)L-精氨酸。
6.如權(quán)利要求1-5所述的基因工程菌構(gòu)建方法，其特征在于，其中PCR擴(kuò)增編碼精氨酸琥珀酸酶基因argH所用的引物為: P2:5/ -CGCGGATCCTTATCGACGTACCCCCGC-3' BamH I ^Ybp P3:5/ -CGCGAATTCATGGAACAGCACGGAACC3' EcoR I27bp。
7.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述基因工程菌株主要用于生產(chǎn)L-精氨酸。
8.用權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述基因工程菌株生產(chǎn)L-精氨酸方法，包括下列步驟: a)其出發(fā)菌株為權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述黃色短桿菌AN78基因工程菌株； b)搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵:搖床轉(zhuǎn)速為100-300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間3-4天。
【文檔編號(hào)】C12N15/60GK103966151SQ201310033444
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月29日
【發(fā)明者】王翠平, 馬承國(guó), 王開(kāi)成, 張傳軍 申請(qǐng)人:上海凱圣生物科技有限公司