專利名稱：純種野豬鑒定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種純種野豬鑒定試劑盒。
背景技術(shù)：
從上個世紀(jì)九十年代開始，全國各地都開展了利用野豬雜交改良現(xiàn)有家豬品種的養(yǎng)殖與育種工作。但因?yàn)橐柏i難以捕獲和養(yǎng)殖，現(xiàn)市場上出現(xiàn)了許多名為純種野豬，其實(shí)為野豬與家豬雜交后代的個體，養(yǎng)殖者購買時(shí)因缺少檢測設(shè)備只能人為從體型外貌、毛色以及生活習(xí)性等方面區(qū)分，但二者上述特點(diǎn)非常類似根本無法檢測和區(qū)分，一旦購買后將其作為父本進(jìn)口繁殖，其后代會出現(xiàn)明顯的性狀分離，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是針對上述存在的問題提供一種純種野豬鑒定試劑盒，能夠準(zhǔn)確檢測和區(qū)分野豬與其他家豬品種。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)純種野豬鑒定試劑盒，其組成包括盒體,所述的盒體包括并排的圓口盛樣槽及方口盛樣槽，所述的圓口盛樣槽旁邊有標(biāo)簽，所述的圓口盛樣槽和所述的方口盛樣槽底部為尖嘴狀，所述的盛樣槽底部有小孔，所述的盒體內(nèi)部有密閉的樣品反應(yīng)槽，所述的樣品反應(yīng)槽底面是傾斜的，所述的樣品反應(yīng)槽外壁底部有加熱裝置，所述的盛樣槽尖嘴伸入到樣品反應(yīng)槽內(nèi)，所述的盒體內(nèi)有暗箱，所述的暗箱內(nèi)裝有加樣吸管。所述的純種野豬鑒定試劑盒，所述的圓口盛樣槽順次連接，所述的圓口盛樣槽連接所述的方口盛樣槽，所述的方口盛樣槽連接所述的樣品反應(yīng)槽，所述的樣品反應(yīng)槽連接電泳槽，所述的電泳槽連接紫外凝膠成像儀，所述的盒體內(nèi)有電泳槽，所述的電泳槽內(nèi)裝有瓊脂糖，所述的方口盛樣槽內(nèi)裝有引物，所述的圓口盛樣槽為一組，順次盛裝去離子水，內(nèi)切酶緩沖液，Acc II內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。有益效果I.本實(shí)用新型采用密閉的樣品反應(yīng)槽使判斷結(jié)果更客觀。帶有紫外凝膠成像儀，使人肉眼即可見酶切片段，達(dá)到判定的目的。本實(shí)用新型特設(shè)了一個加熱裝置，對于去離子水，內(nèi)切酶緩沖液，Acc II內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合時(shí)所需的溫度可有效控制。黑素皮質(zhì)素受體I基因(MClR)是一個人工馴化基因，與毛色相關(guān)，野豬與家豬之間存在著明顯不同的進(jìn)化方式?？梢酝ㄟ^對該基因的檢測，快速、有效的鑒定和區(qū)分純種野豬與家豬和野家雜交豬。在DNA模板、引物、4種dNTP和Taq DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，介于兩個引物之間的新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個分子)。用特異設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增結(jié)束后，由于擴(kuò)增片段內(nèi)特定位點(diǎn)的堿基突變而導(dǎo)致了內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的改變(從有到無或從無到有)，以至出現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到酶切片段。


附圖I是本產(chǎn)品打開的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖2是盒體盛樣槽部剖面圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :所述的純種野豬鑒定試劑盒，其組成包括盒體(1)，其特征是所述的盒體包括并排的圓口盛樣槽(2)及方口盛樣槽(3)，所述的圓口盛樣槽旁邊貼有標(biāo)簽(4)，所述的圓 口盛樣槽和所述的方口盛樣槽底部為尖嘴狀，所述的盛樣槽底部有小孔(5)，所述的盒體內(nèi)部有密閉的樣品反應(yīng)槽(6)，所述的樣品反應(yīng)槽底面是傾斜的，所述的樣品反應(yīng)槽外壁底部有加熱裝置(7)，所述的盛樣槽尖嘴伸入到樣品反應(yīng)槽內(nèi)，所述的盒體內(nèi)有暗箱(8)，所述的暗箱內(nèi)裝有加樣吸管(9 )，所述的盒體內(nèi)有電泳槽(10 )。實(shí)施例2 所述的純種野豬鑒定試劑盒，所述的圓口盛樣槽順次連接，所述的圓口盛樣槽最后連接所述的方口盛樣槽，所述的方口盛樣槽連接所述的樣品反應(yīng)槽，所述的樣品反應(yīng)槽連接電泳槽，所述的電泳槽連接紫外凝膠成像儀(U)。實(shí)施例3 所述的純種野豬鑒定試劑盒，所述的電泳槽內(nèi)裝有瓊脂糖，所述的方口盛樣槽內(nèi)裝有引物，所述的圓口盛樣槽分別盛裝去離子水，內(nèi)切酶緩沖液，Acc II內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增以血液或組織樣(一般為耳組織)中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每份總體積25 μ L，取23. 8 μ L PCR反應(yīng)液(用前混勻)，O. 2 μ L Taq DNA聚合酶，I μ L模板DNA(濃度彡50ng/yL)。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序94 V 5 min ；94 V 30 S，58 V30 s，72 V 30 s，30 個循環(huán)；72 °C延伸 7 min ；4 °C保存。酶切使用引物I擴(kuò)增的反應(yīng)液,取7. 8 μ L去離子水，2 μ L內(nèi)切酶緩沖液，O. 2 μ LAcc II內(nèi)切酶，10 uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻，37 °C水浴鍋3 h ;使用引物2擴(kuò)增的反應(yīng)液，取7.8 μ L去離子水，2 μ L內(nèi)切酶緩沖液，O. 2 μ L BspH I內(nèi)切酶，10 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，混勻，37 °C水浴鍋3 h。結(jié)果判定 (I)電泳稱4 g瓊脂糖放于100 mL錐形瓶中，加入I X TAE電泳緩沖液100 mL(取2 mL 50X TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL)，于微波爐中熔解，再加入2 μ L EB替代物混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將酶切產(chǎn)物10 μ L點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以150 180 V電壓于IXTAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。(2)基因型判定被檢樣品(引物I)出現(xiàn)380 bp為ΑΑ，出現(xiàn)194 bp、186bp為BB、出現(xiàn)380 bp、194bp、186 bp為AB;同一被檢樣品(引物2)出現(xiàn)694 bp為AA，出現(xiàn)286 bp,408 bp為BB，出現(xiàn)694 bp、286 bp、408 bp 為 AB。[0034](3)結(jié)果判定同一個體Acc II / BspH I基因型組合為BB/AA型為純種野豬個體，其余均含有家豬血統(tǒng)。XTAE 電泳緩沖液242 g Tris溶于800 mL水中，加入 100 mL 的 0. 5 mol/L EDTA(pH 8.0)和57. I mL冰醋酸，定容至1000 mL，高壓滅菌，貯 存于室溫。上樣緩沖液0. 25%溴酚藍(lán)、0. 25% 二甲苯青、40% (W/V)蔗糖水溶液PCR反應(yīng)液17.3 UL去離子水，2. 5 ii L PCR緩沖液，2 U L dNTP，上下游引物各I UL (# IOu mol),按此比例混合引物I :上游引物 5 ’ - AGCACCCTCTTCATCGCCTACTACC _3 ’、下游引物 5 ’ - CTGCGGAAGGCGTAGATGAGG _3’ ；引物 2 :上游引物 5’ -CGCCAACCAGACCAACCAGACGG-3’，下游引物5， -TGCCCAGCAGAGGAGGAAGACGC-3，dNTP :dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等摩爾數(shù)混合物(各 3. 2 u mol)內(nèi)切酶AccII 和 BspH IMarker DL2000 DNA Marker,由 DNA片段2000 bp、1000bp、750 bp>500 bp、250 bp以及100 bp組成,共6條帶。
權(quán)利要求1.一種純種野豬鑒定試劑盒，其組成包括盒體，其特征是所述的盒體包括并排的圓口盛樣槽及方口盛樣槽，所述的圓口盛樣槽旁邊有標(biāo)簽，所述的圓口盛樣槽和所述的方口盛樣槽底部為尖嘴狀，所述的盛樣槽底部有小孔，所述的盒體內(nèi)部有密閉的樣品反應(yīng)槽，所述的樣品反應(yīng)槽底面是傾斜的，所述的樣品反應(yīng)槽外壁底部有加熱裝置，所述的盛樣槽尖嘴伸入到樣品反應(yīng)槽內(nèi)，所述的盒體內(nèi)有暗箱，所述的暗箱內(nèi)裝有加樣吸管。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的純種野豬鑒定試劑盒，其特征是所述的圓口盛樣槽順次連接，所述的圓口盛樣槽連接所述的方口盛樣槽，所述的方口盛樣槽連接所述的樣品反應(yīng)槽，所述的樣品反應(yīng)槽連接電泳槽，所述的電泳槽連接紫外凝膠成像儀，所述的盒體內(nèi)有電泳槽，所述的電泳槽內(nèi)裝有瓊脂糖，所述的方口盛樣槽內(nèi)裝有引物，所述的圓口盛樣槽為一組，順次盛裝去離子水，內(nèi)切酶緩沖液，Acc II內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種純種野豬鑒定試劑盒?，F(xiàn)市場上出現(xiàn)了許多名為純種野豬，其實(shí)為野豬與家豬雜交后代的個體，養(yǎng)殖者購買時(shí)因缺少檢測設(shè)備。本實(shí)用新型組成包括本產(chǎn)品組成包括盒體(1)，盒體包括并排的圓口盛樣槽(2)及方口盛樣槽(3)，圓口盛樣槽旁邊貼有標(biāo)簽(4)，圓口盛樣槽和方口盛樣槽底部為尖嘴狀，盛樣槽底部有小孔(5)，盒體內(nèi)部有密閉的樣品反應(yīng)槽(6)，樣品反應(yīng)槽底面是傾斜的，樣品反應(yīng)槽外壁底部有加熱裝置(7)，盛樣槽尖嘴伸入到樣品反應(yīng)槽內(nèi)，盒體內(nèi)有暗箱(8)，暗箱內(nèi)裝有加樣吸管。本產(chǎn)品用于檢測和區(qū)分野豬與其他家豬品種。
文檔編號C12M1/34GK202558866SQ20122007847
公開日2012年11月28日 申請日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者張冬杰, 劉娣, 汪亮, 王文濤 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所