專利名稱：msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。
背景技術(shù)：
血栓形成是一種涉及許多彼此相互作用的遺傳和環(huán)境因素的多因素變化的過程。而對于老年人其凝血系統(tǒng)又有其特殊性，老年人纖維蛋白原(FIB)含量、組織型纖溶酶原激活物增加以及纖溶酶原激活物抑制劑復(fù)合物的增加都導(dǎo)致老年人的高凝狀態(tài)，所以更容易形成血栓；其中研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期后的女性的血栓發(fā)生率遠(yuǎn)高于男性。老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)，美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查(NHANES III，1988 1994年)結(jié)果 表明，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險(xiǎn)明顯加大。中國老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬，占總?cè)丝诘?br> 7.1%。隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預(yù)計(jì)到2050年將增加到
2.21億，那時(shí)全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國。有學(xué)者對1995 1996年美國骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進(jìn)行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。對于老年人骨質(zhì)疏松和血栓已成為常見多發(fā)病，且往往同時(shí)存在，特別是絕經(jīng)期后的女性。如果患者服用多種藥物同時(shí)治療骨質(zhì)疏松和血栓，容易產(chǎn)生藥物拮抗反應(yīng)；若要錯(cuò)開服藥時(shí)間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏一種可以同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓的藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前尚無同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷，而提供的一種msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)，大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ；四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。
本發(fā)明中msCT_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)發(fā)酵產(chǎn)生的msCT-AcAP5融合蛋白含有127個(gè)氨基酸。本發(fā)明msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)發(fā)酵產(chǎn)生的msCT_AcAP5融合蛋白可用于同時(shí)治療骨質(zhì)疏松和血栓，適合同時(shí)患有這兩種疾病的患者使用。且msCT-AcAP5融合蛋白為微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)msCT_AcAP5融合蛋白，具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明為治療骨質(zhì)疏松和血栓奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式msCT_AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ； 四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。本實(shí)施方式步驟四采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施 方式一的不同點(diǎn)在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)酶切反應(yīng)體系為
pUC ( msCT/AcAP5 )20μ1
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。本實(shí)施方式步驟一酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二的不同點(diǎn)在于步驟二中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為
載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM buffer 6μ1BamHX 3μ1EcoR I 3μ1不含 DNA 酶的 ddH20 28μ1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。本實(shí)施方式步驟二酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后O. 6%瓊脂糖凝膠電泳，
目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三的不同點(diǎn)在于步驟三
中酶連接反應(yīng)體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段Ι3μ110 X Τ4 DNA 連接酶 buffer 2μ1Τ4 DNA連接酶 2μ1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。本實(shí)施方式步驟三酶連接反應(yīng)在16 °C條件下進(jìn)行。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一的不同點(diǎn)在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。本實(shí)施方式msCT_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一的不同點(diǎn)在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ；四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3_msCT/AcAP5)；其中步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5 )酶切反應(yīng)體系為
pUC ( msCT/AcAP5 )20 μ
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步驟二中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為
載體 pGEX-6P-l20 μ
IOXM buffer6μ1
BamHX3μ1 Ι',αυΚ I 3 μ
不含DNA酶的ddH2028μ1其中步驟三中酶連接反應(yīng)體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段Ι3μ1
10ΧΤ4 DNA 迮接峋 buffer2μ1
Τ4 DNA連接酶2μ1。其中步驟一中msCT_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示；步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。本實(shí)施方式中msCT_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)。本實(shí)施方式在構(gòu)建msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)時(shí)去除了 AcAP5基因的原始信號肽，而且在msCT和犬鉤蟲抗凝血肽之間插入Kpn I酶切位點(diǎn)，既可以提高所編碼融合蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)也改變?nèi)诤系鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因兩側(cè)分別加上BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，而且根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子的特點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)了融合基因編碼堿基序列。
載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點(diǎn)，本實(shí)施方式合成的pGEX_msCT/AcAP5均能為Kpn I單酶切開，說明本實(shí)施方式msCT-AcAP5融合蛋白成功導(dǎo)入質(zhì)粒pGEX_6P_l中。然后將質(zhì)粒pGEX-msCT/AcAP5導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，選取陽性克隆。隨機(jī)挑取陽性克隆大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)菌落37°C過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)DNA，用Kpn I進(jìn)行單酶切，并用相應(yīng)的空白質(zhì)粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測序。測序工作委托生物公司進(jìn)行，大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)內(nèi)含有SEQ ID NO 1所示DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)置于LB培養(yǎng)基28°C環(huán)境條件下培養(yǎng)15h，然后采用GST標(biāo)簽融合蛋白純化方法進(jìn)行蛋白的分離純化，本實(shí)施方式用于治療骨質(zhì)疏松和血栓的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達(dá)量為38. 2%。利用本實(shí)施方式大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)發(fā)酵獲得的msCT_AcAP5融合蛋白進(jìn)行試驗(yàn) msCT-AcAP5融合蛋白治療骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)取雌性SD大鼠在無菌條件下摘除雙側(cè)卵巢，12周后取存活健康大鼠32只，隨機(jī)分為4組(陽性對照組1、陽性對照組2、融合蛋白實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組)，每組8只。另取雌性SD大鼠切除雙側(cè)一小塊脂肪，12周后隨機(jī)取存活健康大鼠8只作為假手術(shù)對照組。共計(jì)5組，分別口服以下藥物假手術(shù)對照組質(zhì)量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；陰性對照組質(zhì)量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；融合蛋白實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量濃度為O. 5%的msCT-AcAP5融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質(zhì)疏松和血栓的msCT-AcAP5融合蛋白用無菌水溶解)陽性對照組1:阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg ；陽性對照組2 :質(zhì)量濃度為O. 5%的msCT蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。連續(xù)給藥三個(gè)月，處死后取大鼠股骨頭，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經(jīng)清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質(zhì)疏松治療對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，結(jié)果表明融合蛋白實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組I和陽性對照組2都具有治療骨質(zhì)疏松的作用，且融合蛋白實(shí)驗(yàn)組的效果最好。表I骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
miI給藥劑量 I骨小梁寬度X±SD~I骨小梁面積X±SD~
假手術(shù)對照組 8 5ml/kg112. 50+14.89 0.6911+0.0510
陰性對照組8 5ml/kg52.34+16.8O. 5347 + 0.0500
陽性對照組 I 8 5ml/kg115. 76 + 14.50.6962 + 0.0593
陽性對照組 2 8 5ml/kg117. 52 + 14.10.6970 + 0.0485
融合蛋白實(shí)驗(yàn)組~8 5ml/kg124. 78+15. 9O. 7051+0. 0438融合蛋白(msCT_AcAP5)通過靜脈注射給藥治療骨質(zhì)疏松效果更佳。
msCT-AcAP5融合蛋白抗大鼠血栓實(shí)驗(yàn)取SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，即空白組、對照組I (陽性藥)、對照組2(AcAP5多肽)和msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高劑量組。對照組I選用肝素鈉注射液(給藥劑量為1650 U/kg)，對照組2 (給藥劑量為200 μ g/kg)，msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高劑量組(給藥劑量5倍遞增)的給藥劑量分別為40 μ g/kg、200 μ g/kg、I mg/kg,空白組給予同體積的生理鹽水。全部由靜脈注射給藥，經(jīng)靜脈注射給藥后，立即將分離好的頸動(dòng)脈置于YLS-14B小動(dòng)物血栓生成儀的探測接頭內(nèi)，啟動(dòng)血栓生成儀，用恒流直流電刺激(I mA)。記錄探頭通過紅外掃描測量血液的流通量并換算出血管堵塞程度(測量的時(shí)間間隔為4 S，以百分?jǐn)?shù)表示數(shù)據(jù)，全部過程持續(xù)5 min)。觀察抗血栓治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，結(jié)果表明空白組的頸動(dòng)脈堵塞程度與另外五組都用明顯的區(qū)別。表2 msCT_AcAP5融合蛋白抗大鼠頸總動(dòng)脈血栓的效果[n，(Y±s) %]
權(quán)利要求
1.msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAP5)，大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)按以下步驟制備 一、將含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(msCT/AcAP5 )用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/AcAP5 ； 四、用載體pGEX-msCT/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAP5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAP5)酶切反應(yīng)體系為 pUC (msCT/AcAP5)20 μ IOXM buffer6μ1 BamHX3μ1 KcoR I3 μ 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟二中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為載體 pGEX-6P-l20 μ IOXM bufferΟμΙ BamHl^μ EcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應(yīng)體系為 雙酶切的載體PGEX-6P-13 μ 融合蛋白的DNA片段13μ1 10ΧΤ4 DNA 迮接iW buiicv2μ1Τ4 DNA連接酶2μ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。解決目前尚無同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷。msCT-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-msCT/AcAP5)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質(zhì)粒；三、酶連接；四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。本發(fā)明可用于醫(yī)藥制備領(lǐng)域。
文檔編號C12N1/21GK103013900SQ20121058541
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請人:黑龍江大學(xué)