專利名稱：msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。
背景技術(shù)：
老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標準，美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查(NHANES III，1988 1994年)結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松嚴重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬，占總?cè)丝诘?. 1%。隨著社會老齡化的進程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加到2. 21億，那時全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國。有學者對1995 1996年美國骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。 血栓形成是ー種涉及許多彼此相互作用的遺傳和環(huán)境因素的多因素變化的過程。而對于老年人其凝血系統(tǒng)又有其特殊性，老年人纖維蛋白原(FIB)含量、組織型纖溶酶原激活物増加以及纖溶酶原激活物抑制劑復合物的増加都導致老年人的高凝狀態(tài)，所以更容易形成血栓；其中研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期后的女性的血栓發(fā)生率遠高于男性。對于老年人骨質(zhì)疏松和血栓已成為常見多發(fā)病，且往往同時存在。如果患者服用多種藥物同時治療骨質(zhì)疏松和血栓，容易產(chǎn)生藥物拮抗反應(yīng)；若要錯開服藥時間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另ー方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏ー種可以同時有效治療骨質(zhì)疏松和血栓的藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前尚無同時有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷，而提供的ー種msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)，大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/ACAPC2 ；四、用載體PGEX-msCT/AcAPc2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。本發(fā)明中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
本發(fā)明中msCT-AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)發(fā)酵產(chǎn)生的msCT-ACAPC2融合蛋白含有118個氨基酸。本發(fā)明mSCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)發(fā)酵產(chǎn)生的msCT_AcAPc2融合蛋白可用于同時治療骨質(zhì)疏松和血栓，適合同時患有這兩種疾病的患者使用。且msCT-AcAPc2融合蛋白為微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21(DE3-msCT/ACAPC2)。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)msCT-AcAPc2融合蛋白，具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明為治療骨質(zhì)疏松和血栓奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)按以下步驟制備一、將含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/ACAPC2 ； 四、用載體PGEX-msCT/AcAPc2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。本實施方式步驟四采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實施方式
ニ 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)酶切反應(yīng)體系為
pUC (msCT/AcAPc2)20^1
IOXM buffer6(J
BamHl3(0,1
KcoR I3 [j]
不含 DNA 酶的 ddH2028^1。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。本實施方式步驟ー酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或ニ的不同點在于步驟ニ中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為載體 pGEX-6P-l20(i
IOXM buffer6\i\
BamH\3(il
EcoR I3p,l
不含 DNA 酶的 ddH2028|al。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。本實施方式步驟ニ酶切反應(yīng)在37°C條件下反應(yīng)10h，然后0. 6%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、ニ或三的不同點在于步驟三
中酶連接反應(yīng)體系為
雙酶切的載體PGEX-6P-13…
融合蛋白的DNA片段13…
10 X T4 DNA 迕接 1 : buffer2(il T4 DNA連接酶2nl。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一、ニ或三相同。本實施方式步驟三酶連接反應(yīng)在16 °C條件下進行。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一的不同點在于步驟ー中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。本實施方式msCT_AcAPc2融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物エ程公司制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)0具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一的不同點在于步驟ー中msCT-ACAPC2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。其他步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌 BL21 (DE3-msCT/AcAPc2)，大腸桿菌 BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)按以下步驟制備一、將含有msCT_AcAPc2融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得msCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段；ニ、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-msCT/ACAPC2 ；四、用載體PGEX-msCT/AcAPc2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)；
其中步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)酶切反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于msCT_AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-msCT/AcAPc2 )，大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2 )按以下步驟制備 一、將含有msCT-AcAPc2融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(msCT/AcAPc2)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得mSCT-ACAPC2融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-AcAPc2融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體PGEX-msCT/AcAPc2 ； 四、用載體pGEX-msCT/AcAPc2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_msCT/AcAPc2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (msCT/AcAPc2)酶切反應(yīng)體系為
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟二中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應(yīng)體系為
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAPc2融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的msCT-ACAPC2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中msCT-AcAPc2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。解決目前尚無同時有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷。msCT-AcAPc2融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-msCT/AcAPc2)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質(zhì)粒；三、酶連接；四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。本發(fā)明可用于醫(yī)藥制備領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/64GK103031266SQ20121058536
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請人:黑龍江大學