專利名稱：一種應(yīng)用角質(zhì)酶進(jìn)行酯合成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用角質(zhì)酶合成酯的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酯是由酸與醇反應(yīng)失水而生成的一類化合物，廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、飲料、醫(yī)藥、保健品、日用化工等各領(lǐng)域。目前酯類物質(zhì)的生產(chǎn)基本采用化學(xué)法，由無機(jī)催化劑(如濃硫酸)在高溫下催化酸和醇的酯化反應(yīng)而得。雖然生產(chǎn)成本較低，但過程中一些難以控制的副反應(yīng)使得產(chǎn)品品質(zhì)不高，強(qiáng)酸對(duì)設(shè)備的腐蝕也會(huì)增加維修費(fèi)用，更重要的是，此法造成的環(huán)境污染不符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的主流。而酶法合成酯類物質(zhì)具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、環(huán) 境污染小、并且產(chǎn)品品質(zhì)好的優(yōu)勢(shì)，因此開發(fā)酶制劑在酯合成中的應(yīng)用重要的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。角質(zhì)酶是一種多功能酯酶，既可催化水解不溶性多聚物角質(zhì)和各種聚酯的酯鍵，也可以作用于其它長(zhǎng)鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反應(yīng)外，角質(zhì)酶還能催化酸與醇的酯化、一些脂肪酸鹽與醇的轉(zhuǎn)酯化。目前已有報(bào)道來源于真菌F. solani的角質(zhì)酶在短鏈酯合成中的應(yīng)用，其中己酸乙酯合成的轉(zhuǎn)化率最高,為97%，但加酶量很高，為240U/mL,且中長(zhǎng)鏈的酯合成轉(zhuǎn)化率很低。本研究室在前期工作中鑒定了來源于Thermobifida fusca的兩種角質(zhì)酶Tfu_0882和Tfu_0883。本發(fā)明提供了該角質(zhì)酶在酯合成中的應(yīng)用方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 Thermobifida fusca角質(zhì)酶在酯合成中的應(yīng)用方法。為解決上述問題，本發(fā)明技術(shù)方案為采用來源于Thermobififda fusca的角質(zhì)酶進(jìn)行酯合成,底物濃度為O. 1_1M,酸與醇的摩爾比為 1:1-2，加水量 O. 03-0. 08%,加酶量為 10-80U/mL，40-60°C、100-200rpm,反應(yīng)時(shí)間4-15h，不同鏈長(zhǎng)的酯的反應(yīng)時(shí)間依據(jù)達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率時(shí)所需的時(shí)間而定。轉(zhuǎn)化率以消耗的酸與初始的酸含量的比值來計(jì)。上述酶促反應(yīng)條件與酶的性質(zhì)有關(guān)系，也可根據(jù)酶加入量調(diào)整相應(yīng)的工藝參數(shù)。所述酶促反應(yīng)優(yōu)先在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，并且有機(jī)溶劑的選用為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，更進(jìn)一步地優(yōu)先選用異辛烷或正己烷。所述角質(zhì)酶的生產(chǎn)方法為在一定培養(yǎng)條件下，以生產(chǎn)角質(zhì)酶的重組大腸桿菌(Chen S，Tong X, Woodard Rff,Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterizationof Bacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry,2008,283 (28)25854-25862)發(fā)酵一定時(shí)間，經(jīng)過12000rpm，離心lOmin，去除菌體，上清即為粗酶液，再經(jīng)過真空冷凍干燥，獲得角質(zhì)酶的酶粉。所述角質(zhì)酶活性的測(cè)定方法為以對(duì)硝基苯丁酸酯(PNPB)為底物，采用分光光度法在20° C下測(cè)定。反應(yīng)體系為111^，包括96(^1^緩沖液(201111 Tris - HCl, IOmM NaCl,50mM sodium taurodeoxycholate, ρΗ8· 0), 20 μ L 酶液，20 μ L ρΝΡΒ (ImM,乙臆中保存)，在405nm處，記錄對(duì)硝基酚的生成速率。酶活定義20° C下，每分鐘催化對(duì)硝基苯丁酸酯生成I μM對(duì)硝基酚的酶量即為一個(gè)酶活力單位。所述有機(jī)試劑和底物酸、醇均需用4Α型分子篩除水，防止對(duì)反應(yīng)體系中水含量的影響。所述酸的檢測(cè)方法為氣相檢測(cè)儀器為GC-2010，GAS CHROMATOGRAPH SHIMADZU,色譜柱為RTX-WAX(30mX 0. 32mm)，檢測(cè)器為FID，載氣為N2,流速3mL/min，柱溫條件為50°C(3min) -10°C min_1-220°C (lmin)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本實(shí)施例以Thermobifida fusca來源的角質(zhì)酶Tfu_0883進(jìn)行催化反應(yīng)。有機(jī)試劑和底物酸、醇采用4A型分子篩除水之后用于酯合成。反應(yīng)條件0.1M酸、0. 2M醇，加水量0. 03%, 500C，150rpm,酶30U/ml，反應(yīng)溶劑異辛烷，具體結(jié)果見表1、表2。表I
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用角質(zhì)酶進(jìn)行酯合成的方法，其特征在于，在酸與醇的反應(yīng)體系中加入Thermobifida fusca 角質(zhì)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述角質(zhì)酶為來源于Thermobifidafusca, NCBI 編號(hào)分別為 AAZ54920 和 AAZ54921。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸的碳鏈長(zhǎng)度為C1-C18。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述醇的碳鏈長(zhǎng)度為C1-C10。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸與醇的摩爾比為O.5-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系為反應(yīng)溶劑為有機(jī)溶劑，加水量O. 03-0. 08%，加酶量為10-80U/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為異辛烷或正己烷。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系為異辛烷，加水量O.03-0. 08%,加酶量為10-80U/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，酶催化反應(yīng)條件為40-60°C，100-200rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用角質(zhì)酶進(jìn)行酯合成的方法，在酸與醇的反應(yīng)體系中加入Thermobifida fusca角質(zhì)酶，角質(zhì)酶為來源于Thermobifida fusca，NCBI編號(hào)分別為AAZ54920和AAZ54921，所述反應(yīng)體系為反應(yīng)溶劑為有機(jī)溶劑，加水量0.03-0.08%，加酶量為10-80U/mL。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝，具有流程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高、適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12P7/62GK103014079SQ20121058108
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者吳敬, 宿玲恰, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)