光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，包括平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，試管培養(yǎng)，三角瓶培養(yǎng)，二級種子的制備，三級種子的制備，成品的制備等步驟。采用低濃度的有機培養(yǎng)基諸如蛋白胨、酵母膏及氮磷鉀鹽保證了培養(yǎng)出的光合細菌顏色純正，亮麗，不會變淡、變綠、變黑等；采用低濃度的氮源和碳源保證了低成本，更能適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；光合細菌生長速度快，菌液濃度高；其制備工藝簡單并易于控制，不易染雜菌，菌株濃度高，后加工成本低，生產(chǎn)環(huán)境友好。
【專利說明】光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]目前固態(tài)微生態(tài)制劑特別是光合細菌固態(tài)微生態(tài)的制劑方法通常有兩種工藝技術(shù)方案，一種是先進行液態(tài)深層發(fā)酵，最后加入固態(tài)載體吸附，干燥而成；而液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)雖可得到較純菌體，但成本高，發(fā)酵易受產(chǎn)物反饋控制，難以得到高濃度菌株，所以該方法有效菌數(shù)含量較低；另一種是常規(guī)固態(tài)發(fā)酵的模式；但現(xiàn)有的這些技術(shù)工藝方法普遍存在著工藝步驟復(fù)雜，制備成本高，產(chǎn)品收率低、雜菌含量高等缺點。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于，提供一種光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微 生態(tài)制劑的制備方法，解決現(xiàn)有技術(shù)光合細菌固態(tài)微生態(tài)的制劑方法存在成本高，難以得到高濃度菌株，有效菌數(shù)含量較低，工藝復(fù)雜，雜菌含量高的問題。
[0007]本發(fā)明提供的光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，包括以下步驟:
一、平板培養(yǎng)，光合細菌保存菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng) 24h ；
二、試管接種，取發(fā)育健壯、菌落典型的菌株接種10ml，12rC滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)
24h ；
三、三角瓶接種100ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h；
四、三角瓶接種1000ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h；
五、二級種子的制備，將光合細菌于30°C，通氣量為0.24m3/h條件下培養(yǎng)24h，得二級菌種9L ；
六、三級種子的制備，先向500L的液體發(fā)酵灌內(nèi)加入100L飲用水，將稱量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸鈉180g，碳酸氫鈉180g，氯化銨180g，氯化鎂180g，磷酸氫二鉀180g，葡萄糖3.6kg投入到發(fā)酵灌，攪拌10分鐘至全部溶解，然后停止攪拌，加飲用水至180L，定完液位后，開啟攪拌，然后打開蒸汽閥升溫至100°C，排冷空氣，排掉冷空氣后繼續(xù)升溫至121°C保持30分鐘，滅菌結(jié)束，冷卻，備用，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至30°C，將光合細菌二級種子9L通過壓差接種的方式，接種到500L發(fā)酵罐中，300C，通氣量為9.6m3/h條件下發(fā)酵48h，得三級菌種約200L ；七、將固體基質(zhì)和培養(yǎng)基原料加入到固體發(fā)酵罐中，1.0MPa, 121°C滅菌半小時，等培養(yǎng)基冷卻至30°C時，將液體菌種與固體發(fā)酵基質(zhì)按4:10混合，將混合均勻的固體發(fā)酵料盛入發(fā)酵淺盤，鋪料厚度4一5cm左右，置于發(fā)酵間，使發(fā)酵料好氧發(fā)酵，室溫保持在30°C左右，發(fā)酵時間為6天左右，發(fā)酵期間每天翻盤兩次。
[0008]所述步驟一或二或三或四中所用培養(yǎng)基均是由0.5g蛋白胨，0.5g酵母膏，1.0g乙酸鈉，1.0g碳酸氫鈉，1.0g氯化銨，0.5g氯化鎂，1.0g磷酸氫二鉀，15g瓊脂，1000ml蒸餾水配置而成，PH值為7 ;所述步驟七中固體基質(zhì)是由500kg花生殼或棉籽殼，150kg玉米粉，200kg豆柏粉，IOOkg麩皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成的。
[0009]本發(fā)明提供的光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，其有益效果在于，本發(fā)明中培養(yǎng)基PH值不隨著培養(yǎng)時間的延長而升高，始終保持在5.5—7.5之間，不會抑制光合細菌的生長；采用低濃度的有機培養(yǎng)基諸如蛋白胨、酵母膏及氮磷鉀鹽保證了培養(yǎng)出的光合細菌顏色純正，亮麗，不會變淡、變綠、變黑等；采用低濃度的氮源和碳源保證了低成本，更能適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；光合細菌生長速度快，菌液濃度高；其制備工藝簡單并易于控制，不易染雜菌，菌株濃度高，后加工成本低，生產(chǎn)環(huán)境友好。
[0010]
【具體實施方式】
[0011 ] 下面結(jié)合一個實施例，對本發(fā)明提供的光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法進行詳細的說明。
[0012]
實施例
[0013]本實施例的光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，包括以下步驟:
一、平板培養(yǎng)，光合細菌保存菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng) 24h ；
二、試管接種，取發(fā)育健壯、菌落典型的菌株接種10ml，12rC滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)
24h ；
三、三角瓶接種100ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h；
四、三角瓶接種1000ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h；
五、二級種子的制備，將光合細菌于30°C，通氣量為0.24m3/h條件下培養(yǎng)24h，得二級菌種9L ；
六、三級種子的制備，先向500L的液體發(fā)酵灌內(nèi)加入100L飲用水，將稱量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸鈉180g，碳酸氫鈉180g，氯化銨180g，氯化鎂180g，磷酸氫二鉀180g，葡萄糖3.6kg投入到發(fā)酵灌，攪拌10分鐘至全部溶解，然后停止攪拌，加飲用水至180L，定完液位后，開啟攪拌，然后打開蒸汽閥升溫至100°C，排冷空氣，排掉冷空氣后繼續(xù)升溫至121°C保持30分鐘，滅菌結(jié)束，冷卻，備用，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至30°C，將光合細菌二級種子9L通過壓差接種的方式，接種到500L發(fā)酵罐中，300C，通氣量為9.6m3/h條件下發(fā)酵48h，得三級菌種約200L，總含菌量達到1.3X 109cfu/mL。[0014]七、將固體基質(zhì)和培養(yǎng)基原料加入到固體發(fā)酵罐中，1.0MPa，121°C滅菌半小時，等培養(yǎng)基冷卻至30°C時，將液體菌種與固體發(fā)酵基質(zhì)按4:10混合，將混合均勻的固體發(fā)酵料盛入發(fā)酵淺盤，鋪料厚度4一5cm左右，置于發(fā)酵間，使發(fā)酵料好氧發(fā)酵，室溫保持在30°C左右，發(fā)酵時間為6天左右，發(fā)酵期間每天翻盤兩次。
[0015]所述步驟一或二或三或四中所用培養(yǎng)基均是由0.5g蛋白胨,0.5g酵母膏，1.0g乙酸鈉，1.0g碳酸氫鈉，1.0g氯化銨，0.5g氯化鎂，1.0g磷酸氫二鉀，15g瓊脂，1000ml蒸餾水配置而成，PH值為7 ;所述步驟七中固體基質(zhì)是由500kg花生殼或棉籽殼，150kg玉米粉，200kg豆柏粉，100kg麩皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成。
【權(quán)利要求】
1.一種光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 一、平板培養(yǎng)，光合細菌保存菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基，121°c滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng) 24h ； 二、試管接種，取發(fā)育健壯、菌落典型的菌株接種10ml，12rC滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h ； 三、三角瓶接種100ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h； 四、三角瓶接種1000ml，121°C滅菌30分鐘，32°C培養(yǎng)24h； 五、二級種子的制備，將光合細菌于30°C，通氣量為0.24m3/h條件下培養(yǎng)24h，得二級菌種9L ； 六、三級種子的制備，先向500L的液體發(fā)酵灌內(nèi)加入100L飲用水，將稱量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸鈉180g，碳酸氫鈉180g，氯化銨180g，氯化鎂180g，磷酸氫二鉀180g，葡萄糖3.6kg投入到發(fā)酵灌，攪拌10分鐘至全部溶解，然后停止攪拌，加飲用水至180L，定完液位后，開啟攪拌，然后打開蒸汽閥升溫至100°C，排冷空氣，排掉冷空氣后繼續(xù)升溫至121°C保持30分鐘，滅菌結(jié)束，冷卻，備用，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至30°C，將光合細菌二級種子9L通過壓差接種的方式，接種到500L發(fā)酵罐中，300C，通氣量為9.6m3/h條件下發(fā)酵48h，得三級菌種約200L ； 七、將固體基質(zhì)和培養(yǎng)基原料加入到固體發(fā)酵罐中，1.0MPa, 121°C滅菌半小時，等培養(yǎng)基冷卻至30°C時，將液體菌種與固體發(fā)酵基質(zhì)按4:10混合，將混合均勻的固體發(fā)酵料盛入發(fā)酵淺盤，鋪料厚度4一5cm左右，置于發(fā)酵間，使發(fā)酵料好氧發(fā)酵，室溫保持在30°C左右，發(fā)酵時間為6天左右，發(fā)酵期間每天翻盤兩次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟一或二或三或四中所用培養(yǎng)基均是由0.5g蛋白胨，0.5g酵母膏，1.0g乙酸鈉，1.0g碳酸氫鈉，1.0g氯化銨，0.5g氯化鎂，1.0g磷酸氫二鉀，15g瓊脂，1000ml蒸餾水配置而成，PH值為7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的 光和細菌液固雙重發(fā)酵高密度微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟七中固體基質(zhì)是由500kg花生殼或棉籽殼，150kg玉米粉,200kg豆柏粉，IOOkg麩皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成的。
【文檔編號】C12N1/20GK103881937SQ201210556654
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權(quán)汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司