專利名稱：一種三角帆蚌的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的全序列、引物序列及其蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(LipopoIysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列、引物序列、及其蛋白的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a 因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alphafactor, LITAF) 一種能調(diào)控腫瘤壞死因子TNF_a轉(zhuǎn)錄表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,可引起多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(Yang等,2012)。我國(guó)是水產(chǎn)大國(guó)，三角帆蛘等貝類養(yǎng)殖是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。三角帆蛘不僅肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還具有抗癌降血脂等功效。目前國(guó)內(nèi)外通過(guò)提取三角帆蛘等貝類體內(nèi)的多糖等生物活性物質(zhì)，并開(kāi)發(fā)出了保健食品。但以上多為多糖等物質(zhì)的混合物，是免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品，并且基礎(chǔ)研究資料少，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用較低，對(duì)其功效及副作用等所知不多。而利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的三角帆蛘中LITAF蛋白產(chǎn)品，對(duì)人類腫瘤細(xì)胞NCI-H446等腫瘤細(xì)胞具有殺傷性強(qiáng)、特異性高、安全性好、能夠大量生產(chǎn)、易于貯存等優(yōu)點(diǎn)，并具有廣闊的市場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列、引物序列、及其蛋白的制備方法，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中LITAF編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘中LITAF蛋白的全序列。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQ IDNO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列?！N三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的引物序列，具有序列表中SEQID NO. 3所示的用于擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。一種脂多糖 誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，包括如下步驟以三角帆蛘的cDNA為模板，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段，進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；再通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-LITAF，體外誘導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)；最后分離純化目的蛋白，獲得重組的LITAF蛋白，所制備得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的
氨基酸序列。所述步驟具體為1)以三角帆蛘的CDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增LITAF蛋白基因的引物，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段，進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；2)利用基因重組技術(shù)將LITAF基因片段克隆到合適的PMD19-T載體中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28(a)原核表達(dá)載體相連接，獲得表達(dá)重組載體pET-28a (+) -LITAF ；利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-LITAF ；3)取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a(+) -LITAF，體外誘導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)，利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法鑒定目的蛋白；4)用親和層析柱分離純化目的蛋白，獲得重組的LITAF蛋白。 本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中LITAF編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘中LITAF蛋白的全序列，從而得到的LITAF重組蛋白是利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的三角帆蛘中LITAF蛋白產(chǎn)品，對(duì)人類腫瘤細(xì)胞NCI-H446等腫瘤細(xì)胞具有殺傷性強(qiáng)、特異性高、安全性好、能夠大量生產(chǎn)、易于貯存等優(yōu)點(diǎn)，LITAF重組蛋白可以用于制備新型基因工程抗癌藥物，防治人類癌癥，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本實(shí)施例的一種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQ ID NO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQID NO. 2所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列。一種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的引物序列，具有序列表中SEQID NO. 3所示的用于擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。一種脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，包括如下步驟
I、PCR擴(kuò)增剪取三角帆蛘的外套膜組織，用液氮研磨后，用TRIzoI (上海生工，加拿大)法提取三角帆蛘的的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工，加拿大)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得三角帆蛘的cDNA。以該cDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增LITAF蛋白基因的引物，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列，所述的引物具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的序列作為目的片段進(jìn)行擴(kuò)增；進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)為95°C預(yù)變性4min ;35 個(gè)循環(huán)94°C 30 sec, 52°C 30sec, 72°C 45 sec ；72°C 10 min ;得到編碼 LITAF蛋白的基因全序列。2.重組表達(dá)載體pET-28a(+)-LITAF的構(gòu)建將得到的PCR產(chǎn)物與pMD19_T載體(TAKARA,日本)相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞(天根生物，德國(guó))，涂布含氨芐青霉素的LB (上海生工，加拿大)篩選平板，挑若干個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定；取一經(jīng)鑒定過(guò)的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以堿裂解法抽提質(zhì)粒，將純化后的質(zhì)粒以和通ol限制性內(nèi)切酶(上海生工，加拿大)雙酶切，再插入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pET_28a(+)載體(Novagen，美國(guó))的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3) (Novagen，美國(guó))。利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-LITAF。3.重組蛋白的表達(dá)與鑒定將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a(+)_LITAF
轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3) (Novagen，美國(guó))感受態(tài)，涂布含卡那霉素的LB(上海生工，加拿大)平板，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液(上海生工，力口拿大)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取適量菌液，按1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG(上海生工，加拿大)(終濃度在0-1.0 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)8h，離心收集菌體。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后，離心分離上清液和沉淀，再分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定目的蛋白。4.重組蛋白的純化與抗體制備利用組氨酸親和層析柱(Novagen公司，美國(guó))對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。用上述方法大量制備超聲裂解的菌液，離心分離上清液，進(jìn)行蛋白的純化和洗脫操作，再進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳鑒定，所制備得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2 所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。。挑選體重約I. 5 kg的健康新西蘭白雄兔進(jìn)行免疫。經(jīng)過(guò)一次初始免疫和兩次加強(qiáng)免疫后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，保存于_80°C。5.蛋白質(zhì)定量與抗體效價(jià)的檢測(cè)按Brad-ford法進(jìn)行蛋白定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976，72:248-254)o免疫后的兔抗血清用ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，具體操作步驟如下
(I)包被與封閉用包被緩沖液將蛋白稀釋至1-10 U g/ml0在每個(gè)
聚苯乙烯酶標(biāo)板(上海生工，加拿大)的反應(yīng)孔中加0. I ml，4°C過(guò)夜。棄去孔內(nèi)溶液，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗3次，每次3 min。(2)上樣加指定稀釋倍數(shù)的
待檢樣品(待檢測(cè)的抗血清稀釋于PBST) 0.1 ml于上述已包被的反應(yīng)孔中，置37°C孵育I h，PBST洗3次，每次3 min (同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。(3)加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(上海生工，加拿大)0. Iml, 370C I h，PBST洗3次，每次3 min。(4)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的OPD底物溶液
0. I ml，37°C顯色10-30分鐘。(5)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2 M反應(yīng)終止液0. 05ml。 (6)結(jié)果分析用酶標(biāo)儀490 nm測(cè)各孔OD值，大于規(guī)定的陰性
對(duì)照OD值的2. I倍，即為陽(yáng)性。計(jì)算抗體效價(jià)公式(樣本OD值-空白對(duì)照OD值)/(陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照OD值)。6. Western蛋白印跡Western蛋白印跡操作參照文獻(xiàn)(Sambrook J, RussellDW著.黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第3版.北京科學(xué)出版社,2002. (SambrookJ，Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001)進(jìn)行，具體如下
(I)蛋白質(zhì)樣品先進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(2)轉(zhuǎn)膜(電轉(zhuǎn))電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，浸入轉(zhuǎn)膜
緩沖液平衡20 min。預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15min。轉(zhuǎn)膜裝置的搭建按從下至上順序依次為陰極塑料板、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙和陽(yáng)極塑料板。濾紙、凝膠和膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，吸干多余的液體。恒壓40V，轉(zhuǎn)移 2. 5h。(3)免疫雜交反應(yīng)a.用PBST洗膜3次，每次lOmin。b.加入封閉液，室溫輕搖2h。c.棄封閉液，用PBST洗膜3次，每次lOmin。d.將膜轉(zhuǎn)入一抗雜交液(抗血清按預(yù)定比例稀釋于封閉液)，室溫2 h。陰性對(duì)照中以免疫前的血清取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。e.棄雜交液，用PBST洗膜3次，每次lOmin。f.將膜轉(zhuǎn)入二抗雜交液(辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗按合適稀釋比例稀釋于PBST)，室溫輕搖2h。g.棄雜交液，用PBS洗膜3次，每次lOmin。h.加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。LITAF重組蛋白抗腫瘤活性檢測(cè)
本實(shí)施列中LITAF重組蛋白抗腫瘤活性檢測(cè)(1) NCI-H446細(xì)胞株(南京凱基，中國(guó))懸浮生長(zhǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%小牛血清(四季青，中國(guó))、lmmol/L谷胺酰胺(四季青，中國(guó))、青鏈霉素(四季青，中國(guó))各100U/L。于37°C，5%C02的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每2-3d傳代I次，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)將純化的LITAF重組蛋白，加入NCI-H446細(xì)胞中至100ng/ml，分別培養(yǎng)24h。(3)離心收集細(xì)胞，分別用以下兩種方法鑒定NCI-H446細(xì)胞的凋亡用分別含I U g/ml的FITC- Annexin V (聯(lián)科生物，中國(guó))和PI (聯(lián)科生物，中國(guó))標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；用DNA提取試劑盒(碧云天，中國(guó))提取DNA檢測(cè)DNA ladder的形成。三角帆蛘LITAF重組蛋白24h內(nèi)平均可起近15%的NCI-H446細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有很強(qiáng)的抗癌作用。
通過(guò)本實(shí)施例設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中LITAF編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘中LITAF蛋白的全序列，從而得到的LITAF重組蛋白是利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的三角帆蛘中LITAF蛋白產(chǎn)品，對(duì)人類腫瘤細(xì)胞NCI-H446等腫瘤細(xì)胞具有殺傷性強(qiáng)、特異性高、安全性好、能夠大量生產(chǎn)、易于貯存等優(yōu)點(diǎn)，LITAF重組蛋白可以用于制備新型基因工程抗癌藥物，防治人類癌癥，具有廣闊的市場(chǎng)前景。序列表
SEQ ID NO. I來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的核酸全序列ATGGAGAAGTCAGGACCTCCACCAAGCTACAGTGGCCCCCCACCATCCTACCAGGGCCAAACAAGTTCGTCAACAGTTGTATTTGCACATCAACAACCGACTTTGGTGGCAGTTCAGTTGTTTAGGGAAACACCCGTTCGAGTCACATGCCAATATTGCGGAAGTGACGTTTTCACTTCTACAATGTTTGAAACAGGAACCATCACTTGGTTGGCATGCGCAGTAACAGCCTTCGTTGGTTGCTGGTTAGGCTGTTGTCTGATCCCGTTCTGTGTGGACGGCTGTAAGGACGTGGTCCATTCCTGTCCCAACTGTCGACAGGTGCTCAGCCGCTACGACAGAATCTAA
SEQ ID NO. 2來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的氨基酸序列MEKSGPPPSYSGPPPSYQGQTSSSTVVFAHQQPTLVAVQLFRETPVRVTCQYCGSDVFTS TMFETGTITffLACAVTAFVGCWLGCCLIPFCVDGCKDVVHSCPNCRQVLSRYDRISEQ ID NO. 3
LITAFf :5，-ATGGAGAAGTCAGGACC-3，
LITAFr :5’ -TTAGATTCTGTCGTAGCG-3’
權(quán)利要求
1.ー種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的全序列，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列。
2.ー種三角帆蛘的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的引物序列，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的用于擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列。
3.—種如權(quán)利要求I所述的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟 以三角帆蛘的cDNA為模板，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段，進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；再通過(guò)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+) -LITAF,體外誘導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)；最后分離純化目的蛋白，獲得重組的LITAF蛋白，所制備得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. I所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的來(lái)自于三角帆蛘體內(nèi)特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟具體為1)以三角帆蛘的cDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增LITAF蛋白基因的引物，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段，進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，得到編碼LITAF蛋白的基因全序列；2)利用基因重組技術(shù)將LITAF基因片段克隆到合適的pMD19-T載體中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28 (a)原核表達(dá)載體相連接，獲得表達(dá)重組載體pET-28a (+) -LITAF ;利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-28a(+) -LITAF ;3)取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET_28a(+) -LITAF，體外誘導(dǎo)LITAF蛋白表達(dá)，利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法鑒定目的蛋白；4)用親和層析柱分離純化目的蛋白，獲得重組的LITAF蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種三角帆蚌的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQIDNO.1所示的來(lái)自于三角帆蚌體內(nèi)的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQIDNO.2所示的來(lái)自于三角帆蚌體內(nèi)的LITAF蛋白的氨基酸序列；一種三角帆蚌的脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子蛋白的引物序列，具有序列表中SEQIDNO.3所示的用于擴(kuò)增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列，及其蛋白的制備方法。通過(guò)本發(fā)明得到的LITAF重組蛋白可以用于制備新型基因工程抗癌藥物，防治人類癌癥，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102977202SQ20121048053
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者楊受保 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院