專利名稱：一種弧菌交叉保護性抗原及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程及免疫學領域，具體地說，涉及一種弧菌交叉保護性抗原及其制備方法和應用。
背景技術：
弧菌屬(Vibrio)廣泛分布于自然界，尤以水中為多，有100多種。主要致病菌可引起霍亂或食物中毒。
弧菌的外膜蛋白在其致病過程起著非常重要的作用，是一種良好的免疫原；孔蛋白作為主要的外膜蛋白之一，是弧菌交叉保護性疫苗的熱門研究對象也是弧菌高效免疫原的熱門研究對象。一些孔蛋白如0mpK、0mpU和OmpV，其基因序列在弧菌中具有很好的保守性，作為抗原時，具有良好的免疫原性和免疫保護性，而OmpK更是被證明具有良好的交叉保護性。
麥芽糖孔蛋白(maltoporin),是一個與麥芽糖、麥芽糊精的運輸相關的孔蛋白。根據(jù)其噬菌體的受體特性命名為LamB。LamB蛋白質的生理功能和蛋白結構研究比較成熟，但是其免疫學性質研究較少，未見到有LamB蛋白作為抗原的相關報道。評價弧菌LamB基因序列的保守性，免疫原性和交叉免疫保護作用，將有助于探討開發(fā)弧菌麥芽糖孔蛋白LamB 作為交叉保護性抗原的應用價值。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種弧菌交叉保護性抗原及其制備方法和應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明將弧菌的麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB經(jīng)過基因克隆、原核表達和產物制備，得到重組的麥芽糖孔蛋白LamB，該重組蛋白可以作為弧菌的交叉保護性抗原應用到水產養(yǎng)殖中。
本發(fā)明的目的是提供一種麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB，該基因具有如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
本發(fā)明根據(jù)已有的LamB序列，設計簡并引物獲得了溶藻弧菌ATCC33787 (Vibrio algin。Iyticus)、副溶血弧菌ATCCl7802(Vibrio parahaem。lyticus)、副溶血弧菌VPL4-90 (Vibrio parahaemolyticusVPL4_90)、擬態(tài)弧菌ATCC33653(Vibrio mimicus)、非01 霍亂弧菌(Vibrio cholerae VbO)、河弧菌ATCC33810(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌ATCC33813 (Vibrio furnissii)和哈維氏弧菌 NBRC15634 (Vibrio harveyi)的基因 LamB。
簡并引物序列如下
LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
其中，溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，副溶血弧菌ATCC17802的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，副溶血弧菌VPL4-90的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，擬態(tài)弧菌ATCC33653的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，非01霍亂弧菌的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，河弧菌ATCC33810的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，弗尼斯弧菌ATCC33813的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，哈維氏弧菌NBRC15634的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC17802、擬態(tài)弧菌ATCC33653、河弧菌 ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813和哈維氏弧菌NBRC15634六株弧菌為標準菌株，保藏于美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC和日本技術評價研究所生物資源中心NBRC。副溶血弧菌 VPL4-90和非01霍亂弧菌購買于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
本發(fā)明的目的是提供一種麥芽糖孔蛋白LamB，該蛋白是由上述麥芽糖孔蛋白編碼基因編碼的。
本發(fā)明的目的是提供一種來源于溶藻弧菌ATCC33787的麥芽糖孔蛋白編碼基因 LamB編碼的LamB蛋白，該麥芽糖孔蛋白具有如SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的目的是提供一種重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備方法，該方法包括如下步驟
(I)麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克??；
(2)大腸桿菌表達載體pET32_LamB的構建；
(3)大腸桿菌重組菌BL21-pET32_LamB的構建；
(4)重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備。
具體的，本發(fā)明提供的一種重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備方法，該方法包括如下步驟
(I)麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克隆設計簡并引物，以弧菌的基因組DNA為模板，進行PCR，得到麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB ;然后將其連至pMD19_T中，構建大腸桿菌克隆載體pMD19-T-LamB ;將該載體轉化至DH5 α感受態(tài)細胞，構建大腸桿菌重組菌 DH5 a -pMD19-T-LamB，測序；其中簡并引物序列如下
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
(2)大腸桿菌表達載體pET32_LamB的構建設計表達引物，以克隆載體 pMD19-T-LamB為模板，進行PCR，將得到的LamB基因與表達載體pET32a(+)用BamH I和 Xho I進行雙酶切，連接，構建大腸桿菌表達載體pET32-LamB ;其中表達引物序列如下
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ ；
(3)大腸桿菌重組菌BL21-pET32_LamB的構建將(2)中的大腸桿菌表達載體 pET32-LamB轉化BL21感受態(tài)細胞，得到大腸桿菌重組菌BL21-pET32_LamB ；
(4)重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備在液體LB (含100 μ g/ml的氨芐青霉素)培養(yǎng)基中按1%比例接入培養(yǎng)過夜的(3)中的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C 培養(yǎng)至0D600=0. 6后加入ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C溫度進行誘導表達6h ;收集菌體，純化包涵體，包涵體純化液直接過鎳NTA瓊脂糖凝膠FF柱，親和層析純化重組酶，咪唑梯度競爭洗脫，得到純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB。
本發(fā)明的目的是提供一種由上述方法制備的重組麥芽糖孔蛋白LamB，所述重組麥芽糖孔蛋白LamB可以作為弧菌的交叉保護性抗原應用到水產養(yǎng)殖中。
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的簡并引物
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’ ；
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ;R=A/G。
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的表達引物
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ 。
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌克隆載體 pMD19-T_LamB0
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌重組菌 DH5 ct -pMD19_T_LamB。
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌表達載體 pET32_LamB0
本發(fā)明的目的是提供制備重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌重組菌 BL21-pET32-LamB。
具體地，本發(fā)明的目的是提供一種含有前述麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的大腸桿菌克隆載體。
優(yōu)選地,上述克隆載體為一種大腸桿菌克隆載體pMD19-T_LamB,該載體含有麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB。S卩，將溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC17802、副溶血弧菌 VPL4-90、擬態(tài)弧菌ATCC33653、非01霍亂弧菌、河弧菌ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813 和哈維氏弧菌NBRC15634的基因LamB用于制備大腸桿菌克隆載體pMD19-T_LamB。
本發(fā)明的目的是提供一種含有上述克隆載體的宿主細胞。
優(yōu)選地，上述含有克隆載體的宿主細胞為大腸桿菌重組菌DH5 a -PMD19-T_LamB， 該重組菌含有大腸桿菌克隆載體pMD 19-T-LamB。即，將含有溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCCl 7802、副溶血弧菌VPL4-90、擬態(tài)弧菌ATCC33653、非OI霍亂弧菌、河弧菌 ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813和哈維氏弧菌NBRC15634的編碼基因LamB的克隆載體 pMD 19-T-LamB用于制備大腸桿菌重組菌DH5 a -pMD19-T_LamB。
本發(fā)明的目的是提供一種含有前述麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的大腸桿菌表達載體。即，以前述大腸桿菌克隆載體pMD19-T-LamB為模板，設計引物，進行PCR，構建大腸桿菌表達載體pET32_LamB。
本發(fā)明的目的是提供一種含有上述表達載體的宿主細胞，該宿主細胞為大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB，能夠表達生產重組麥芽糖孔蛋白。
優(yōu)選地，本發(fā)明的目的是提供一種含有溶藻弧菌ATCC33787的麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的大腸桿菌表達載體。該大腸桿菌表達載體pET32_LamB含有溶藻弧菌ATCC33787 的麥芽糖蛋白編碼基因LamB。S卩，以含有溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的大腸桿菌克隆載體pMD19-T-LamB為模板，構建大腸桿菌表達載體pET32_LamB。
優(yōu)選地，本發(fā)明的目的是提供一種含有溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的大腸桿菌表達載體的宿主細胞，即大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB，將含有溶藻弧菌ATCC33787 的編碼基因LamB的表達載體pET32_LamB用于制備大腸桿菌重組菌BL21-pET32_LamB，該重組菌能夠表達生產重組麥芽糖孔蛋白LamB。
本發(fā)明的目的是提供所述重組麥芽糖孔蛋白LamB在制備弧菌交叉保護性疫苗中的應用。
本發(fā)明的目的是提供一種弧菌交叉保護性疫苗，該疫苗含有所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB。接種所述弧菌交叉保護性疫苗后，機體即可獲得對多種弧菌的保護性。
本發(fā)明的目的是提供所述重組麥芽糖孔蛋白LamB在制備治療弧菌病藥物中的應用。
本發(fā)明的目的是提供治療弧菌病的藥物，該藥物含有所述的重組麥芽糖孔蛋白 LamB0
本發(fā)明的目的是提供所述重組麥芽糖孔蛋白LamB在制備抗體中應用。
本發(fā)明的目的是提供所述重組麥芽糖孔蛋白LamB為免疫原制備的抗體。
抗體可由重組麥芽糖孔蛋白LamB免疫兔子得到的抗血清純化得到。
本發(fā)明的目的是提供一種由所述重組麥芽糖孔蛋白LamB制備的兔抗血清。該兔抗血清對多種弧菌具有交叉反應性。
本發(fā)明的目的是提供一種所述兔抗血清的制備方法調整重組麥芽糖孔蛋白 LamB至蛋白終濃度為2mg/mL，將處理好的重組蛋白溶液與等體積的弗氏佐劑混合，漩渦震動充分乳化成〃油包水〃乳狀劑。鑒定方法是將乳化劑滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。以乳化處理后的重組蛋白LamB免疫新西蘭大白兔。首次免疫時，重組蛋白LamB與等體積的弗氏完全佐劑乳化，背部皮下多點注射， 隔兩周加強免疫一次，加強免疫時，重組蛋白LamB與弗氏不完全佐劑乳化。第二次加強免疫后第八天由耳緣動脈取血lmL，測定血清效價。達到滿意效價后，頸動脈放血。離心分離血清，小管分裝，冷凍保存。
本發(fā)明的目的是提供上述抗體在制備用于檢測弧菌病的診斷試劑中的應用。
本發(fā)明的目的是提供含有上述抗體的用于檢測弧菌病的診斷試劑。
本發(fā)明的目的是提供上述抗體在制備用于檢測弧菌病的診斷試劑盒中的應用。
本發(fā)明的目的是提供含有上述抗體的用于檢測弧菌病的診斷試劑盒。該診斷試劑盒含有前述診斷試劑。
上述診斷試劑及診斷試劑盒為利用其含有的抗體，經(jīng)ELISA法可檢測弧菌。
本發(fā)明的另一目的是提供所述疫苗、治療弧菌病的藥物、抗體、診斷試劑及診斷試劑盒在評價弧菌LamB基因序列保守性、重組麥芽糖孔蛋白LamB免疫原性和交叉免疫保護作用中的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點如下
I)本發(fā)明利用基因工程技術獲得了一種重組麥芽糖孔蛋白LamB，該重組蛋白可以制備弧菌交叉保護性疫苗、治療弧菌病的藥物、抗體、診斷試劑及診斷試劑盒。
2)重組蛋白LamB制備的兔抗血清對多種弧菌具有交叉反應性和被動免疫保護作用，重組蛋白LamB本身作為抗原，在以斑馬魚為免疫模型中，對多種弧菌具有交叉保護性， 因此本發(fā)明的重組蛋白LamB可以作為弧菌的交叉保護性抗原應用到實際養(yǎng)殖中。
3)本發(fā)明的大腸桿菌重組菌株BL21-pET32_LamB能夠大量的表達具有天然免疫活性的重組LamB蛋白，易于純化，可應用于生產弧菌交叉保護性疫苗，且成本低。
4)本發(fā)明提供的弧菌交叉保護性疫苗、治療弧菌病的藥物、抗體、診斷試劑及診斷試劑盒是首次利用重組麥芽糖孔蛋白LamB制備的，將有助于探討開發(fā)弧菌麥芽糖孔蛋白 LamB制備弧菌交叉保護性疫苗、治療弧菌病的藥物、抗體、診斷試劑及診斷試劑盒的應用價值，對于評價弧菌LamB基因序列的保守性、免疫原性和交叉免疫保護作用有重要意義。


圖I為弧菌LamB基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹；
其中，V.fluvialis ATCC33810 (JF747209)河弧菌 ATCC33810，V. furnissii ATCC33813QF747208)為弗尼斯弧菌 ATCC33813，V. furnissii NCTCl 1218 (CP002378. I) 為弗尼斯弧菌 NCTCl 1218，V. cholerae MJ-1236 (229605062)為霍亂弧菌 MJ-1236, V. cholerae (CP001486. I)為霍亂弧菌，V. cholerae VbO (JF747210)為非 01 霍亂弧菌，V. mimicus ATCC33653 (JF747206)為擬態(tài)弧菌 ATCC33653, V. alginolyticus ATCC33787 (JF747203)為溶藻弧菌ATCC33787, V. parahaemolyticus ATCC17802 (JF747207) 為副溶血弧菌 ATCC17802, V. harveyi NBRC15634 (JF747211)為哈維氏弧菌 NBRC15634, V. harveyi ATCC BAA-1116 (CP000790. I)為哈維氏弧菌 ATCCBAA-1116，V. alginolyticus (EU625279. I)為溶藻弧菌，Vibriosp. Ex25 (CP001806. I)為 Ex25 弧菌，V. parahaemolyticus VPL4-90 (JF904926. I)為副溶血弧菌 VPL4-90，Cluster A 為基因簇 A， ClusterB為基因簇B，Cluster C為基因簇C，括號內均為各菌株的NCBI序列的登入號；
圖2為本發(fā)明實施例4中純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB的SDS-PAGE電泳結果；
其中，M為蛋白Marker，I為純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB，其分子量為59. 4kDa ；
圖3為本發(fā)明實施例5的重組麥芽糖孔蛋白LamB的兔抗血清的Western blotting分析結果；
其中，I為?；【?V.pelagius) ;2為需鈉弧菌(V. natriegens) ;3為弗尼斯弧菌(V. furnissii) ；4為河弧菌(V. fluvialis) ；5為擬態(tài)弧菌(V. mimicus) ；6為創(chuàng)傷弧菌 (V. vulnificus) ；7 為溶藻弧菌(V. alginolyticus) ；8 為霍亂弧菌(V. cholera) ；9 為副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) ； 10 為副溶血弧菌 VPL4-90 (V. parahaemolyticus4-90)； 11 為解蛋白弧菌(V. proteoIyticus) ；12 為大腸桿菌 DH5 α (E. coliDH5 α ) ;13 為金黃色葡萄球菌(S. aureus) ；14為枯草芽孢桿菌(B. subtilis) ;15為嗜水性氣單胞菌 (A. hydrophilic) ；16 為鰻弧菌(V. anguillarum) ；17 為燦爛弧菌(V. splendidus) ；18 為坎氏弧菌(V. campbellii) ；19為麥契尼可夫弧菌(V. metschnikovii) ；20為哈維氏弧菌 (V. harveyi) ；21 為美人魚弧菌(V. damsela) ；22 為費氏弧菌(V. fischeri)。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明中所用的試劑或實驗材料均為常規(guī)的分子生物學實驗用試劑或實驗材料，均為市售產品。
實施例I麥芽糖孔蛋白基因LamB的克隆
根據(jù)副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) RIMD2210633的麥芽糖孔蛋白前體蛋白(Maltoporin,簡稱LamB)基因序列(登錄號為NP_801154)，綜合其他弧菌LamB基因序列，設計簡并引物，合成引物。分別以八株弧菌的基因組DNA為模板，進行PCR。簡并引物序列如下
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
反應體系(25yL) :1 μ LDNA模板，I μ L正向引物，I μ L反向引物,9. 5 μ L雙蒸水,12.5μ L2XTaq PCR Master mix。
反應條件95°C預變性5min，然后 95°C 30s,58°C 45s，72°C lmin，30 個循環(huán)。反應結束后整體延伸lOmin。
將PCR產物通過試劑盒回收得到麥芽糖孔蛋白基因LamB ;然后將其連至pMD19_T 中，構建重組克隆子pMD19-T-LamB ;轉化至DH5a感受態(tài)細胞，在預置的含有Amp和異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)、X-gal的LB瓊脂平板上涂布，通過藍白斑篩選陽性克隆子， PCR驗證后測序。測序結果去除載體序列后的開放閱讀框為
溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的核苷酸序列如SEQ IDN0. I所示；副溶血弧菌 ATCC17802的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；副溶血弧菌VPL4-90的基因 LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；擬態(tài)弧菌ATCC33653的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；非01霍亂弧菌的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；河弧菌ATCC33810的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；弗尼斯弧菌ATCC33813的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；哈維氏弧菌NBRC15634的基因LamB的核苷酸序列如SEQ IDN0. 8所示。
弧菌LamB基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹如圖I所示。
實施例2大腸桿菌表達載體pET32_LamB的構建
由實施例I所得到溶藻弧菌的LamB基因克隆序列，設計去掉信號肽的表達引物， 合成該引物，引物序列如下
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’
以由實施例I所得到LamB重組克隆質粒pMD19-T_LamB為模板，進行PCR，反應條件如下
反應體系(25yL) :1 μ LDNA模板，I μ L正向引物，I μ L反向引物,9. 5 μ L雙蒸水,12.5μ L2XTaq PCR Master mix。
反應條件95°C預變性5min，然后 95°C 30s,58°C 45s，72°C lmin，30 個循環(huán)。反應結束后整體延伸lOmin。
將PCR產物回收，使用所得到的LamB基因以及表達載體pET32a(+)分別用BamH I 和Xho I進行雙酶切條件如下
反應體系(20μ L):雙蒸水 10 μ L，10 X K Buffer2 μ L，基因 LamB (或者 pET32a (+)質粒DNA)6y L，BamHl μ L, Xho I I μ L，在37°C下酶切2小時。電泳后分別回收大小約為 I. 2kb和5. 9kb的目的片段。二者分別為LamB基因以及表達載體pET32a(+)。
然后用T4連接酶將二者連接，反應條件如下
反應體系(IOyL):1.21*片段5 4 1^，5.91*片段3 4 1^，10\了4連接酶81^€61'14 1^ T4連接酶lyL，在16°C下酶連8小時以上。即可以得到大腸桿菌表達載體pET32_LamB。
實施例3大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB的構建
取由實施例2得到的大腸桿菌表達載體pET32-LamB5y L加入到50 μ L BL21感受態(tài)細胞中，冰上放置30min ;然后放入42°C熱激90秒；快速將EP管轉移到冰浴中15min ； 然后每管加入350 μ L LB培養(yǎng)基，將管轉移至37°C搖床，緩慢振搖60min使細菌復蘇；取 50 μ L復蘇后的菌液涂布于含Amp以及X-Gal和IPTG的固體LB平板上；倒置平皿，于37°C 恒溫培養(yǎng)24h ;最后挑取白色單菌落用于PCR檢測，得到大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB。
實施例4重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備
在液體LB (含100 μ g/ml的氨芐青霉素)培養(yǎng)基中按1%比例接入培養(yǎng)過夜的由實施例3得到的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C培養(yǎng)至0D600=0. 6后加入 ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C溫度進行誘導表達6h。收集菌體，純化包涵體，由于重組蛋白含有6 X HIS標簽，包涵體純化液直接過鎳NTA瓊脂糖凝膠FF柱，親和層析純化重組酶，咪唑梯度競爭洗脫，純化過程參照HIS純化Kit說明書。純化后的瓊膠酶利用BCA法測定蛋白濃度，通過用12%SDS-PAGE檢測重組LamB蛋白的純度及分子量，結果見圖2。純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB保存于_20°C以備用，該重組麥芽糖孔蛋白LamB即為弧菌交叉保護性抗原。
實施例5重組麥芽糖孔蛋白LamB的交叉免疫反應性分析
動物飼養(yǎng)新西蘭大白兔購買回來后,在生物系動物房飼養(yǎng)一周，使其適應實驗室條件。每日以實驗動物兔飼料喂食2次，早晚各一次，每次喂食量以約15min吃完為宜。
免疫原的準備由實施例4得到的純化的重組LamB蛋白，采用Bradford法測定其蛋白濃度，并調整至蛋白終濃度為2mg/mL，即可作為免疫抗原使用。處理后的抗原蛋白溶液于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。處理好的重組蛋白溶液與等體積的弗氏佐劑混合，漩渦震動充分乳化成〃油包水〃乳狀劑。鑒定方法是將乳化劑滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。
兔抗血清的制備以乳化處理后的重組蛋白LamB免疫新西蘭大白兔。免疫前，由兔耳緣動脈取血留作陰性血清。首次免疫時，抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化，背部皮下多點注射，免疫劑量約為250 μ g蛋白/kg兔。隔兩周加強免疫一次，加強免疫時，抗原與弗氏不完全佐劑乳化。第二次加強免疫后第八天由耳緣動脈取血lrnL，測定血清效價。運用 Dot-ELISA法測其效價，達到滿意效價后，頸動脈放血。離心分離血清，小管分裝，冷凍保存。
重組蛋白兔抗血清與弧菌外膜蛋白的交叉反應以重組蛋白LamB的抗血清作為一抗，分別與18株弧菌標準菌株以及3株非弧菌的菌體總蛋白反應，進行Western blotting分析，結果見圖3。
實施例6重組麥芽糖孔蛋白LamB交叉免疫保護性分析
以斑馬魚為模型評價重組麥芽糖孔蛋白LamB的交叉免疫保護性。
斑馬魚飼養(yǎng)用充分曝氣的自來水飼養(yǎng)，保持水溫在26±2°C左右，在增氧條件下生活I周以上以適應環(huán)境。每日清晨換水一次，上午和下午各喂飼一次，喂食量以5min吃完為宜。
菌株LD50的計算病原弧菌(副溶血弧菌VPL49-0、副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維氏弧菌、弗尼斯弧菌)活化后培養(yǎng)，進行計數(shù)并以魚用生理鹽水稀釋至109CFU/mL， 然后十倍梯度稀釋至106CFU/mL。每組10只斑馬魚，實驗組每只斑馬魚注射10 μ L菌液，對照組注射10 μ L生理鹽水。參照Reed-Mueneh的方法計算弧菌對斑馬魚的半數(shù)致死量LD50。 計算公式如下
lgLD50=lg高于50%死亡率的細菌稀釋度+距離比例X Ig稀釋系數(shù)
距離比例=(高于50%的死亡率-50%) / (高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)
重組蛋白兔抗血清被動保護實驗健康的斑馬魚被隨機分組，每組30條。實驗組的斑馬魚腹腔注射重組蛋白LamB的兔抗血清，注射量為10 μ L/每只，對照組注射等體積量的生理鹽水。2h后，采用500倍LD50的病原弧菌(溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌 ATCC17802、副溶血弧菌VPL4-90和擬態(tài)弧菌ATCC33653)菌液進行攻毒，5天內觀察實驗組和對照組斑馬魚的存活情況，記錄死亡魚類的數(shù)目。計算相對存活率RPS
相對存活率(RPS) = (I-免疫組死亡魚數(shù)/對照組死亡魚數(shù))X 100%
結果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白的兔抗血清對多株弧菌具有被動免疫保護作用，實驗結果見表I。
表I
攻毒弧菌對照組累計死亡百分比實驗組累計死亡百分比相對成活率(RPS)副溶血弧菌 VPL4-9080.0% (24/30)50.0%(]5/30)37.5%副溶血弧菌 ATCC 丨 780293.3%(28/30)43.3%(13./30)53.6%溶藻弧菌 ATCC 3378790.0% (27/30)53.3%(16/30)40.7%擬態(tài)弧菌 ATCC 3365380.0%(24/30)56.7%(17/30)29.2%
斑馬魚的主動免疫實驗首次免疫，每只斑馬魚腹腔注射5 μ L由實施例5得到的 2mg/ml的重組蛋白LamB抗原。首次免疫后，每隔一周進行一次加強免疫。第二次加強免疫兩周后，隨機選擇3-5條斑馬魚，收集血液，以dot-ELISA法檢測魚體內產生抗體的情況，如達到理想效價即可進行攻毒實驗。以生理鹽水替代重組蛋白LamB抗原，注射劑量和操作相同來作為對照組。
攻毒活化復毒后的弧菌，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。離心收集菌體，以滅菌的魚用生理鹽水洗滌3次，去除培養(yǎng)基中有毒的成分。最后用生理鹽水重懸，進行細菌計數(shù)。采用平板計數(shù)法和血球計數(shù)法進行計數(shù)，并用生理鹽水調整細菌濃度，以500倍LD50的菌液(溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCCl 7802、副溶血弧菌VPL4-90、擬態(tài)弧菌ATCC33653、哈維氏弧菌NBRC15634和弗尼斯弧菌ATCC33813)注射斑馬魚進行攻毒，并觀察攻毒后5天內各組魚體的生長和病變情況，記錄死亡魚類的數(shù)目。計算相對存活率RPS，綜合魚類病理損傷分析， 從而評價疫苗的效果，其具有對多種弧菌的交叉中和保護性，實驗結果見表2。
表 權利要求
1.一種麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB，其特征在于，該基因具有如SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
2.一種重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備方法，該方法包括如下步驟 (1)麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克?。? (2)大腸桿菌表達載體pET32-LamB的構建； (3)大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB的構建； (4)重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (O麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB的克隆設計簡并引物，以弧菌的基因組DNA為模板，進行PCR，得到麥芽糖孔蛋白編碼基因LamB ;然后將其連至pMD19_T中，構建大腸桿菌克隆載體pMD19-T-LamB ;將該載體轉化至DH5 α感受態(tài)細胞，構建大腸桿菌重組菌DH5 a -pMD19-T-LamB，測序；其中簡并引物序列如下LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’其中，S=C/G ；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ； (2)大腸桿菌表達載體pET32-LamB的構建設計表達引物，以克隆載體pMD19-T_LamB為模板，進行PCR，將得到的LamB基因與表達載體pET32a(+)用BamH I和Xho I進行雙酶切，連接，構建大腸桿菌表達載體pET32-LamB ;其中表達引物序列如下LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ ； (3)大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB的構建將(2)中的大腸桿菌表達載體pET32-LamB轉化BL21感受態(tài)細胞，得到大腸桿菌重組菌BL21-pET32_LamB ； (4)重組麥芽糖孔蛋白LamB的制備在液體LB(含100 μ g/ml的氨芐青霉素)培養(yǎng)基中按1%比例接入培養(yǎng)過夜的(3)中的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C培養(yǎng)至0D600=0. 6后加入ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C溫度進行誘導表達6h ;收集菌體，純化包涵體，包涵體純化液直接過鎳NTA瓊脂糖凝膠FF柱，親和層析純化重組酶，咪唑梯度競爭洗脫，得到純化的重組麥芽糖孔蛋白LamB。
4.由權利要求2或3所述的方法制備的重組麥芽糖孔蛋白LamB。
5.制備權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌表達載體pET32_LamB。
6.制備權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB的大腸桿菌重組菌BL21-pET32-LamB。
7.一種弧菌交叉保護性疫苗，其特征在于，該疫苗含有權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB。
8.治療弧菌病的藥物，其特征在于，該藥物含有權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB0
9.以權利要求4所述的重組麥芽糖孔蛋白LamB為免疫原制備的抗體。
10.含有權利要求9所述抗體的用于檢測弧菌病的診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種弧菌交叉保護性抗原及其制備方法和應用，該抗原為弧菌重組的麥芽糖孔蛋白LamB，本發(fā)明的制備方法能夠大量的表達具有天然免疫活性的重組麥芽糖孔蛋白LamB，易于純化，且成本低。本發(fā)明的LamB蛋白作為外膜主要蛋白在各種弧菌中廣泛存在，序列具有很好的保守性，其本身作為抗原，在以斑馬魚為免疫模型中，對多種弧菌具有交叉保護性，其兔抗血清對多種弧菌具有交叉反應性和被動免疫保護作用，因此本發(fā)明的重組麥芽糖孔蛋白LamB可以作為弧菌的交叉保護性抗原應用到水產養(yǎng)殖中。
文檔編號C12R1/19GK102978219SQ20121044790
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權日2012年11月9日
發(fā)明者胡忠, 夏常艷, 倫鏡盛, 袁傳飛 申請人:汕頭大學