專利名稱：α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的重組菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于淀粉酶的分離表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α淀·粉酶，以及該α淀粉酶在絲狀真菌宿主細(xì)胞(諸如黑曲霉(Aspergillus niger)中的異源表達(dá)。
背景技術(shù)：
α淀粉酶(E. C. 3. 2.1.1)能夠催化寡糖和多糖中的1，4_ α -糖苷鍵的內(nèi)水解，其以隨機(jī)的方式作用于淀粉、糖原以及相關(guān)多糖和寡糖，釋放出α構(gòu)型的還原基團(tuán)。目前α淀粉酶廣泛的用于多種工業(yè)用途，例如烘焙糕點、釀酒、玉米漿和乙醇生產(chǎn)以及醋發(fā)酵等領(lǐng)域。α淀粉酶的來源非常廣泛，可以從動物、植物和微生物中分離出來。其中微生物來源的淀粉酶具有來源豐富、性能多樣和易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，可滿足多種工業(yè)應(yīng)用需求，在工業(yè)上的應(yīng)用也最為廣泛。在現(xiàn)代工業(yè)的淀粉質(zhì)處理過程中，微生物淀粉酶的水解方法已經(jīng)徹底取代傳統(tǒng)的化學(xué)水解方法。雖然有多種微生物可以產(chǎn)生α淀粉酶，包括絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌等。但是，目前能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求的α淀粉酶主要來源于細(xì)菌和絲狀真菌，細(xì)菌α淀粉酶通常來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)，真菌α淀粉酶通常來源于曲霉菌屬(Aspergillus)。其中由真菌產(chǎn)生的α淀粉酶即稱為真菌α淀粉酶。在目前已報道的文獻(xiàn)中，可以粗略的按酶學(xué)性質(zhì)或作用條件將真菌α淀粉酶分為3種類型(I)中性真菌α淀粉酶與細(xì)菌α淀粉酶不同，真菌α淀粉酶的來源相對較少，大多數(shù)真菌α淀粉酶的作用溫度和PH都比較溫和，如最適作用pH在5. O 5. 5之間，最適作用溫度為50 55°C左右，當(dāng)溫度超過60°C酶開始失活。目前商品化生產(chǎn)最多、應(yīng)用也最為廣泛的來源于米曲霉(變種)的α淀粉酶即屬于這一酶種。(2)耐熱或耐酸性真菌α淀粉酶此類酶在pH 2. 5 4. 5之間，作用溫度在超過60°C時仍具有良好的熱穩(wěn)定性。與中性真菌α淀粉酶相比，耐熱或耐酸性真菌α淀粉酶可以簡化液化、糖化過程，減少制糖等淀粉深加工過程中染菌幾率并降低相應(yīng)生產(chǎn)成本。這部分酶種目前工業(yè)上已經(jīng)開始生產(chǎn)使用，且具有很大的開發(fā)利用潛力。(3)具有生淀粉酶活力的真菌α淀粉酶該酶種除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，還具有生淀粉水解能力，在生料酒精行業(yè)的同步糖化發(fā)酵(SSF)中，與糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提聞酒精廣率。已報道有多種α淀粉酶基因在不同宿主中得到表達(dá)，其中真菌α淀粉酶基因的異源表達(dá)主要集中在真核表達(dá)系統(tǒng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)等)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核來源的異源蛋白時具有很大的優(yōu)勢，如翻譯后加工修飾(如糖基化、二硫鍵的形成)、內(nèi)含子的識別、信號肽的剪除和肽鏈的正確折疊與分泌等。此外，有多種真菌表達(dá)系統(tǒng)被美國FDA列為GRAS (generally recognized as safe)菌株，使得對一些食品或醫(yī)藥用異源蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用更易獲得相關(guān)機(jī)構(gòu)的認(rèn)可和批準(zhǔn)。目前，有大量來自曲霉屬(Aspergillus)的α淀粉酶已經(jīng)被報道并用于工業(yè)生產(chǎn)，但是僅有極少數(shù)文獻(xiàn)報道來源于棒曲霉(A. clavatus) α淀粉酶。本發(fā)明從棒曲霉中克隆得到了一種α淀粉酶，并在黑曲霉中克隆表達(dá)，且酶活力大大高于其在野生型中的酶活。另外，由于棒曲霉被認(rèn)為是有毒菌株，而黑曲霉則被認(rèn)為是安全菌(GRAS)，因此本發(fā)明擴(kuò)大棒曲霉的應(yīng)用范圍(如食品領(lǐng)域)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的菌株，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明篩選出的α淀粉酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，其一種編碼mRNA序列為 SEQ ID NO:2。在第二個方面，本發(fā)明涉及酶組合物，其包含上述的α淀粉酶。本發(fā)明另一個方面涉及用于表達(dá)上述α淀粉酶的曲霉菌株；一種表達(dá)α淀粉酶的黑曲霉(Aspergillus niger)Pll菌株，已于2012年9月4日保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株編號為CGMCC No. 6513。本發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá)棒曲霉α淀粉酶AclaPll，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活(AclaPll在野生菌種無可檢測到的酶活)，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的淀粉酶的酶活力。同時，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌(GRAS)黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了 AclaPll的應(yīng)用領(lǐng)域。


圖1 :本發(fā)明使用的pGm質(zhì)粒圖譜；圖2 :蛋白SDS-PAGE凝膠圖，顯示了黑曲霉轉(zhuǎn)化子的AclaPlI的表達(dá)情況，以及野生菌和宿主菌黑曲霉Gl的蛋白表達(dá)情況，其中泳道I所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由左至右為116. OkD, 66. 2kD，45kD和35kD ;泳道2所示為黑曲霉宿主Gl在發(fā)酵5d后的蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為野生菌的蛋白表達(dá)情況，其無可檢測到的蛋白表達(dá)。所示為泳道4AclaPll淀粉酶表達(dá)情況,在55kDa處可以看到清晰蛋白條帶。圖3 :黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的pH穩(wěn)定性；圖4 :黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的溫度穩(wěn)定性。
具體實施例方式本發(fā)明用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等參考書中所記載的技術(shù)。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以選用已公開的技術(shù)來實施本發(fā)明實施例中記載的方案。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,3nd Ed. (Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋，具體如下如本文所用，術(shù)語“淀粉”指植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何物質(zhì)，包括具有(C6HltlO5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)字。具體而言，該術(shù)語指任何基于植物的物質(zhì)，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體而言，小麥、燕麥、玉米、黑麥、稻、高粱、糠、木薯、粟、馬鈴薯和甘薯。如本文所用，術(shù)語“ α淀粉酶”指催化1，4- α -糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述為在含有1，4-α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中完成1，4- a -D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的酶。另一個用于描述這些酶的術(shù)語是“糖原酶(glycogenase) ”。如本文所用，術(shù)語“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體是，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾，或者所述細(xì)胞來自于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然 (非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因，但這些基因異常表達(dá)、表達(dá)不足或者完全不表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以互換使用。本文使用氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。如本文所用，術(shù)語“信號序列”表示結(jié)合與蛋白質(zhì)N-末端部分的氨基酸序列，其促進(jìn)成熟形式的蛋白質(zhì)分泌至細(xì)胞外。信號序列的定義是一種功能性定義。成熟形式的胞外蛋白缺少信號序列，其在分泌過程中被切除。如本文所用，術(shù)語“基因”指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。如本文所用，術(shù)語“核酸”包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物。除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。如本文所用，術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。如本文所用，術(shù)語“載體”指被設(shè)計用來將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。如本文所用，術(shù)語“表達(dá)載體”表示包含DNA序列的DNA構(gòu)建物，所述DNA序列被可操縱的連接于能夠影響該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉(zhuǎn)錄的啟動子、可選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。如本文所用，術(shù)語“啟動子”表示參與結(jié)合RNA聚合酶以啟動基因轉(zhuǎn)錄的的調(diào)控序列。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。如本文所用，當(dāng)描述蛋白或編碼它們的基因是，用于該基因的術(shù)語一般用斜體表示(例如編碼AclaPll淀粉酶的基因可以表示為AclaPll)。用于蛋白的術(shù)語一般不用斜體表示(例如，由AclaPll基因編碼的淀粉酶可以表示為AclaPll)。如本文所用，術(shù)語“來源(derived) ”涵蓋了術(shù)語“源自(originated from)”、“獲得(obtained) ”、“可獲得自(obtainable from)” 以及“分離自(isolated from)”,且如本文所用，其表示由核苷酸序列編碼的多肽由天然存在該核苷酸的細(xì)胞或者已被插入該核苷酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生。
如本文所用，術(shù)語“可操縱的連接(operably linked) ”至并列關(guān)系，其中原件允許它們在功能上相互關(guān)聯(lián)的方式排布。例如。如果啟動子控制某序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子被可操縱地連接于該編碼序列。如本文所用，術(shù)語“選擇性標(biāo)記(selective marker) ”指能夠在宿主中表達(dá)的基因，其使得能夠方便地選擇那些含導(dǎo)入的核酸或載體的宿主。與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，當(dāng)被連配時，在比較這兩個序列時所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。所述連配以及同源性或同一性百分比可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的軟件程序確定，例如BLAST(Altschul et al. Basic local alignment search tool.Journal of MolecularBiology, 1990,215(3) :403-410)。由于遺傳密碼是簡并的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定氨基酸，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。如本文所用，術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼α淀粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。如本文所用，術(shù)語“絲狀真菌”指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見INTRODUCTORY MYCOLOGY,4th Ed. (Alexopoulos, 2007)和 AINSWORTH AND BISBYDICTIONARY OF THE FUNGI, 10th Ed. (Kirk et al. , 2008)) 這些真菌的特征是帶有由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲的延伸來完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以使，但不限于，曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A. clavatus)、煙曲霉(A. fumigatus)、泡盛曲霉(A. awamori)、黃曲霉(A. f Iavus), 土曲霉(A. terreus)和米曲霉(A. oryzae))、青霉屬某種(Penicillium sp.)(例如產(chǎn)黃青霉(P. chrysogenum))、新薩托菌屬某種(Neosartoryasp.)(例如費希新薩托菌(N. fischeri))、粘帚霉菌屬某種(Gliocladium sp.)(例如粉紅粘帚霉(G. roseum))、木霉屬某種(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T. viride)、康寧木霉(T. koningii)、哈茨木霉(T. harzianum))、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)和灰腐質(zhì)霉(H. grisea))、金孢霉屬某種(Chrysosporium sp.)、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“曲霉”或“曲霉屬某種”指以前或目前被分類為曲霉屬的任何真菌屬。如本文所用，術(shù)語“培養(yǎng)”指使一群微生物細(xì)胞在適當(dāng)條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長。如本文所用，有關(guān)多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“異源”指在宿主細(xì)胞中并非天然存在的多核苷酸或蛋白質(zhì)。該術(shù)語意圖包含由天然發(fā)生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。如本文所用，有關(guān)多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“內(nèi)源”至在宿主細(xì)胞中天然存在的多核昔fe或蛋白質(zhì)。如本文所用，有關(guān)細(xì)胞所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”表示該細(xì)胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因組或者作為被保持多代的附加體質(zhì)粒。在關(guān)于將核酸序列中插入細(xì)胞中的上下文中，術(shù)語“導(dǎo)入”表示“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括表示將核酸序列整合入真核或原核細(xì)胞，其中該核酸序列可以被整合入該細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)變成自發(fā)復(fù)制子或者被瞬時表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文所用，術(shù)語“酶活力單位”指在特定條件下每給定的時間內(nèi)產(chǎn)生給定量的產(chǎn)物的酶量。在一些實施方式中，術(shù)語“淀粉酶活力單位”(CU)被定義為在給定的溫度及pH條件下,在過量熱穩(wěn)定性α-葡萄糖苷酶(a-glucosidase)存在的條件下，每分鐘從non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside (BPNPG7)底物中釋放 I 微摩爾對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量。 “CGMCC”指中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京100101，中國，“ATCC”指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA 20108, USA,“NRRL”美國北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心，Peoria, IL 61604，USA,重組表達(dá)的酶和宿主細(xì)胞:在本發(fā)明的一些實施方式中，微生物被遺傳改造以表達(dá)異源α淀粉酶，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！﹥?yōu)選的真菌宿主細(xì)胞包括構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A. aculeatus)、黑曲霉、日本木霉(A. japonicus)、里氏木霉、綠色木霉、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)和爺腐鐮刀菌(F. solani)。在一些實施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是曲霉屬某種的菌株。有用的曲霉宿主菌株包括但不限于構(gòu)巢曲霉(Yelton et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1.USA, 1984, 81:1470-1474;Mullaney et al. , Mol. Gen. Genet. , 1985, 199:37-45;Johnstoneet al. EMBO J.，1985，4:1307-1311);黑曲霉(Kelly et al. , EMBO J.，1985，4:475-479)；泡盛曲霉(NRRL 3112、UVK 143f (USP 5364770)、ATCC 22342、ATCC 44733 和 ATCC 14331)和米曲霉(ATCC 11490)。在進(jìn)一步的實施方式中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑曲霉菌株。當(dāng)下面的描述特別提及α淀粉酶時諸如AclaPll，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，相同或相似的方法適用于可用于將分別編碼其它的α淀粉酶的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建物和載體。根據(jù)本發(fā)明，包含編碼α淀粉酶(諸如AawaP2)的核酸的DNA構(gòu)建物被構(gòu)建以便導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在一些實施方式中，通過表達(dá)載體將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包括可操縱地連接于α淀粉酶(諸如AclaPll)編碼序列的調(diào)控序列。載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞是被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并被復(fù)制的任何載體。參考 Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSG, <www. fgsc.net 的載體列表。在一些實施方式中，編碼α淀粉酶(AclaPll)的核酸被可操縱的連接于合適的啟動子，該啟動子在真菌宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性。該啟動子可以來源于編碼與宿主細(xì)胞同源或者異源的蛋白的基因。優(yōu)選地，啟動子是在曲霉宿主中有用的。有用的啟動子的非限制性實例包括來源于編碼泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA) (Nunberg etal. ,Mol. Cell Biol. , 1984, 4:2306-2315;USP 5364770;USP 6590078;Gwynne et al. , Nat.Biotechnol.，1987，5:713-719; Boel et al. , EMBO J.，1984，3:1581-1585)、黑曲霉 α 淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶和黑曲霉中性α淀粉酶基因的啟動子。在進(jìn)一步的實施方式中，啟動子是編碼黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子。在一些實施方式中，α淀粉酶(AclaPll)的編碼序列可操縱的連接于信號序列。編碼信號序列的DNA優(yōu)選地與將被表達(dá)的基因天然相關(guān)。在進(jìn)一步的實施方式中，與α淀粉酶編碼序列相連接的信號序列由編碼α淀粉酶的基因編碼(例如，AclaPll的信號序列由AclaPll基因編碼)。 在一些實施方式中，表達(dá)載體也包括終止序列。有用的終止子的非限制性實例包括編碼黑曲霉、塔賓曲霉(A. tubingensis)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nunberget al. ,Mol. Cell Biol.，1984，4:2306-2315和Boel et al. , EMBO J., 1984, 3:1581-1585) 在進(jìn)一步的實施方式中，終止序列是編碼塔賓曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。在一些實施方式中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記的實例包括但不限于賦予抗微生物劑耐性的標(biāo)記(例如潮霉素、博來霉素、氯霉素和腐草霉素)。賦予代謝優(yōu)勢的基因，諸如營養(yǎng)選擇性標(biāo)記，也可用于本發(fā)明，包括本領(lǐng)域已知的那些標(biāo)記如amdS、argB和pry4。在進(jìn)一步的實施方式中，選擇性標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉amdS基因，其編碼乙酰胺酶，使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠以乙酰胺為氮源進(jìn)行生長。構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇性標(biāo)記的應(yīng)用在 Kelly et al. , EMBO J.，1985，4:475-479 和 Penttila etal.，Gene, 1987，61:155-164 中被描述。包含帶有編碼α淀粉酶的多核苷酸的DNA構(gòu)建物的表達(dá)載體可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自我復(fù)制或整合進(jìn)宿主DNA中的任何載體。在一些實施方式中，該表達(dá)載體是質(zhì)粒。在進(jìn)一步的實施方式中，表達(dá)載體中的啟動子是編碼黑曲霉糖化酶基因的啟動子，終止子是是編碼塔賓曲霉糖化酶基因的終止子，選擇性標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉amdS基因。用于將編碼α淀粉酶(諸如AclaPll)的多核苷酸插入表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。一般是通過在方便的限制性位點進(jìn)行酶切和連接反應(yīng)來完成的。在一些實施方式中，所用的限制性酶切位點是AflII和Notl。在其他實施方式中，所用的限制性酶切位點是 XhoI 和 XbaI。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、表汰和培養(yǎng):將DNA構(gòu)建物或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞包括各種技術(shù)諸如轉(zhuǎn)化、電穿孔、核微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(例如脂轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)、與磷酸鈣溫浴沉淀DNA、用DNA包被的微射彈進(jìn)行高速轟擊和原生質(zhì)體融合。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。對于轉(zhuǎn)化曲霉菌株，參考Yelton et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1984，81:1470-1474和EP238023。優(yōu)選地，遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子用載體系統(tǒng)構(gòu)建，由此編碼的α淀粉酶(諸如AclaPll)的核酸被穩(wěn)定整合進(jìn)宿主菌株染色體中，然后可以通過已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化子。在一種非限制性實例中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子通過其在含乙酰胺的固體培養(yǎng)基上更快的生長速度以及形成光滑的而非邊緣粗糙的圓形克隆而與非穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子相區(qū)別。此外，在一些情況下，進(jìn)一步的穩(wěn)定性測試可以通過使轉(zhuǎn)化子在固體的非選擇性培養(yǎng)基(即缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長，從該培養(yǎng)基收獲孢子，以及確定隨后發(fā)芽并在含乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上生長的這些孢子的百分比來進(jìn)行?？蛇x的，本領(lǐng)域已知的其他方法可以被用于選擇轉(zhuǎn)化子。在一些實施方式中，用于轉(zhuǎn)化的曲霉屬某種的制備包括來自真菌菌絲體的原生質(zhì)體的制備(參見Campbell et al.，Curr. Genet.，16:53-56)。菌絲體是從萌發(fā)的營養(yǎng)孢子獲得的。將菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理，產(chǎn)生原生質(zhì)體。然后通過懸浮培養(yǎng)基中存在的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體加以保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在O. 8 1. 2M之間變化。宿主菌株對DNA的攝入可以由鈣離子濃度決定。一般而言，10 IOmM的CaCl2可以被用在社區(qū)攝取溶液中。在攝取溶液中除了對鈣離子的需求，一般被包括的其他化合物是緩沖體系諸如TE緩沖液(IOmM Tris (pH 7. 4)和ImM EDTA)或IOmM MOPS (pH 6. O)緩沖液和聚乙二醇(PEG)。
·
通常在轉(zhuǎn)化中使用含有宿主細(xì)胞或原生質(zhì)體諸如曲霉屬某種的原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，所述原生質(zhì)體或細(xì)胞已經(jīng)以約IO7個/mL的密度經(jīng)過滲透性處理。在一些實施方式中，將大約100 μ L體積的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞的適當(dāng)溶液(例如1. 2Μ山梨醇和50mMCaCl2)與期望的DNA混合。在一些實施方式中，將高濃度的PEG加入攝取溶液中。可以向原生質(zhì)體懸浮液中加入O.1 I體積的25%PEG 4000。然而,優(yōu)選地向原生質(zhì)體懸浮液中加入大約O. 25體積。添加劑諸如二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到攝取溶液中并幫助轉(zhuǎn)化。類似的方法可以用于其他真菌宿主細(xì)胞(參考USP 6022725和6268328)。一般的，然后將混合物在大約0°C溫浴10 30min。向混合物中加入額外的PEG以進(jìn)一步加強(qiáng)對所需基因或DNA序列的攝取。在一些實施方式中，加入轉(zhuǎn)化混合物的5至15倍體積的25%PEG 4000。但是，更多或更少的體積都可能是合適的。25%PEG 4000優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約10倍。加入PEG后，可以將轉(zhuǎn)化混合物在室溫溫浴或者在冰上冰浴，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加入到熔化的小量等份生長培養(yǎng)基中。當(dāng)生長培養(yǎng)基包括生長選擇條件(例如乙酰胺或抗生素)是，其僅允許轉(zhuǎn)化子生長?！愣裕?xì)胞被培養(yǎng)在含生理鹽和營養(yǎng)劑的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中(參見Pourquieet al.，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, AcademicPress,1988，71-86和 Ilmen et al. , Appl. Environ. Microbiol. , 1997, 63:1298-1306) 普通的商業(yè)配置培養(yǎng)基(例如Yeast Malt Extract (YM)肉湯、Luria Bertani (LB)肉湯和Sabouraud Dextrose (SD)肉湯)也可以用于本發(fā)明。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的(例如將培養(yǎng)物在搖床培養(yǎng)器中，在合適的培養(yǎng)基中大約30°C下溫浴直至達(dá)到所需的α淀粉酶(諸如AclaPll)表達(dá)水平)。給定的絲狀真菌的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的并且可以在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從該真菌的來源諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和真菌遺傳學(xué)保存中心(FGSC)找到。酶表汰的分析和酶活力的測定當(dāng)下面的描述特別提及α淀粉酶時諸如AclaPll，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，相同或相似的方法適用于AclaP15表達(dá)的分析和酶活力的測定。為了評價α淀粉酶(諸如AclaPll)的表達(dá)，可以在蛋白水平或核酸水平進(jìn)行分析。可以應(yīng)用的分析方法包括Northern印跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)、Southern印跡、放射自顯影、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和含有適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)進(jìn)行的原位雜交。此外，基因表達(dá)可以通過免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗。例如通過Western印跡或ELISA來評估。這樣的免疫試驗可以用于定性地和定量地評價α淀粉酶(諸如AclaPll)的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于實施此類方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。在一些實施方式中，α淀粉酶(諸如AclaPll)的表達(dá)的通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。α 淀粉酶(諸如 AclaPll)的活力可以通過 Miller, Anal. Chem. , 1959, 31:426-428中所述的DNS法來測量。酶活力也可以通過測定單位時間液化可溶性淀粉的能力來進(jìn)行測定(參考GB 8275-2009和GB/T 24401-2009)。在一些實施方式中，α淀粉酶(諸如AclaPll)的活力通過使用α淀粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)進(jìn)行測定。 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的α淀粉酶和重組菌株進(jìn)行描述。在以下的公開內(nèi)容和實驗部分中，應(yīng)用下列縮略語AclaPll (具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的α淀粉酶)、V (攝氏度)、rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)速)、dlH20(去離子水，Mill1-Q過濾)、kD(千道爾頓)、g (克)、mg (毫克)、yg(微克)、cm(厘米)、μπι(微米)、L(升)、mL(毫升)、yL(微升)、M(摩爾濃度)、mM(毫摩爾濃度)、CU(酶活單位)、min(分鐘)、h(小時)、d(天)、Tris (三輕甲基氨基甲烷)，SDS (十二烷基硫酸鈉)、PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)、MOPS (嗎啉丙磺酸)。實施例1克隆α淀粉酶基因AclaPll按照制造商的說明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從棒曲霉CGMCC
3.5289過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。根據(jù)NCBI上的編號為XM_001271888的序列設(shè)計PCR引物，用于克隆棒曲霉中的AclaPll基因的正向引物AclaPll-F序列如下5’ -ACGGCCTTAAGAAGATGCCTCGGATTTGGTCCTC(下劃線所示序列為AflII酶切位點)，反向引物AclaPll-R序列為5， -ATTGCGGCCGCAGCTCAAGCACAGATCTTGCTTC(下劃線所示序列為NotI酶切位點)。將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從棒曲霉基因組DNA中擴(kuò)增出來。擴(kuò)增條件第一步98°C保持3min。第二步98°C保持10s，然后72°C保持75s，此步驟重復(fù)30次。第三步72°C保持IOmin。使用凝膠純化試劑盒將上述PCR產(chǎn)物純化，用限制性內(nèi)切酶AflII和NotI (Fermentas)對純化了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時，用限制性內(nèi)切酶AfIII和NotI對質(zhì)粒PGm (遺傳圖譜如圖1)進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對若干克隆進(jìn)行測序(Invitrogen)。按照制造商的說明書，使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。所得質(zhì)粒為pGm-AclaPll，測得的核苷酸序列為SEQ ID NO:2,其翻譯的氨基酸(蛋白)序列為SEQ ID N0:1。實施例2 =PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化黑曲霉吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于CMA平板中心(9cm培養(yǎng)皿)，待菌落長滿整個培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14 16h。用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴I 2h，用顯微鏡觀察檢測原生質(zhì)體化進(jìn)展。 用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個50mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中，并用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體計數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計數(shù)板計數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO7 個/mL。在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無菌15mL離心管中，每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)用I管。加入10 μ g質(zhì)粒。加入12. 5 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20min。將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)7 10d。溶液A:2.5mL IM K2HPO4, 2. 5mL IM KH2PO4,48. 156g MgSO4,加入 dlH20 至終體積500mL,用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。溶液B5mL IM Tris (pH 7. 5),2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20至終體積500mL,用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。溶液C:250g PEG 4000,2. 77g CaCl2, 5mL IM Tris (pH 7. 5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。原生質(zhì)體化溶液將O.6g裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum,Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。MMSA 平板0. 59g 乙酰胺(Sigma) ,3. 4g CsCl (Sigma)，O. 52g KCl，1. 52g KH2PO4,218. 5g山梨醇，ImL痕量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972. 5mL,高壓蒸汽滅菌后加入用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL 40%葡萄糖和2. 5mL 20%MgS04。MMSA 頂層瓊脂試管0. 59g 乙酰胺(Sigma), 3. 4g CsCl (Sigma), O. 52g KCl,1.52g KH2PO4, 218. 5g山梨醇，Iml痕量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972. 5mL,高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時，加入用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL 40%葡萄糖和2. 5mL 20%MgS04,之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。痕量元素在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 · 7Η20，8· 8g ZnSO4 · 7Η20，0· 4gCuSO4 ·5Η20，0· 15g MnSO4 ·4Η20，0· Ig Na2B4O7 · IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024 · 4Η20，O. 2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。CMA平板20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積IOOOmL,高壓蒸氣滅菌。CMA液體培養(yǎng)基20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，加入dlH20至終體積IOOOmL,高壓蒸氣滅菌。待平板上長出菌落后，挑選25個菌落 ，按照制造商的說明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從其過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。按實施例1中所述實驗步驟進(jìn)行PCR驗證，對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。所得陽性克隆的孢子懸浮液接種于25mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)3d，所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 Xg條件下離心lOmin，收集上清液。所得上清液即為酶液。將酶液在濃度為8%的SDS-PAGE膠上 進(jìn)行電泳，對在55kD出有明顯條帶的陽性克隆進(jìn)行酶活檢測。按照制造商的說明書，用α淀粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)測定酶液中淀粉酶活力。選取酶活力最高者作為Pll淀粉酶重組菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。將黑曲霉Pll (Aspergillus Niger)已于2012年9月4日保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，菌株編號為CGMCC No. 6513。實施例3 :表達(dá)棒曲霉α淀粉酶AclaPll的黑曲霉的發(fā)酵和酶的表達(dá)AclaPll淀粉酶在黑曲霉中的表達(dá)和其最適pH值、溫度的測定將表達(dá)AclaPll淀粉酶的黑曲霉轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液接種于25mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d。所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000Xg條件下離心lOmin，收集上清液。所得上清液即為AclaPll淀粉酶酶液。將酶液在濃度為8%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳(圖2)。電泳結(jié)果顯示在55kD處可以看到明顯條帶，而野生菌沒有可見的蛋白條帶，宿主菌Gl有條帶，但表達(dá)量明顯小于重組菌的表達(dá)量。按照制造商的說明書，用α淀粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)測定酶液中淀粉酶活力。在pH 5.4，40°C條件下，AclaPll的酶活(CU/mL)為335. 3CU/mL，宿主菌Gl的酶活為46⑶/mL，野生菌的酶活為O⑶/mL。重組酶AclaPll酶活明顯高于宿主菌和野生菌所產(chǎn)酶的酶活。配制一系列pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2. 4,pH 3. O,pH 3. 6,pH 4. 2，pH 4. 8，pH 5. 4，pH 6.0, pH 6. 6，pH 7. 2, pH 7.8)。酶液用上述不同pH值得緩沖液稀釋至合適的濃度，在40°C下，按照制造商的說明書，用α淀粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)測定酶液中淀粉酶活力。圖3說明了黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的pH穩(wěn)定性。結(jié)果顯不AclaPll的最適pH為6. O。酶液用上述實驗確定的最適pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋至合適的濃度，按照制造商的說明書，在不同溫度下(30°c，40°c，50°c，6(rc，7(rc，8(rc)，用α淀粉酶活力測定試劑盒測定酶液中淀粉酶活力。圖4說明了黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果顯示AclaPll最適反應(yīng)溫度為50°C。實施例4 :表達(dá)α淀粉酶AclaPll的應(yīng)用實例采用一次發(fā)酵法工藝制作面包。面包粉選用鵬泰的面包基礎(chǔ)粉(未加任何添加劑)；安琪牌面包酵母；加倫牌起酥油。通過研究面包硬度的變化與α淀粉酶添加量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)α淀粉酶AclaPll有一定的抗老化效果。研究發(fā)現(xiàn)，在添加范圍為O. 1-0. 5ml/100g面粉時，α淀粉酶AclaPll可以明顯地增加面包的比容，減小面包皮和面包心的硬度，改善面包質(zhì)地，提高面包的焙烤品質(zhì)。α淀粉酶能改進(jìn)面包的體積，改良面包的口感，使面包等產(chǎn)品體積更大，顆粒更柔軟，對提高面包的品質(zhì)有著重要的意義。本發(fā)明為α淀粉酶作為面包添加劑應(yīng)用到面包工業(yè)中提供了一定的 理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種α淀粉酶，其特征在于所述的α淀粉酶氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.一種核苷酸，其特征在于所述的核苷酸用于編碼權(quán)利要求1所述的α淀粉酶。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其序列為SEQID Ν0:2。
4.一種酶組合物，其特征在于所述的酶組合物包含有權(quán)利要求1所述的α淀粉酶。
5.曲霉菌株，其特征在于，所述的曲霉菌株用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的α淀粉酶。
6.如權(quán)利要求5所述的曲霉菌株，其特征在于所述的曲霉菌株為黑曲霉Pll其保藏編號為 CGMCC No. 6513。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的重組菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:1。用于表達(dá)α淀粉酶的黑曲霉P11，其保藏編號為CGMCC No.6513。本發(fā)明所得到的重組菌種能夠表達(dá)棒曲霉α淀粉酶AclaP11，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的淀粉酶的酶活力。同時，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，擴(kuò)大了AclaP11的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/66GK102994475SQ201210381980
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者王華明, 閆真 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所