專利名稱：一種維生素K₂高產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種菌株，特別涉及一種維生素K2高產(chǎn)菌株。
背景技術(shù)：
維生素K是ー類具有葉綠醌生物活性的萘醌基團衍生物，在控制凝血方面發(fā)揮著重要作用。天然存在的有維生素K1和K2,維生素K1廣泛存在于綠色植物中，是食物中維生素K的重要來源；維生素K2主要由人體的腸道細菌合成。研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2屬于脂溶性維生素，具有維持機體的正常凝血作用，預(yù)防骨質(zhì)疏松以及抗癌等作用。研究表明維生素K2參與合成血液凝固的多種蛋白質(zhì)，在這一形成過程中，凝血酶原與磷脂形成ー種聚合體，其中鈣離子能夠促進聚合體的合成，但在缺乏維生素K2時，凝血酶原與鈣離子的親和性顯著降低，凝血過程受到阻礙。 原生質(zhì)體融合起源于20世紀60年代，并于70年代逐漸發(fā)展起來的重要基因重組技木。是通過酶或機械的方法除去細胞壁，使雙親株的微生物菌體細胞形成球狀原生質(zhì)體，經(jīng)過物理、化學(xué)或生物方法使雙親株的原生質(zhì)體融合，再發(fā)生染色體基因組間的交換重組，使融合子具有雙親的優(yōu)勢性狀，在適宜的培養(yǎng)條件下再生細胞壁，經(jīng)過合理的篩選，從再生菌體中獲得重組子。近年來，該技術(shù)已成為細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域迅速發(fā)展的方向之一。該技術(shù)不僅能夠改良菌種遺傳性狀、提升有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還能綜合不同菌株的代謝特性，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在エ業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應(yīng)用前景。實踐證明，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以獲得具有雙親優(yōu)良特性的融合子，并且細菌之間的原生質(zhì)體融合可以克服細菌種屬之間的差異而實現(xiàn)基因重組。因此，特別需要一種維生素K2高產(chǎn)菌株，已解決上述現(xiàn)有存在的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種維生素K2高產(chǎn)菌株，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用先進的生物技術(shù)手段，顯著提高了維生素K2的產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)維生素K2提供了方法，具有重要的實際意義。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種維生素K2高產(chǎn)菌株，其特征在干，它由納豆芽孢桿菌BS-5的突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得。在本發(fā)明的一個實施例中，所述突變體BS-53是由納豆芽孢桿菌BS-5菌株經(jīng)過紫外和亞硝基弧復(fù)合誘變獲得。在本發(fā)明的一個實施例中，所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是合肥エ業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。在本發(fā)明的一個實施例中，所述突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間的融合是采用電融合方式。本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株，與現(xiàn)有技術(shù)相比，以納豆芽孢桿菌BS-5為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外和亞硝基弧的復(fù)合誘變處理，篩選得到突變株BS-53，突變株BS-53與維生素K2產(chǎn)量低但生長速度快的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質(zhì)體融合，通過平板篩選獲得融合子，融合子經(jīng)過發(fā)酵性能實驗篩選獲得；具有雙親優(yōu)良特性，即同時具有MK高產(chǎn)和生長速度快的雙重功效，為實現(xiàn) MK高產(chǎn)提供了有效措施，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值，實現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明的特點可參閱本案圖式及以下較好實施方式的詳細說明而獲得清楚地了解。


圖I為本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株的技術(shù)原理圖；圖2為突變體BS-53原生質(zhì)體的示意圖；圖3為納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體的示意圖；圖4為突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體的電融合過程的不意圖；圖5為突變體BS-53和本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株不同時間menD基因表達量變化的示意圖；圖6為BS-53和本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株不同時間menB基因表達量變化的示意圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進ー步闡述本發(fā)明。如圖I所示，本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株，它由納豆芽孢桿菌BS-5的突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得。在本發(fā)明中，所述突變體BS-53是由納豆芽孢桿菌BS-5菌株經(jīng)過紫外和亞硝基弧復(fù)合誘變獲得。所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是合肥エ業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是ー種從自然界中分離的可以產(chǎn)MK的革蘭氏枯草芽孢桿菌，但是產(chǎn)量比較低；納豆芽孢桿菌CICC10262是ー種MK產(chǎn)量低但生長速度快的菌株；納豆芽孢桿菌BS-53是納豆芽孢桿菌BS-5菌株誘變處理后MK產(chǎn)量高但生長速度慢的菌株。在本發(fā)明中，所述突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間的融合是采用電融合方式。具體工程如下第一歩菌種活化菌種BS-5和納豆芽孢桿菌CICC10262復(fù)壯后，接種于斜面固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)18_24h,置于4°C保存。第二步種子培養(yǎng)活化菌種接入液體培養(yǎng)基中(30/250ml)，37°C，120r/min恒溫培養(yǎng)48h。取種子培養(yǎng)液，按5%的接種量(v/v)接入到液體培養(yǎng)基中(30/250ml)，37°C，120r/min恒溫培養(yǎng)。第三步BS_5菌株的紫外誘變BS-5菌對數(shù)生長早期的菌懸液，于3500r/min離心收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2-3次后，制成細胞濃度為I X 108個/mL的菌懸液。在超凈工作臺上，吸取15mL菌懸液于直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中，調(diào)整培養(yǎng)皿至紫外燈(20W)的垂直距離為30cm。在紫外燈下照射45s后，連續(xù)處理兩代，將菌液涂布于抗性 平板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h，篩選得到BS-52菌。第四步BS_5菌株的紫外誘變?nèi)S-52菌懸液9ml，加入亞硝基弧溶液lml，使其在菌懸液中的終濃度達到100ug/ml,置于37°C恒溫振蕩30min,取出菌懸液8000r/min離心IOmin,棄去上清液,用生理鹽水洗滌2-3次，再用IOml液體培養(yǎng)基懸浮菌體，于37°C培養(yǎng)24h。制備的菌懸液，適當稀釋，取O. Iml涂布抗性平板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h，篩選得到BS-53菌。第五步BS_53菌和CICC10262原生質(zhì)體制備(參見圖2和圖3)將2%活化菌株CICC10262接種到20mL新鮮完全培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，加入青霉素O. 6U/mL繼續(xù)培養(yǎng)約2h,取菌液,離心IOmin,棄去上清液,用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. Omg/mL于37°C保溫lh，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質(zhì)體生成，當鏡檢有90%的原生質(zhì)體形成時，3000r/mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用高滲緩沖液(SMM)洗滌2次以除酶，最終懸浮于SMM中。將2%活化菌株BS-53菌接種到20mL新鮮完全培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，加入青霉素2U/mL繼續(xù)培養(yǎng)約2h，取菌液，離心lOmin，棄去上清液，用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. 4mg/mL于37°C保溫40min，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質(zhì)體生成，當鏡檢有90%的原生質(zhì)體形成時，3000r/mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用SMM洗滌2次，懸浮于SMM中。第六步原生質(zhì)體電融合(參見圖4)BS-53菌(熱滅活法)和CICC10262菌株(紫外滅活法)分別經(jīng)過滅活后，取兩親本滅活原生質(zhì)體懸液各2ml，以I :1等量混合于滅菌離心管中，用SMM離心洗滌2次(3500r/min，lOmin)，并用電擊緩沖液離心洗滌一次，之后懸浮于電擊液中，調(diào)整原生質(zhì)體濃度為108個/ml。用無菌移液器取少量混合懸液注入Icm的融合電極小室中，置于倒置顯微鏡下，之后接通電融合儀，先接通成串電壓和電流，調(diào)整電壓的大小，當電極小室中的原生質(zhì)體在電壓的作用下逐漸形成串珠狀時，維持電壓幾分鐘，使其形成穩(wěn)定的串珠狀。再接通直流融合電壓，直流脈沖可瞬間可逆擊穿相鄰的原生質(zhì)體膜，從而觸發(fā)相鄰原生質(zhì)體的融合。將融合小室取出，放入超凈工作臺內(nèi)，靜置約5-10min，將電融合液用微量移液器接種于再生培養(yǎng)基上,于37°C培養(yǎng)4d,并從再生培養(yǎng)基上分離融合子。第七步融合子的篩選選擇再生平板上生長速度快、菌落直徑大的單菌落，進行維生素K2高產(chǎn)菌株的初步篩選；淘汰菌落偏小、生長速度慢、易老化的菌落。
將初篩菌株接種于液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)4d，以MK產(chǎn)量作為篩選指標，同時以出發(fā)菌株作為對照，進ー步篩選即可獲得本發(fā)明的維生素K2高產(chǎn)菌株(參見圖5和圖6)。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.一種維生素K2高產(chǎn)菌株，其特征在干，它由納豆芽孢桿菌BS-5的突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得。
2.如權(quán)利要求I所述的維生素K2高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述突變體BS-53是由納豆芽孢桿菌BS-5菌株經(jīng)過紫外和亞硝基弧復(fù)合誘變獲得。
3.如權(quán)利要求I所述的維生素K2高產(chǎn)菌株，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是合肥エ業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。
4.如權(quán)利要求I所述的維生素K2高產(chǎn)菌株，其特征在于,所述突變體BS-53原生質(zhì)體與納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間的融合是采用電融合方式。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于公開一種維生素K2高產(chǎn)菌株，與現(xiàn)有技術(shù)相比，以納豆芽孢桿菌BS-5為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外和亞硝基弧的復(fù)合誘變處理，篩選得到突變株BS-53，突變株BS-53與維生素K2產(chǎn)量低但生長速度快的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質(zhì)體融合，通過平板篩選獲得融合子，融合子經(jīng)過發(fā)酵性能實驗篩選獲得；具有雙親優(yōu)良特性，即同時具有MK高產(chǎn)和生長速度快的雙重功效，為實現(xiàn)MK高產(chǎn)提供了有效措施，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值，實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
文檔編號C12N1/20GK102827798SQ20121033941
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉國慶, 趙肖, 胡衛(wèi)華, 錢曉勇 申請人:上海紅馬飼料有限公司