專利名稱：核苷酸還原酶亞單位m1基因表達(dá)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)核苷酸還原酶亞單位Ml (RRMl)基因表達(dá)熒光定量PCR試劑盒，適用于各種組織、細(xì)胞、血液中RRMl表達(dá)水平mRNA的定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
核苷酸還原酶亞單位Ml(ribonuleotide reductase subunit Ml, RRM1)是吉西他濱作用的靶點(diǎn)之一，吉西他濱為脫氧胞嘧啶核苷的類似物，屬細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，主要作用于DNA合成期，即S期的細(xì)胞，在一定的條件下也可以阻止G期向S期的進(jìn)展。吉西 他濱為核苷酸還原酶抑制劑，使細(xì)胞內(nèi)合成DNA所需的dCTP產(chǎn)生減少，抑制DNA合成。研究證實(shí)，RRMl的高水平表達(dá)與吉西他濱的耐藥性相關(guān)。而且，晚期腫瘤患者高水平表達(dá)RRMl其預(yù)后較差。目前對(duì)RRMl基因表達(dá)與肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌的研究比較多，RRMl基因表達(dá)情況的研究對(duì)腫瘤的臨床個(gè)體化治療和預(yù)后有重要意義。其他腫瘤與RRMl基因表達(dá)的研究也引起極大關(guān)注。一、RRMl基因的結(jié)構(gòu)核苷酸還原酶(RR)是DNA合成通路中的限速酶，是唯一使核糖核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾颂呛塑账岬拿?，為DNA合成和修復(fù)所必需。RR全酶包括兩個(gè)調(diào)節(jié)亞單位分別為RRMl和兩個(gè)催化亞單位(RRM2或p53R2)。RRMl是核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，能控制底物的特異性和全酶的活性，由一個(gè)活性位點(diǎn)(含Cys225、Asn437、Glu441、Cys439、Cys463殘基)和三個(gè)獨(dú)立的變構(gòu)位點(diǎn)組成。RRMl還是一個(gè)腫瘤抑制基因，已證實(shí)該基因位于染色體11ρ15. 5這是一個(gè)可出現(xiàn)于非小細(xì)胞肺癌的雜合子丟失(loss of heterozygosity, L0H)的區(qū)域,稱為L(zhǎng)0H11A。該區(qū)域與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)系，75%的NSCLC患者有這樣的雜合性缺失。有研究表明，該雜合子的丟失與預(yù)后有一定的關(guān)系，具有LOH丟失的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較差。二、RRMl基因型與腫瘤的關(guān)系腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展使人們逐漸意識(shí)到，分子生物學(xué)基因表達(dá)譜的顯著差異是不同個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)性差異的根本原因，也是指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化治療的基礎(chǔ)。與藥物作用靶標(biāo)、藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的特定基因的多態(tài)性，對(duì)藥物的療效起著決定性作用。RRMl是吉西他濱的作用靶點(diǎn)，RRMl (-37)和(-524)位點(diǎn)的基因多態(tài)性及mRNA的表達(dá)水平與吉西他濱的療效有關(guān)。因此，能通過(guò)位點(diǎn)的基因多態(tài)性分析，在治療前預(yù)測(cè)吉西他濱的療效，不僅能提高患者受益可能性，還能減少無(wú)效治療帶來(lái)的巨大浪費(fèi)。據(jù)報(bào)道RRMl (-37)位點(diǎn)的基因多態(tài)性在不同種族有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。朝鮮人、西班牙人和美洲白人A/Α的基因型頻率基本一致；而在非裔美洲人中，A/A的基因頻率為13. 3%。本研究對(duì)150例中國(guó)人外周血基因組樣本進(jìn)行了 RRMl (-37)位點(diǎn)的SNP檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A/A的基因頻率為31%，與B印Ier等應(yīng)用RFLP法報(bào)道的129例朝鮮族人中的A/A的基因型(27. 1%)相似，本研究結(jié)果顯示A/A基因型頻率在健康人和肺癌患者中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0. 05)。B印Ier等報(bào)道286例非小細(xì)胞肺癌患者中，RRMl (-37)位點(diǎn)攜帶野生型基因型C/C的患者總生存率和無(wú)進(jìn)展生存期明顯高于Α/C基因型和A/A基因型的患者，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Taron等人研究了術(shù)后接受吉西他濱聯(lián)合順鉬泰索帝治療的非小細(xì)胞肺癌的RRMl (-37)基因型，結(jié)果表明Α/C基因型患者無(wú)論從疾病進(jìn)展時(shí)間(time toprogress, TTP)和總生存時(shí)間(over survival time, OS )均優(yōu)于C/C和A/A基因型的患者。Kim等研究了一線接受吉西他濱治療的晚期非小細(xì)胞肺癌患者RRMl (-37)和(-524)位點(diǎn)的SNP，結(jié)果顯示攜帶-37A/C和-524C/T基因型的患者，其有效率遠(yuǎn)高于其他基因型患者(65. 5%和42. 6%, P=O. 039)，但無(wú)進(jìn)展時(shí)間和總生存時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本組研究中RRMl (-37)位點(diǎn)的基因型與肺癌患者的一般狀態(tài)，療效及生存時(shí)間均無(wú)相關(guān)性，但由于納入的病例數(shù)較少，要明確基因多態(tài)性與臨床特征之間的關(guān)系尚需積累更多的病例，且多個(gè)基因位點(diǎn)的SNP以及RRMl基因mRN A的表達(dá)水平與吉西他濱臨床療效的關(guān)系同樣值得進(jìn)一步研究。吉西他濱是目前治療非小細(xì)胞肺癌的一線藥物。研究表明作為吉西他濱作用靶點(diǎn)的RRM1，其啟動(dòng)子區(qū)域的基因多態(tài)性可以影響吉西他濱對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的療效。三、RRMl基因表達(dá)與預(yù)后RRMl基因的表達(dá)可能阻斷G2期細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)。體外研究表明，RRMl的過(guò)表達(dá)在RNA和蛋白質(zhì)水平可誘導(dǎo)磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)表達(dá)，減少黏著斑激酶(FAK)的磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存時(shí)間。因此，RRMl可作為腫瘤抑制基因而影響預(yù)后。Goan等的研究認(rèn)為在對(duì)吉西他濱耐藥的鼻咽癌KB細(xì)胞克隆系中，RR的過(guò)度表達(dá)對(duì)耐藥性起到重要作用。在對(duì)吉西他濱耐藥的白血病細(xì)胞系K562中RR也有過(guò)度表達(dá)。然而,最近的研究卻發(fā)現(xiàn),在兩株對(duì)吉西他濱耐藥的NSCLC細(xì)胞系中，RRMl高表達(dá)而沒(méi)有RR的活性相應(yīng)增加。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中含有濃度較高的吉西他濱時(shí)，RRMl蛋白水平增高，而改用不含吉西他濱的培養(yǎng)基時(shí)，RRMl蛋白水平迅速下降到接近正常水平，說(shuō)明這一效應(yīng)是吉西他濱濃度改變引起的，這種現(xiàn)象的機(jī)制目前還沒(méi)有充分的解釋。一種可能的原因是吉西他濱能夠不可逆地與RRMI結(jié)合造成酶失活，為了維持所需要的RR全酶的活性和量，細(xì)胞內(nèi)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制促使RRMl的表達(dá)增加，同時(shí)藥物本身也失去活性，使腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)吉西他濱的耐藥。目前多項(xiàng)臨床研究結(jié)果顯示低表達(dá)RRMl患者預(yù)后較好。Rosell等采用RT-PCR方法對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者的病理標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RRMl低表達(dá)組較高表達(dá)組的中位生存期明顯延長(zhǎng)(13. 7個(gè)月vs 3.6個(gè)月，95%(1=2.6 11.1個(gè)月)，因此RRMl表達(dá)水平可作為一個(gè)重要的預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。Rosell等又對(duì)67例II B期、III A期和IIIB期術(shù)后非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了 RRMl低表達(dá)組較高表達(dá)組死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了 70%，中位生存期延長(zhǎng)，并且RRMl低表達(dá)組具有更好的腫瘤緩解率(65%vs 54%)、完全切除率(94%vs 72%)和病理完全緩解率^5%vs O)。Ceppi等對(duì)70例晚期非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性研究，也證實(shí)在mRNA水平，RRMl低表達(dá)組中位生存期明顯延長(zhǎng)(13. 9個(gè)月vs 10. 9個(gè)月，P=O. 0390)，RRMl與ERCCl表達(dá)水平具有高度相關(guān)性，兩者低表達(dá)組預(yù)后較好，基因表達(dá)水平與組織學(xué)類型無(wú)相關(guān)性。而B(niǎo)印Ier等對(duì)65例I期、6例II期、3例III期和3例IV期術(shù)后非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行前瞻性分析，提取腫瘤組織及正常組織的RNA，用RT-PCR檢測(cè)RRMl、PTEN的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中RRMl的表達(dá)和PTEN具有明顯相關(guān)性(P=0. 001)，高表達(dá)RRMl和PTEN的患者較低表達(dá)組中位生存期明顯延長(zhǎng)(52個(gè)月vs 24個(gè)月)，高表達(dá)RRMl和PTEN的患者無(wú)病生存期也較低表達(dá)者長(zhǎng)(P分別為O. 002和O. 026)。zhong等對(duì)187例I期手術(shù)后非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RRMl高表達(dá)組中位無(wú)進(jìn)展生存期明顯高于低高表達(dá)組(120個(gè)月vs 60. 2個(gè)月)。通過(guò)對(duì)上述出現(xiàn)不同結(jié)果的臨床研究所入選的病例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)早期的非小細(xì)胞肺癌患者單獨(dú)接受手術(shù)治療時(shí)，高表達(dá)RRMl提示預(yù)后較好；而在晚期接受化療的患者RRMl高表達(dá)提示預(yù)后較差，說(shuō)明RRMl與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后關(guān)系可能因臨床分期和治療方案的不同而有所改變。在最近發(fā)布的美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟(NCCN)非小細(xì)胞肺癌的臨床治療指南(第二版，2009)中明確指出在接受吉西他濱治療前進(jìn)行RRMlmRNA表達(dá)水平檢測(cè)可提聞治療有效率和患者生存期。RRMl的表達(dá)水平在與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系，吉西他濱耐藥的相關(guān)性等方面的研究顯示其在臨床應(yīng)用的重要價(jià)值，那么RRMl的表達(dá)水平是否可以預(yù)測(cè)不同分期的肺癌患者的預(yù)后，是否可以作為肺癌患者接受化療的篩選指標(biāo)，以預(yù)測(cè)不同人群對(duì)吉西他濱的 敏感程度以指導(dǎo)臨床用藥，從而避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失和化療毒副作用，實(shí)現(xiàn)真正意義上的個(gè)體化治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能快速、高敏感度的檢測(cè)血清、血漿RRMl基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明米用鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)技術(shù)合成覆蓋RRMl基因檢測(cè)位點(diǎn)的核苷酸序列探針，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，研制一種快速、高度靈敏的檢測(cè)RRMl基因熒光定量PCR試劑盒。該試劑盒包括熒光定量反應(yīng)液預(yù)混液(PCR Master Mix)、LNA_熒光定量反應(yīng)液(熒光定量反應(yīng)液的特征是均含有正、反引物和熒光標(biāo)記的RRMl基因檢測(cè)位點(diǎn)核苷酸探針)、陽(yáng)性對(duì)照樣品。熒光定量反應(yīng)液用于檢測(cè)RRMl基因片斷核酸序列，檢測(cè)位點(diǎn)是-37位點(diǎn)上A/C和A/A兩種基因型及-524位點(diǎn)上C/T和C/Α兩種基因型。該反應(yīng)液包括PCR引物一對(duì)及探針一條，其中正向引物序列為SEQ ID NO: I (5，-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3，)；反向引物序列為SEQ ID NO:2 (5’ -ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’)；突光探針序列為SEQ ID NO:3 (FAM — TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQ1)。該熒光探針的5'端標(biāo)記FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))，3'端標(biāo)記BHQl (熒光淬滅基團(tuán))。陽(yáng)性對(duì)照樣品包含所檢測(cè)RRMl基因檢測(cè)位點(diǎn)的混合質(zhì)?；蚪MDNA質(zhì)粒。在本發(fā)明中提供的兩端都標(biāo)有熒光發(fā)光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，所以體系中沒(méi)有熒光信號(hào)的變化。而一旦它與突變后的模板特異性的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板相結(jié)合的探針，其5' -3'外切酶活性就會(huì)將探針切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，這樣就破壞了兩熒光基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放出來(lái)的熒光就可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)到。PCR每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一祥，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板DNA的拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明不僅可用于簡(jiǎn)單的定性檢測(cè)，亦可用做突變樣本具體含量的定量檢測(cè)。與常規(guī)熒光定量PCR檢測(cè)RRMl基因比較，本發(fā)明所述的CR檢測(cè)試劑盒具有以下優(yōu)勢(shì)I.本發(fā)明采用LNA技術(shù)合成覆蓋tubulin基因檢測(cè)位點(diǎn)的核苷酸序列探針，提高檢測(cè)敏感性和特異性，假陽(yáng)性低。2.靈敏度高，在混有野生型基因組DNA背景下，可準(zhǔn)確檢測(cè)出1%甚至更低含量的突變基因DNA ;特異性好，PCR產(chǎn)物無(wú)需后續(xù)處理。
3.檢測(cè)時(shí)間短(從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果可在90分鐘以內(nèi)完成)。4.操作過(guò)程簡(jiǎn)単，并且從PCR反應(yīng)開(kāi)始，就是在封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測(cè)定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了結(jié)果偏差的幾率(比較如下所示)。5.本技術(shù)對(duì)標(biāo)本DNA獲取的質(zhì)量要求較低，無(wú)論是血清、血漿、石蠟組織還是新鮮組織，都能取得理想的檢測(cè)結(jié)果。6.檢測(cè)的樣本量大，一次實(shí)驗(yàn)最多可檢測(cè)95例。7.安全整個(gè)體系中不包含有毒有害物質(zhì)，對(duì)操作員和環(huán)境都無(wú)危害。


圖I是RRMl基因-37位點(diǎn)上A/C的堿基部分陽(yáng)性樣本FQ-PCR圖。圖2是RRMl基因-37位點(diǎn)上A/A的堿基陽(yáng)性樣本FQ-PCR圖。圖3是RRMl基因-524位點(diǎn)上C/T的堿基部分陽(yáng)性樣本FQ-PCR圖。圖4是RRMl基因-524位點(diǎn)上C/A的堿基陽(yáng)性樣本FQ-PCR圖。上述附圖均為檢測(cè)儀器自帶軟件的原始檢測(cè)圖，圖中橫坐標(biāo)英文含義為“PCR循環(huán)數(shù)”，縱坐標(biāo)英文含義為“擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值”。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料是收集自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2003年6月 2007年5月臨床病理診斷為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的90例女性患者的蠟塊組織。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)吉非替尼治療。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。實(shí)施例I :本發(fā)明所述的RRMl基因表達(dá)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人組織中RRMl基因-37位點(diǎn)上A/C和A/A兩種基因型。設(shè)計(jì)能特異性檢測(cè)-37位點(diǎn)檢測(cè)A/C和A/A基因的探針各一條及公用引物一対。正向引物序列為SEQ ID NO: I (5，-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3，)；反向引物序列為SEQ ID NO:2 (5’ -ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’)；突光探針序列為
SEQ ID NO:3 (FAM — TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQl)0 該熒光探針的5'端標(biāo)記FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))，3'端標(biāo)記BHQl (熒光淬滅基團(tuán))。然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測(cè)反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探針各O. 2 μ 1(20 μ Μ)，模板DNA 2. 5 μ l(100-300ng/y I)，2*TaqmanuniversalPCR Master Mix (購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ I。熒光定量反應(yīng)在ABI7900檢測(cè)儀上進(jìn)行。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95 °C預(yù)變性30秒；并按95 °C 5秒，62 °C 33秒，擴(kuò)增反應(yīng)45次循環(huán)結(jié)果為在90例樣本中共檢測(cè)出48例樣本有-37位點(diǎn)上A/C的堿基(部分陽(yáng)性樣本見(jiàn)圖I);及16例樣本有-37位點(diǎn)上A/A的堿基((部分陽(yáng)性樣本見(jiàn)圖2)。圖I為部分存在-37位點(diǎn)上A/C的基因型樣本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線；圖2為部分存在-37位點(diǎn)上A/A的基因型樣本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線。 實(shí)施例2 :本發(fā)明所述的RRMl基因表達(dá)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人組織中RRMl基因-524位點(diǎn)上C/T和C/A兩種基因型。設(shè)計(jì)能特異性檢測(cè)-524位點(diǎn)檢測(cè)C/T和C/A基因的探針各一條及公用引物一対。正向引物序列為SEQ ID NO: I (5，-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3，)；反向引物序列為SEQ ID NO:2 (5’ -ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’)；突光探針序列為SEQ ID NO:3 (FAM — TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQ1)。該熒光探針的5'端標(biāo)記FAM (熒光報(bào)告基團(tuán))，3'端標(biāo)記BHQl (熒光淬滅基團(tuán))。然后優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行FQ-PCR的檢測(cè)反應(yīng)體系為15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探針各O. 2 μ 1(20 μ Μ)，模板DNA 2. 5 μ l(100-300ng/y I)，2*TaqmanuniversalPCR Master Mix (購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ I。熒光定量反應(yīng)在ABI7900檢測(cè)儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序95°C預(yù)變性10秒；95°C變性5秒，60°C退火/延伸20秒，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果為在90例樣本中共檢測(cè)出36例樣本有-524位點(diǎn)上C/T的堿基(部分陽(yáng)性樣本見(jiàn)圖3);及8例樣本有-524位點(diǎn)上C/A的堿基(陽(yáng)性樣本見(jiàn)圖4)。圖3為部分存在-524位點(diǎn)上C/T的基因型樣本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線；圖4為部分存在-524位點(diǎn)上C/A的基因型樣本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增曲線。由此看出，采用本發(fā)明所述的還原酶亞單位Ml基因熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，不僅可以快速、高效地檢測(cè)出樣品中的還原酶亞單位Ml基因的突變，而且其結(jié)果的判讀非常明確、直觀，結(jié)果亦是可靠、特異的。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸還原酶亞單位Ml基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括熒光定量反應(yīng)液預(yù)混液、熒光定量反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照樣品，其特征在于 所述熒光定量反應(yīng)液包括PCR引物ー對(duì)及探針一條，其中，正向引物的序列為SEQ IDN0:1，反向引物的序列為SEQ ID NO:2，熒光探針的序列為SEQ ID N0:3，該熒光探針是采用熒光標(biāo)記的覆蓋核苷酸還原酶亞單位Ml基因檢測(cè)位點(diǎn)的鎖核苷酸探針，其5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)；所述檢測(cè)位點(diǎn)是-37位點(diǎn)上A/C和A/A兩種基因型及-524位點(diǎn)上C/T和C/A兩種基因型； 所述陽(yáng)性對(duì)照樣品為包含所檢測(cè)核苷酸還原酶亞單位Ml基因檢測(cè)位點(diǎn)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核苷酸還原酶亞單位Ml基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光探針的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核苷酸還原酶亞單位Ml基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光探針的3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是BHQl。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)核苷酸還原酶亞單位M1(RRM1)基因表達(dá)熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明所述的核苷酸還原酶亞單位M1基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括熒光定量反應(yīng)液預(yù)混液、熒光定量反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照樣品。所述熒光定量反應(yīng)液包括PCR引物一對(duì)及探針一條，該熒光探針是采用熒光標(biāo)記的覆蓋核苷酸還原酶亞單位M1基因檢測(cè)位點(diǎn)的鎖核苷酸探針，其5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。所述陽(yáng)性對(duì)照樣品為包含所檢測(cè)核苷酸還原酶亞單位M1基因檢測(cè)位點(diǎn)的混合質(zhì)?；蚪MDNA。本發(fā)明適用于各種組織、細(xì)胞、血液中RRM1表達(dá)水平mRNA的定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851371SQ20121033311
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者邵琦 申請(qǐng)人:廣州達(dá)健生物科技有限公司