專利名稱：一種基因載體系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物載體領(lǐng)域，特別涉及基因載體系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞以糾正基因的缺陷和異常引起的疾病，從而達(dá)到治療目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。利用載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞是一種基因治療的有效方法，成功的基因治療依賴于有效的基因載體。常見的載體包括病毒類載體和非病毒載體。其中，病毒類載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒類載體在臨床應(yīng)用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國“氣泡嬰兒”事件，在很大程度上都是由病毒類基因載體的不安全性造成的。非病毒載體多為高分子陽離子聚合物，因其安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已成為病毒類載體最有希望的替代者。陽離子聚合物聚乙烯亞 胺(PEI)是非病毒類載體中受到關(guān)注最多的一個(gè)，它已經(jīng)在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用，但由于其毒性高、轉(zhuǎn)染效率低、在體內(nèi)運(yùn)輸過程的非特異性吸附以及沒有靶向性的缺點(diǎn)，阻礙了它的進(jìn)一步發(fā)展(Boussif O, Zanta M. A, Behr J. P. et al. A VersatileVector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and inVivo-Polyethylenimine. PNASj 1995;92:7297-7301)。腫瘤的理想基因治療過程為載有基因物質(zhì)的基因載體在血液中循環(huán)，到達(dá)腫瘤組織后被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞并完成轉(zhuǎn)染治療。但是，血液中含有很多帶負(fù)電的蛋白類物質(zhì)，帶正點(diǎn)的載體容易與其吸附凝聚成大顆粒而發(fā)生沉淀(Liu, Y, and Reineke, T.M. Poly(glycoamidoamine)sfor gene delivery. Structural effects on cellularinternalization,buffering capacity,and gene expression.BioconjugateChem. 2007; 18，19-30.);而且，正常體液環(huán)境中的細(xì)胞表面帶負(fù)電，帶正電的載體也容易接近正常細(xì)胞，被正常細(xì)胞內(nèi)吞，因此，載體難于到達(dá)腫瘤組織，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。為了提高基因載體體系進(jìn)入目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，常用的方法是(1)引入遮蔽體系。遮蔽體系通常選用帶負(fù)電的高分子材料，復(fù)合在基因載體體系表面，使整個(gè)顆粒帶負(fù)電。避免在血液運(yùn)輸過程中的非特異性吸附。但是，單純的遮蔽體系會(huì)影響基因載體與目標(biāo)組織的結(jié)合效率。(2)引入靶向。在載體上引入對(duì)目標(biāo)細(xì)胞具有特異性結(jié)合能力的靶向配體，如精-甘-天短肽(RGD短肽)、葉酸等。但是，單純的靶向配體阻止不了載體體系的非特異性吸附。即使將兩者同時(shí)引入載體體系，由于遮蔽體系表面所帶的負(fù)電與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷產(chǎn)生斥力，也會(huì)影響載體體系與細(xì)胞的結(jié)合效率，即其轉(zhuǎn)染效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種基因載體系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染效率高。本發(fā)明提供了一種基因載體系統(tǒng)，包括祀向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)；
所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或SiRNA。優(yōu)選的，所述靶向配體與pH敏感遮蔽體系的質(zhì)量比為(O. f 10) :1，ρΗ敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(廣80):1，所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(O. 5 50):1。
·
優(yōu)選的，所述pH敏感遮蔽體系中，所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量為300(Tl3000，所述聚谷氨酸的分子量為3000 13000。優(yōu)選的，在所述靶向配體中，所述聚乙二醇的分子量為100(Γ2000，所述聚賴氨酸的分子量為2000 20000。優(yōu)選的，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺。本發(fā)明提供了一種基因載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟(A)將基因物質(zhì)與陽離子載體混合孵育，得到二元復(fù)合物；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或SiRNA ；(B)將所述二元復(fù)合物與pH敏感遮蔽體系混合，得到三元復(fù)合物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；(C)將所述三元復(fù)合物與靶向配體混合，得到基因載體系統(tǒng)；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。優(yōu)選的，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。優(yōu)選的，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。優(yōu)選的，所述靶向配體按照以下方法制備
將聚乙二醇與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇聚合物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。優(yōu)選的，所述步驟(A)中，所述孵育時(shí)間為1(Γ30分鐘。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基因載體系統(tǒng)包括靶向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)。所述pH敏感遮蔽體系含有聚賴氨酸鏈及聚天冬氨酸或聚谷氨酸鏈，因此具有PH值敏感性，在中性或偏堿性的環(huán)境中，其帶有負(fù)電荷，可以有效保護(hù)陽離子載體和基因物質(zhì)；在酸性環(huán)境下，其電荷翻轉(zhuǎn)，表 現(xiàn)為帶正電荷，有利于其接近表面帶有負(fù)電荷的細(xì)胞，從而提高基因載體系統(tǒng)與細(xì)胞的結(jié)合效率，提高轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，靶向配體可以伸展到陽離子載體的外圍，提高靶向配體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合率，從而提高基因載體系統(tǒng)與細(xì)胞的結(jié)合效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的基因載體系統(tǒng)對(duì)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)4. 4X IO5 8. 8 X 108RLU/mg Protein，對(duì) Huh 7 細(xì)胞的抑制效率可達(dá) 79% 84%。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。本發(fā)明實(shí)施例公開了一種基因載體系統(tǒng)，包括祀向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或SiRNA。按照本發(fā)明，所述基因載體系統(tǒng)中，所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量?jī)?yōu)選為100(Γ2000，更應(yīng)優(yōu)選為120(Γ1800，最優(yōu)選為140(Γ1600 ;本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對(duì)聚乙二醇兩端的羥基進(jìn)行改性，優(yōu)選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團(tuán)，如乙烯基，本發(fā)明對(duì)其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。所述聚賴氨酸的分子量?jī)?yōu)選為2000 20000，更優(yōu)選為5000 15000，最優(yōu)選為8000 12000。本發(fā)明對(duì)所述靶向配體的來源沒有特殊限制，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙二醇與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。在制備靶向配體的過程中，首先以聚乙二醇為引發(fā)劑，引發(fā)賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生開環(huán)聚合，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量?jī)?yōu)選為100(Γ2000，更應(yīng)優(yōu)選為120(Tl800，最優(yōu)選為140(Tl600 ;本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對(duì)聚乙二醇兩端的羥基進(jìn)行改性，優(yōu)選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團(tuán)，如乙烯基，本發(fā)明對(duì)其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。本發(fā)明對(duì)所述賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)夠買；所述賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐可以帶有保護(hù)基，也可以不帶有保護(hù)基。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果聚聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量為 300(T4000Da。得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，將其與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。本發(fā)明對(duì)所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。所述反應(yīng)的時(shí)間優(yōu) 選為2(T30h，所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為6(T80°C。所述反應(yīng)的催化劑優(yōu)選為偶氮異丁腈。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為N，N- 二甲基甲酰胺。按照本發(fā)明，所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物、超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物或超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為600 1000，優(yōu)選為600 800 ;所述聚賴氨酸的分子量為1000 25000，優(yōu)選為4000 8000 ；所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，優(yōu)選為300(Γ13000 ;所述聚谷氨酸的分子量為100(Γ25000，優(yōu)選為300(Γ13000。所述pH敏感遮蔽體系優(yōu)選為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物。所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物中超支化的聚乙烯亞胺分子量?jī)?yōu)選為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量?jī)?yōu)選為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量?jī)?yōu)選為300(Γ13000。本發(fā)明對(duì)所述pH敏感遮蔽體系的來源沒有特殊限制，當(dāng)其為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物時(shí)，首先以聚酰亞胺為引發(fā)劑，與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物后，將其與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為 3000 4000Da。當(dāng)所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，以聚乙烯亞胺為引發(fā)劑，將其與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。當(dāng)所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，以聚乙烯亞胺為引發(fā)劑，將其與谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。按照本發(fā)明，所述基因載體系統(tǒng)中的所述陽離子載體的作用為擔(dān)載基因物質(zhì)，其優(yōu)選為聚乙烯亞胺，所述聚乙烯亞胺的分子量?jī)?yōu)選為200(Γ4000，更優(yōu)選為2500。本發(fā)明對(duì)所述陽離子載體的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。按照本發(fā)明，所述基因載體系統(tǒng)中的所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。所述質(zhì) 粒DNA優(yōu)選為熒光素酶質(zhì)粒DNA ;所述siRNA優(yōu)選為沉默熒光素酶的Luc siRNA,其序列為5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。按在本發(fā)明，在所述基因載體系統(tǒng)中，所述靶向配體與pH敏感遮蔽體系的質(zhì)量比優(yōu)選為(O. Γ10):1,更優(yōu)選為(21):1 ;ρΗ敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(Γ80):1,更優(yōu)選為(1(Γ70) :1 ;所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(O. 5 50) :1，更優(yōu)選為(2 40) : I。本發(fā)明提供了一種基因載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟(A)將基因物質(zhì)與陽離子載體混合孵育，得到二元復(fù)合物；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA ;(B)將所述二元復(fù)合物與pH敏感遮蔽體系混合，得到三元復(fù)合物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；
(C)將所述三元復(fù)合物與靶向配體混合，得到基因載體系統(tǒng)；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。按照本發(fā)明，首先將基因物質(zhì)與陽離子載體混合孵育。所述陽離子載體的作用為擔(dān)載基因物質(zhì)，其優(yōu)選為聚乙烯亞胺，所述聚乙烯亞胺的分子量?jī)?yōu)選為200(Γ4000，更優(yōu)選為2500。本發(fā)明對(duì)所述陽離子載體的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。所述質(zhì)粒DNA優(yōu)選為熒光素酶質(zhì)粒DNA ;所述siRNA優(yōu)選為沉默熒光素酶的Luc siRNA，其序列為Y -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(O. 5 50): 1，更優(yōu)選為(2 40):1。所述混合孵育的溶劑優(yōu)選為水，為了混合孵育的效果更好，優(yōu)選首選將基因物質(zhì)與陽離子載體分別溶于水，形成水溶液后再將兩者的水溶液進(jìn)行混合孵育，所述基因物質(zhì)水溶液的濃度優(yōu)選為O. 02^2mg/mL ;所述陽離子載體水溶液的濃度優(yōu)選為O. 02 2mg/mL。所述混合孵育的時(shí)間優(yōu)選為1(Γ30分鐘?；蛭镔|(zhì)與陽離子載體混合孵育后，得到二元復(fù)合物。然后，將所述二元復(fù)合物與PH敏感遮蔽體系混合。所述混合時(shí)所用的溶劑優(yōu)選為水。為了保證混合均勻，優(yōu)選將pH敏感遮蔽體系溶于水，形成水溶液后再與二元復(fù)合物進(jìn)行混合，所述PH敏感遮蔽體系水溶液的的濃度優(yōu)選為O. 02 2mg/mL，其pH值優(yōu)選為7. 4。所述混合的時(shí)間優(yōu)選為1(Γ30分鐘。所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物、超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物或超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，優(yōu)選為600 800 ;所述聚賴氨酸的分子量為1000 25000，優(yōu)選為4000 8000 ;所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，優(yōu)選為3000 13000 ;所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000，優(yōu)選為3000^13000.所述pH敏感遮蔽體系優(yōu)選為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物。所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物中超支化的聚乙烯亞胺分子量?jī)?yōu)選為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量?jī)?yōu)選為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量?jī)?yōu)選為300(Γ13000。本發(fā)明對(duì)所述pH敏感遮蔽體系的來源沒有特殊限制，當(dāng)其為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物時(shí)，首先以聚酰亞胺為引發(fā)劑，與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物后，將其與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為 3000 4000Da。當(dāng)所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，以聚乙烯亞胺為引發(fā)劑，將其與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。當(dāng)所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物時(shí)，以聚乙烯亞胺為引發(fā)劑，將其與谷氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規(guī)共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。按照本發(fā)明，將所述二元復(fù)合物與pH敏感遮蔽體系混合后，得到三元復(fù)合物。最后，將所述三元復(fù)合物與靶向配體混合，得到基因載體系統(tǒng)。所述混合時(shí)所用的溶劑優(yōu)選為水。為了保證混合均勻，優(yōu)選將靶向配體溶于水，形成水溶液后再與三元復(fù)合物進(jìn)行混合，所述靶向配體水溶液的濃度優(yōu)選為O. 02 2mg/mL。所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量?jī)?yōu)選為100(Γ2000，更應(yīng)優(yōu)選為120(Tl800，最優(yōu)選為140(Tl600 ;本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對(duì)聚乙二醇兩端的羥基進(jìn)行改性，優(yōu)選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團(tuán)，如乙烯基，本發(fā)明對(duì)其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。所述聚賴氨酸的分子量?jī)?yōu)選為200(Γ20000，更優(yōu)選為500(Γ15000，最優(yōu)選為800(Tl2000。本發(fā)明對(duì)所述靶向配體的來源沒有特殊限制，優(yōu)選按照以下方法制備將聚乙二醇與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；
將所述聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。在制備靶向配體的過程中，首先以聚乙二醇為引發(fā)劑，引發(fā)賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生開環(huán)聚合，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量?jī)?yōu)選為100(Γ2000，更應(yīng)優(yōu)選為120(Tl800，最優(yōu)選為140(Tl600 ;本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對(duì)聚乙二醇兩端的羥基進(jìn)行改性，優(yōu)選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團(tuán)，如乙烯基，本發(fā)明對(duì)其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。本發(fā)明對(duì)所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。本發(fā)明對(duì)所述賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)夠買；所述賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐可以帶有保護(hù)基，也可以不帶有保護(hù)基。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為6(T80h，更優(yōu)選為62 78h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為2(T40°C。所述反應(yīng)結(jié)束后，如果聚聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物帶有保護(hù)基，可以對(duì)所述保護(hù)基進(jìn)行脫除。本發(fā)明對(duì)所述脫保護(hù)的方法沒有特殊限制，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行。所述反應(yīng)結(jié)束后，優(yōu)選經(jīng)過透析并凍干，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量為 300(T4000Da。得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，將其與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。本發(fā)明對(duì)所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的來源沒有特殊限制，可以由市場(chǎng)購買。所述反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為2(T30h，所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為6(T80°C。所述反應(yīng)的催化劑優(yōu)選為偶氮異丁腈。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為N，N- 二甲基甲酰胺。將得到的基因載體系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明，本發(fā)明提供的基因載體系統(tǒng)對(duì)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)4X IO5 8X 108RLU/mgProtein，對(duì)Huh 7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)79% 84。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的基因載體系統(tǒng)及其制備方法進(jìn)行說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受以下實(shí)施例的限制。實(shí)施例I將3克分子量為3000的聚乙二醇溶于30mLDMF中，得到第一溶液；將ε -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐溶于30mLDMF中，得到第二溶液。將第二溶液注射到第一溶液中，30°C反應(yīng)72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用乙醚沉降，過濾干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氫的乙酸溶液，在室溫下脫保護(hù)2小時(shí)，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，換水6次，產(chǎn)物冷凍干燥后得到聚乙二醇-聚賴氨酸的共聚物。將Imol聚乙二醇-聚賴氨酸的共聚物與Imol帶巰基的RGD和Imol偶氮二異丁腈溶解在30mL無水無氧的DMF中，在70°C下反應(yīng)24小時(shí)，得到精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物，即靶向配體。實(shí)施例2-9分別將聚乙烯亞胺(PEI)和天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐溶于二氯甲烷和DMF的混合溶劑中，二氯甲烷和DMF的體積比為1:2。將兩者混合，在30°C下反應(yīng)72小時(shí)。然后加入ε -芐 氧羰基-L-賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐的二氯甲烷和DMF的混合溶液，35°C反應(yīng)72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用乙醚沉降，過濾干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氫的乙酸溶液，在室溫下脫保護(hù)2小時(shí)，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，換水6次，產(chǎn)物冷凍干燥后得到聚乙二醇-聚天冬氨酸-聚賴氨酸的嵌段共聚物共聚物，記為PEI-b-PLAA-b-PLL。使用不同分子量的引發(fā)劑PEI,改變賴氨酸-NCA和天冬氨酸-NCA的摩爾量，可以得到不同分子量和組成的PEI-b-PLAA-b-PLL。其分子組成以及在不同pH值是的粒徑和電位數(shù)值如表I所示。表I實(shí)施例2、的原料、比例及產(chǎn)物的顆粒大小和表面電位
權(quán)利要求
1.一種基因載體系統(tǒng)，包括靶向配體、PH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)； 所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物； 所述PH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ； 所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述靶向配體與PH敏感遮蔽體系的質(zhì)量比為(O. f 10) :1，pH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質(zhì)量比為(廣80) :1，所述陽離子載體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為(O. 5^50) :10
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述pH敏感遮蔽體系中，所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量為3000 13000，所述聚谷氨酸的分子量為3000 13000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，在所述靶向配體中，所述聚乙二醇的分子量為100(Γ2000，所述聚賴氨酸的分子量為200(Γ20000。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因載體系統(tǒng)，其特征在于，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺。
6.一種基因載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟 (A)將基因物質(zhì)與陽離子載體混合孵育，得到二元復(fù)合物； 所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA ; (B)將所述二元復(fù)合物與pH敏感遮蔽體系混合,得到三元復(fù)合物； 所述PH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ； (C)將所述三元復(fù)合物與靶向配體混合，得到基因載體系統(tǒng)； 所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物按照以下方法制備 將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐和賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物按照以下方法制備 將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物； 將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐發(fā)生聚合反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述靶向配體按照以下方法制備 將聚乙二醇與賴氨酸-N-內(nèi)羧酸酐反應(yīng)，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇聚合物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發(fā)生反應(yīng)，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(A)中，所述孵育時(shí)間為10 30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基因載體系統(tǒng)，包括靶向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質(zhì)；所述靶向配體為精-甘-天短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規(guī)則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規(guī)共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規(guī)共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為600~1000，所述聚賴氨酸的分子量為1000~25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000~25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000~25000；所述基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或siRNA。所述基因載體系統(tǒng)可與細(xì)胞有效結(jié)合，轉(zhuǎn)染效率高。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102816795SQ201210310840
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者田華雨, 董璇, 陳學(xué)思, 郭兆培 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所