專利名稱：一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白表達(dá)領(lǐng)域，涉及一種用生物工程技術(shù)高效制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，產(chǎn)物可作為抗原物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物免疫，篩選相關(guān)抗體，同時(shí)為臨床化學(xué)診斷所需校準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考品的制備開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase AST),原名谷草轉(zhuǎn)移酶(glutamic oxaloacetic transaminase GOT),是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶,在體內(nèi)各組織中廣泛存在，AST以心臟活性最高。正常人血清中含量甚微。正常情況下，血液中來自肝細(xì)胞的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的范圍是0-40U/L (單位)。當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶會(huì)大量釋放到人體血液中，導(dǎo)致血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高；當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，同樣會(huì)檢測(cè)到血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶的值升高。肝內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶有2種同工酶，分別存在于肝細(xì)胞的線粒體(mAST)和胞漿內(nèi)(sAST)。在肝細(xì)胞輕度病變時(shí)，僅sAST釋放入血；而當(dāng)病變嚴(yán)重時(shí)，mAST也會(huì)相繼釋放入血。故血清AST活性隨肝細(xì)胞損害的程度增高。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是肝功能檢查里重要的一項(xiàng)，可以檢驗(yàn)肝組織是否受損。在肝功能檢查中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶是反映肝細(xì)胞受損的指標(biāo)，而天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是反映肝細(xì)胞壞死的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于肝硬化、肝纖維化、肝癌的檢測(cè)非常準(zhǔn)確。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶可以和谷丙轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合起來反映肝功能的狀況，比如谷丙轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比值均在
I.O以下為肝硬化或早期肝硬化患者。我國(guó)幅員遼闊，人口眾多，臨床診斷試劑市場(chǎng)巨大，前景廣闊。就國(guó)內(nèi)的現(xiàn)狀來說，我國(guó)的診斷試劑行業(yè)仍處于成長(zhǎng)初期，即產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)的投入初期，成長(zhǎng)期還沒有真正到來，而我國(guó)診斷試劑市場(chǎng)規(guī)模約為全球市場(chǎng)的I / 14，有較大的成長(zhǎng)空間。研制價(jià)廉物美的診斷試劑產(chǎn)品無疑是非常必要且具重要意義的。目前國(guó)外的產(chǎn)品通常是把試劑、參考品(校準(zhǔn)品、質(zhì)控品)、儀器作為一個(gè)系統(tǒng)(封閉系統(tǒng))推入市場(chǎng)，在檢測(cè)重復(fù)性、準(zhǔn)確性上有很大的優(yōu)勢(shì)，并且具有市場(chǎng)壟斷性。國(guó)內(nèi)主要的診斷試劑生產(chǎn)廠家?guī)缀醵紱]有生產(chǎn)相應(yīng)質(zhì)控品的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)力，市場(chǎng)上認(rèn)可的國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品寥寥無幾。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、制備成本低廉，成功率高的制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，該方法包括I)改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；2)將步驟I)中改造后的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列插入表達(dá)載體中，并用大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)化表達(dá)；3)將轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)；4)所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；其中，步驟I)中改造后的全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列為
權(quán)利要求
1.一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，該方法包括 1)改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子; 2)將步驟I)中改造后的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列插入表達(dá)載體中，并用大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)化表達(dá)； 3)將轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)； 4)所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化； 其中，步驟I)中改造后的全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列為
2.如權(quán)利要求I所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，步驟 2)中所述表達(dá)載體為pRSF Duet, pET表達(dá)系列。
3.如權(quán)利要求I所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，步驟2)中所述大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。
4.如權(quán)利要求3所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，所述BL21(DE3)菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體的基因。
5.如權(quán)利要求4所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，\噬菌體DE3區(qū)含有17噬菌體RNA聚合酶，該區(qū)整合于BL21的染色體上形成所述BL21 (DE3)。
6.如權(quán)利要求I所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，步驟4)中所述破菌方法為高壓破碎、超聲或者溶菌酶酶解。
7.—種如權(quán)利要求I所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法在校準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考品制備中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的純品添加入人源或動(dòng)物源的血清，配制成指定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品。
9.一種利用權(quán)利要求I所述制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法制成的產(chǎn)物作為免疫用的抗原物質(zhì)，來篩選相關(guān)抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的方法及應(yīng)用，該方法包括改造全基因合成人源化天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列，去除大腸桿菌稀有密碼子；將改造后的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因序列插入表達(dá)載體中，并用大腸桿菌菌株轉(zhuǎn)化表達(dá)；將轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)；所得菌體破菌，離心分離，過Ni-NTA柱純化；本發(fā)明制備天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶操作非常簡(jiǎn)單，制備成本低，成品產(chǎn)率高，純度高而且具有高生物活性，作為抗原物質(zhì)可進(jìn)行動(dòng)物免疫，篩選相關(guān)抗體，同時(shí)為盡快建立國(guó)內(nèi)臨床化學(xué)診斷急需的校準(zhǔn)品制備平臺(tái)，研制診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考品奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/52GK102807988SQ20121029144
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者肖飛, 黃薇, 王大光 申請(qǐng)人:北京翔達(dá)盛吉科技咨詢有限公司