專利名稱：酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)l—鳥(niǎo)氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-鳥(niǎo)氨酸的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。L-鳥(niǎo)氨酸的制備方法主要有化學(xué)法和發(fā)酵法，其中化學(xué)法是以精氨酸為原料，經(jīng)堿法水解或利用精氨酸酶水解得到L-鳥(niǎo)氨酸；而發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸，常用于發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的微生物有谷氨酸棒桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌、大腸桿菌、解烴棒桿菌、潔白鏈霉菌等。由于化學(xué)法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸條件苛刻，大量使用有機(jī)溶劑，給環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重污染；而發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量低(一般只有10g/L)，周期長(zhǎng)，產(chǎn)物雜質(zhì)多，分離困難；采用上述方法制備L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)率不高，所以生產(chǎn)的L-鳥(niǎo)氨酸成本很高，給實(shí)際推廣應(yīng)用帶來(lái)了很大困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種L-鳥(niǎo)氨酸的制備方法，該制備方法通過(guò)對(duì)糞腸球菌進(jìn)行篩選、誘變獲得一株L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)率很高、專一性強(qiáng)的菌株糞腸球菌CGMCC NO.1786，選用合適的培養(yǎng)基在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，加入精氨酸，在最佳轉(zhuǎn)化條件下酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸，轉(zhuǎn)化液通過(guò)離子交換樹(shù)脂柱的分離、純化后，可得到高純度的L-鳥(niǎo)氨酸。該方法具有生產(chǎn)條件溫和、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品純度高、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸，該方法由下列工藝步驟組成(1)將糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；(2)將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；(3)將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；(4)加入精氨酸作為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(5)L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化。
本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是
步驟(1)中斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份；制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
步驟(2)中種子液和步驟(3)中發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10-15％，pH值為6.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，通風(fēng)量為0.5-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)。
步驟(4)中轉(zhuǎn)化條件為底物精氨酸質(zhì)量濃度為120-150g/l，轉(zhuǎn)化溫度為30-55℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為80-120轉(zhuǎn)/分鐘。在此轉(zhuǎn)化條件下，精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95-99.5％，每升發(fā)酵液中含L-鳥(niǎo)氨酸90-112g。
步驟(5)中α-熊果苷的分離純化包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、把經(jīng)過(guò)a步驟后的發(fā)酵液通過(guò)弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱除去陽(yáng)離子雜質(zhì)，弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為724型樹(shù)脂柱；c、把經(jīng)過(guò)b步驟的發(fā)酵液通過(guò)磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)一步進(jìn)行分離純化，磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為D001樹(shù)脂柱；d、把經(jīng)過(guò)c步驟的發(fā)酵液真空濃縮、結(jié)晶，即可得到純度為99％以上的L-鳥(niǎo)氨酸，真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為60度，干燥后的成品為白色粉末狀。
本發(fā)明所用的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為糞腸球菌CGMCC NO.1786，保藏時(shí)間為2006年8月28日。
糞腸球菌CGMCC NO.1786的篩選，由下列工藝步驟組成(1)將安培管糞腸球菌菌種接種斜面制得斜面菌種；(2)將復(fù)壯后菌種涂布平板；(3)將平板菌落接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行初篩和復(fù)篩；(4)將復(fù)篩后的菌株進(jìn)行復(fù)合誘變。
步驟(1)中斜面培養(yǎng)基和步驟(2)中的平板培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份；制備斜面菌種和平板的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
步驟(3)中發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為pH值為7.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)。
步驟(4)中誘變依次包括種子菌懸液的制備，誘變劑的加入量，紫外照射時(shí)。
將斜面菌種接種到含5ml生理鹽水試管中，往試管中加入體積百分比為0.5％-2.0％的硫酸二乙酯誘變劑，在漩渦振蕩器上振蕩1-2min，取0.5ml該菌懸液涂布平板，把平板放在紫外燈照射20-60s，然后把平板暗培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)。
最后，得到糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于本發(fā)明是糞腸球菌CGMCC NO.1786酶法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸，具有生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)條件溫和，轉(zhuǎn)化體系中雜質(zhì)較少，工藝步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)操作安全等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量高，每升發(fā)酵液中含有90-112g L-鳥(niǎo)氨酸，精氨酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5％。通過(guò)離子交換樹(shù)脂分離純化，純度可達(dá)到99.5％以上，具有重大工業(yè)化意義。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1(1)菌種斜面培養(yǎng)將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中菌種斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖5份、尿素20份、玉米漿3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.5、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按10％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖60份、尿素15份、玉米漿3.0份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10％，pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，通風(fēng)量為0.8vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)。
(3)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸加入底物質(zhì)量濃度為150g/l；其中轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化溫度為35℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘。在此轉(zhuǎn)化條件下，精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)99.5％，每升發(fā)酵液中含L-鳥(niǎo)氨酸112g。
(4)L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經(jīng)過(guò)a步驟后的發(fā)酵液通過(guò)724型弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子雜質(zhì)；c、把經(jīng)過(guò)b步驟的發(fā)酵液通過(guò)D001磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)一步進(jìn)行分離純化；d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)99.5％。
實(shí)施例2(1)菌種斜面培養(yǎng)將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中菌種斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖8份、尿素15份、玉米漿3.0份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；制備斜面菌種的工藝條件為pH值為8.0、溫度40℃、培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；
將種子液按10％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖50份、尿素20份、玉米漿3.5份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10％，pH值為6.5，培養(yǎng)溫度為37℃，通風(fēng)量為1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)。
(3)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸加入底物質(zhì)量濃度為135g/l；其中轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化溫度為44℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘。在此轉(zhuǎn)化條件下，精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95.0％，每升發(fā)酵液中含L-鳥(niǎo)氨酸96.2g。
(4)L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經(jīng)過(guò)a步驟后的發(fā)酵液通過(guò)724型弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子雜質(zhì)；c、把經(jīng)過(guò)b步驟的發(fā)酵液通過(guò)D001磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)一步進(jìn)行分離純化；d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)99.5％。
實(shí)施例3(1)菌種斜面培養(yǎng)將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；其中菌種斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖10份、尿素10份、玉米漿2.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0、溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
(2)接種發(fā)酵將斜面菌株擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；將種子液按15％的接種量接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵；其中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖45份、尿素20份、玉米漿3.0份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；
發(fā)酵的工藝條件為發(fā)酵液接種量為10％，pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，通風(fēng)量為0.8vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)。
(3)生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸加入底物質(zhì)量濃度為125g/l；其中轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘。在此轉(zhuǎn)化條件下，精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)98.5％，每升發(fā)酵液中含L-鳥(niǎo)氨酸92.4g。
(4)L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化，包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經(jīng)過(guò)a步驟后的發(fā)酵液通過(guò)724型弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子雜質(zhì)；c、把經(jīng)過(guò)b步驟的發(fā)酵液通過(guò)D001磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)一步進(jìn)行分離純化；d、步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，干燥后的成品為白色粉末狀，純度達(dá)99.5％。
權(quán)利要求
1.酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于所述的糞腸球菌酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸，生產(chǎn)過(guò)程由下列工藝步驟組成(1)將糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養(yǎng)基制成斜面菌種；(2)將斜面菌種擴(kuò)大培養(yǎng)作為種子液；(3)將種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵條件為發(fā)酵液接種量為10-15％，pH值為6.0-7.5，培養(yǎng)溫度為25-35℃，通風(fēng)量為0.5-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為120-160轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)；(4)加入精氨酸作為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化條件為底物精氨酸質(zhì)量濃度為120-150g/l，轉(zhuǎn)化溫度為30-55℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為36-72小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為80-120轉(zhuǎn)/分鐘。在此轉(zhuǎn)化條件下，精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95-99.5％，每升發(fā)酵液中含L-鳥(niǎo)氨酸90-112g；(5)L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于所述的(1)步驟中的斜面培養(yǎng)基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于制備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養(yǎng)時(shí)間為24-48小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于所述的(2)步驟中的種子液和(3)步驟中發(fā)酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于所述的(5)步驟中的L-鳥(niǎo)氨酸的分離純化包括以下四個(gè)步驟a、將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液離心除去菌體；b、把經(jīng)過(guò)a步驟后的發(fā)酵液通過(guò)弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱除去陽(yáng)離子雜質(zhì)；c、把經(jīng)過(guò)b步驟的發(fā)酵液通過(guò)磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)一步進(jìn)行分離純化；d、把經(jīng)過(guò)c步驟的發(fā)酵液真空濃縮、結(jié)晶，即可得到純度為99.5％以上的L-鳥(niǎo)氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于所述的a步驟發(fā)酵液在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘；b步驟中的弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為724型樹(shù)脂柱；c步驟中的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱為D001樹(shù)脂柱；d步驟中的真空干燥真空度為0.1Mpa，溫度為60度，干燥后的成品純度達(dá)99.5％以上。
7.糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
全文摘要
本發(fā)明涉及L－鳥(niǎo)氨酸的制備方法，它包括斜面種子的制備，培養(yǎng)基的選擇，轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和產(chǎn)物的提取等工藝步驟。本發(fā)明通過(guò)糞腸球菌酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L－鳥(niǎo)氨酸，具有生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)條件溫和，轉(zhuǎn)化體系中雜質(zhì)較少，工藝步驟簡(jiǎn)單，生產(chǎn)操作安全等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明生產(chǎn)L－鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量高，每升發(fā)酵液中含有90－112g L－鳥(niǎo)氨酸，精氨酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5％。L－鳥(niǎo)氨酸是細(xì)胞中重要的代謝化合物，對(duì)于生物體內(nèi)氨態(tài)氮的排出有重要調(diào)節(jié)作用；此外，L－鳥(niǎo)氨酸還是重要的醫(yī)藥工業(yè)基礎(chǔ)原料。
文檔編號(hào)C12R1/01GK1908177SQ20061011203
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月29日
發(fā)明者張鵬, 張淑榮, 劉春巧, 楊育紅 申請(qǐng)人:張鵬, 張淑榮, 劉春巧