專利名稱：可靶向激活traf6信號(hào)通路的融合蛋白及其重組載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白的構(gòu)建，特別涉及一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白及其重組載體與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TNF receptor-associated factor6, TRAF6)是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)分子，它具有廣泛而且極其重要的生理功能。TRAF6對(duì)于牙齒形成、淋巴結(jié)形成、破骨細(xì)胞形成是必不可少的；TRAF6能指導(dǎo)胸腺髓質(zhì)微細(xì)構(gòu)造的形成從而控制機(jī)體的中樞免疫耐受；TRAF6是調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵因子；TRAF6在固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用；TRAF6對(duì)于二級(jí)淋巴器官B細(xì)胞濾泡的形成和維持是必 不可少的；TRAF6還是炎性反應(yīng)中的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子等等。以上研究預(yù)示TRAF6是上述疾病治療中的一個(gè)極其重要的靶標(biāo)分子。通常情況下，選擇TRAF6對(duì)上述疾病進(jìn)行治療時(shí)首選利用相應(yīng)配體激活TRAF6上游受體，然而，TRAF6可傳導(dǎo)來自細(xì)胞表面的多個(gè)受體的信號(hào)，這些受體表達(dá)在多種細(xì)胞上，當(dāng)利用受體的配體激活TRAF6信號(hào)通路時(shí)，常常會(huì)引起許多的副作用，有的甚至是致死性的。因此，需要對(duì)TRAF6進(jìn)行改造，使其既保留TRAF6的功能，又要克服其引起副作用的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供含有編碼上述融合蛋白的核苷酸序列的重組載體。本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示MSLLNCENSCGSSQSSSDCCAAMAASCSAAVKDDSVSGSASTGNLSSSFMEEIQGYDVEFDPPLESKYECPICLMALREAVQTPCGHRFCKACIIKSIRDAGHKCPVDNEILLENQLFPDNFAKREIL SLTVKCPNKGCLQKMELRHLEDHQVHCEFALVNCPQCQRPFQKCQVNTHIIEDCPRRQVSCVNCAVSMAYEEKEIHDQSCPLANIICEYCGTILIREQMPNHYDLDCPTAPIPCTFSVFGCHEKMQRNHLARHLQENTQLHMRLLAQAVHNVNLALRPCDAASPSRGCRPEDPNYEETIKQLESRLVRQDHQIRELTAKMETQSMYVGELKRTIRTLEDKVAEMEAQQCNGIMSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGYPYDVPDYAI ；編碼所述的可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白的核苷酸序列如下所示
ATGAGTCTCTTAAACTGTGAGAACAGCTGCGGGTCCAGCCAGTCGTCCAGTGACTGCTGCGCTGCCATGGCCGCCTCCTGCAGCGCTGCAGTGAAAGATGACAGCGTGAGTGGCTCTGCCAGCACCGGGAACCTCTCCAGCTCCTTCATGGAGGAGATCCAGGGCTACGATGTGGAGTTTGACCCACCTCTGGAGAGCAAGTATGAGTGTCCCATCTGCTTGATGGCTTTACGGGAAGCAGTGCAAACACCATGTGGCCACAGGTTCTGCAAAGCCTGCATCATCAAATCCATAAGGGATGCAGGGCACAAGTGCCCAGTTGACAATGAAATACTGCTGGAAAATCAACTGTTTCCCGACAATTTTGCAAAGCGAGAGATTCTTTCCCTGACGGTAAAGTGCCCAAATAAAGGCTGTTTGCAAAAGATGGAACTGAGACATCTCGAGGATCATCAAGTACATTGTGAATTTGCTCTAGTGAATTGTCCCCAGTGCCAACGTCCTTTCCAGAAGTGCCAGGTTAATACACACATTATTGAGGATTGTCCCAGGAGGCAGGTTTCTTGTGTAAACTGTGCTGTGTCCATGGCATATGAAGAGAAAGAGATCCATGATCAAAGCTGTCCTCTGGCAAATATCATCTGTGAATACTGTGGTACAATCCTCATCAGAGAACAGATGCCTAATCATTATGATCTGGACTGCCCAACAGCTCCAATCCCTTGCACATTCAGTGTTTTTGGCTGTCATGAAAAGATGCAGAGGAATCACTTGGCACGACACTTGCAAGAGAATACCCAGTTGCACATGAGACTGTTGGCCCAGGCTGTTCATAATGTTAACCTTGCTTTGCGTCCGTGCGATGCCGCCTCTCCATCCCGGGGATGTCGTCCAGAGGACCCAAATTATGAGGAAACTATCAAACAGTTGGAGAGTCGCCTAGTAAGACAGGACCATCAGATCCGGGAGCTGACTGCCAAAATGGAAACTCAGAGTATGTACGTGGGCGAGCTCAAACGGACCATTCGGACCCTGGAGGACAAGGTTGCCGAAATGGAAGCACAGCAGTGTAACGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCC CGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAA ；一種重組載體，含有上述核苷酸序列的基因；所述的重組載體優(yōu)選為將上述核苷酸序列的基因克隆至慢病毒載體得到；所述的慢病毒載體優(yōu)選為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus ；所述的重組載體優(yōu)選為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重組質(zhì)粒，其通過如下方法制備得到(I)以結(jié)核桿菌DNA為模板，以FP和RP為引物，PCR反應(yīng)獲得Gyrase B基因；FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ；(2)通過EcoR I酶和Spe I酶分別雙酶切pENTR_2B載體和步驟(I)得到的Gyrase B基因，酶切后純化，得到雙酶切的pENTR_2B載體和雙酶切的GyraseB基因；再將雙酶切的PENTR-2B載體和雙酶切的Gyrase B基因連接，得到重組載體pENTR-2B_GyraseB-HA ;用EcoR I酶單酶切重組載體pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到單酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA ；(3)以小鼠脾臟cDNA為模板，F(xiàn)P2和RP2為引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段；用EcoRI酶單酶切包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段，得到單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段；FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAG ；RP2 ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC ；(4)將步驟(2)得到的單酶切后的pENTR-2B_Gyrase B-HA和步驟(3)得到的單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段連接，得到重組載體 PENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH ；(5)通過 Gateway 技術(shù)將位于重組載體 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC_GH 上的T6RZ-GH雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重組質(zhì)粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH ；
步驟(I)和(2)中所述的PCR反應(yīng)的條件優(yōu)選為94 V 2min ；94 V 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；步驟(5)所述的Gateway技術(shù)的反應(yīng)體系優(yōu)選為
pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GHI OOng
CSII-EF-RfA-IRES2-Venus150ng
LR cionase II enzyme mixI μ I
TE (IOrnM Tris-HC! , ImMEDTA, pH 俏為 8) 補(bǔ)傘:9μ.1;反應(yīng)條件優(yōu)選為25°C下反應(yīng)6小時(shí)，加1μ I蛋白酶K (濃度為2 μ g/μ I )，37°C反應(yīng)10分鐘；所述的重組載體在TRAF6功能研究中的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(I)本發(fā)明提供的融合蛋白為利用一段gyrase B序列代替小鼠TRAF6的C末端得至IJ。該融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，能接受小分子藥物香豆霉素的持續(xù)刺激，靶向激活TRAF6依存的信號(hào)通路，從而可避免利用受體的配體激活TRAF6信號(hào)通路進(jìn)行疾病治療時(shí)引起的副作用。(2)本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)重組小鼠TRAF6質(zhì)粒，可表達(dá)上述融合蛋白，載體骨架為慢病毒質(zhì)粒，利用慢病毒轉(zhuǎn)染，既適合于體內(nèi)研究也適合于體外研究，既可用于分裂細(xì)胞也可用于非分裂細(xì)胞，既能用于短暫研究也能用于長(zhǎng)期觀察；轉(zhuǎn)染效率能通過細(xì)胞的綠色熒光確定。因此，重組小鼠TRAF6基因慢病毒質(zhì)粒對(duì)于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病治療研究都具有極其重要的價(jià)值。重組小鼠TRAF6慢病毒質(zhì)粒有著非常大的商業(yè)價(jià)值。香豆霉素刺激導(dǎo)入重組小鼠TRAF6慢病毒質(zhì)粒后的細(xì)胞，I K Ba的磷酸化效果與IL-I刺激的未導(dǎo)入重組小鼠TRAF6慢病毒質(zhì)粒后的細(xì)胞相同。


圖I是蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)TRAF6融合蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖。圖2是蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)不同濃度香豆霉素靶向刺激的TRAF6特異性依存的I K Ba的磷酸化表達(dá)，IL-I刺激的I K B a的磷酸化作為陽性對(duì)照。
圖3是濃度為O. 05 μ M的香豆霉素不同時(shí)間內(nèi)靶向刺激的TRAF6特異性依存的I K Ba的磷酸化表達(dá)，微管蛋白作為內(nèi)參。圖4是濃度為O. 05 μ M的香豆霉素不同時(shí)間內(nèi)刺激的未導(dǎo)入任何質(zhì)粒的3Τ3細(xì)胞后的I K Ba的磷酸化表達(dá)，微管蛋白作為內(nèi)參。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步 詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I(I)重組載體 pENTR_2B-Gyrase B-HA 的制備①通過PCR反應(yīng)獲得Gyrase B基因，引物(均為5’ _3’，華大基因公司合成)如下所示FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC。按照以下體系配合PCR反應(yīng)液
結(jié)核桿菌 DNA (購(gòu)自 Invitrogen)200ng
IOx高保真PCR緩沖液5μ1
IOmM dNTP 浞介液Ιμ
SOmM硫酸鎂2μ1
ΙΟμΜ FP2μ1 ΙΟμΜΚΡ2μ1 Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(購(gòu)自 Invitrogen) 0·2μ1
滅菌蒸餾水至50μ1。按照下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)起始變性94 V 2min ；變性94 V 15sec、復(fù)性550C 15sec、延伸 68°C 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0②在步驟①得到的PCR產(chǎn)物中加入2. 5倍體積冰凍的無水乙醇(同時(shí)加入O. I倍、PH5. 6的3M醋酸鈉)沉淀，該沉淀物按以下反應(yīng)體系配合PCR沉淀物
IOxH酶切緩沖液2μ1
EcoR I (:購(gòu)〔I TAKARA)Ιμ (購(gòu)自 TAKARA)Ιμ
滅菌蒸餾水至20μ1;以上反應(yīng)體系37°C處理2小時(shí)，電泳，回收Gyrase B基因片段。按照以下體系配合酶切反應(yīng)體系
pENTR-2B 載體(購(gòu)自 Invitrogen)Ipg
IOxH酶切緩沖液2μ1
EcoR I (購(gòu)自 TAKARA)I μ
凈el (購(gòu)自 TAKARA)Ιμ
滅菌蒸餾水至20μ1;以上反應(yīng)體系37°C處理2小時(shí)，電泳，回收目的片段。將酶切后的pENTR-2B載體與酶切后的Gyrase B基因片段進(jìn)行連接，得到重組載體 pENTR-2B-Gyrase B-HA (以下簡(jiǎn)稱 pENTR_2B_GH)。連接體系如下雙鏈DNA 片段 lOOng、pENTR-2B 載體 20ng、DNA LigationKitVer. 2. O (購(gòu)自TAKARA公司)5 μ 1，雙蒸水補(bǔ)至10 μ I。16°C連接12小時(shí)，接著用1μ I連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a (購(gòu)自TAKARA公司)，培養(yǎng)于依據(jù)分子克隆配方配制的LB固體培養(yǎng)基，其中含有50 μ g/ml的卡那霉素進(jìn)行選擇。生長(zhǎng)出來的克隆即為陽性克隆，挑取陽性克隆培養(yǎng)于依據(jù)分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，抽提，得到重組載體，通過測(cè)序，確定得到含有Gyrase B基因序列(如下所示)和通過引物RP加入的HA序列的重組質(zhì)粒pENTR_2B_GH。 ATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCCCGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGC。(2)重組載體 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH 的制備①通過PCR反應(yīng)獲得包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段，引物(均為5’ _3’，華大基因公司合成)如下所示FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAGRP2 :ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC。按照以下體系配合PCR反應(yīng)液cDNA模板(按照常規(guī)方法由3μ g來自C57BL/6J小鼠(購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)脾臟的RNA合成)2μ1IOx高保真PCR緩沖液5μ1
i0m!Vi dNTP 浞介液Ιμ
SOmM硫酸鎂2μ1
ΙΟμΜ FP22μΙ
ΙΟμΜ RP22μ1
Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(購(gòu)自 Invitrogen)0.2μ1
滅菌蒸餾水至50μ1。按照下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)起始變性94 V 2min ；變性94 V 15sec、復(fù)性 550C 15sec、延伸 68°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0②在步驟①得到的PCR產(chǎn)物中加入2. 5倍體積冰凍的無水乙醇(同時(shí)加入O. I倍、PH5. 6的3M醋酸鈉)沉淀，該沉淀物按以下反應(yīng)體系配合
PCR沉淀物
IOxH酶切緩沖液2μ1
EcoR I (購(gòu)自 TAKARA)I μ
滅菌蒸餾水至20_以上反應(yīng)體系37°C處理2小時(shí)，電泳，回收目的基因TRAF6基因片段。按照以下體系配合酶切反應(yīng)體系
pENTR~2B~GH 質(zhì)粒1μ§
IOxH酶切緩沖液2μ1
EcoR I (購(gòu)自 TAKARA)Iμ
滅菌蒸餾水至20μ1。以上反應(yīng)體系37°C處理2小時(shí)，加入堿性磷酸酶CIAP (購(gòu)自TAKARA)，37°C處理30min,電泳，回收載體片段。將酶切后的pENTR-2B-GH載體與酶切后的TRAF6基因片段進(jìn)行連接，得到重組載體 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH (以下簡(jiǎn)稱 pENTR-2B-T6RZ_GH)。連接體系如下雙鏈DNA 片段 lOOng、pENTR_2B_GH 載體 20ng、DNALigation KitVer. 2. 0 (購(gòu)自TAKARA公司)5 μ 1，雙蒸水補(bǔ)至10 μ I ；16°C連接12小時(shí)，接著用1μ I連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a (購(gòu)自TAKARA公司)，培養(yǎng)于依據(jù)分子克隆配方配制的LB固體培養(yǎng)基，其中含有50 μ g/ml的卡那霉素進(jìn)行選擇。生長(zhǎng)出來的克隆即為陽性克隆，挑取陽性克隆培養(yǎng)于依據(jù)分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，抽提，得到重組載體，通過測(cè)序，確定得到含有TRAF6 RING區(qū)域(如下所示)、TRAF6 ZINC區(qū)域(如下所示)、Gyrase B序列和HA序列的重組質(zhì)粒 pENTR-2B-T6RZ-GH。TRAF6 位于 Gyrase B 序列的 5’ 端。
小鼠TRAF6的RING序列和ZINC序列(1074bp)，如下所示ATGAGTCTCTTAAACTGTGAGAACAGCTGCGGGTCCAGCCAGTCGTCCAGTGACTGCTGCGCTGCCATGGCCGCCTCCTGCAGCGCTGCAGTGAAAGATGACAGCGTGAGTGGCTCTGCCAGCACCGGGAACCTCTCCAGCTCCTTCATGGAGGAGATCCAGGGCTACGATGTGGAGTTTGACCCACCTCTGGAGAGCAAGTATGAGTGTCCCATCTGCTTGATGGCTTTACGGGAAGCAGTGCAAACACCATGTGGCCACAGGTTCTGCAAAGCCTGCATCATCAAATCCATAAGGGATGCAGGGCACAAGTGCCCAGTTGACAATGAAATACTGCTGGAAAATCAACTGTTTCCCGACAATTTTGCAAAGCGAGAGATTCTTTCCCTGACGGTAAAGTGCCCAAATAAAGGCTGTTTGCAAAAGATGGAACTGAGACATCTCGAGGATCATCAAGTACATTGTGAATTTGCTCTAGTGAATTGTCCCCAGTGCCAACGTCCTTTCCAGAAGTGCCAGGTTAATACACACATTATTGAGGATTGTCCCAGGAGGCAGGTTTCTTGTGTAAACTGTGCTGTGTCCATGGCATATGAAGAGAAAGAGATCCATGATCAAAGCTGTCCTCTGGCAAATATCATCTGTGAATACTGTGGTACAATCCTCATCAGAGAACAGATGCCTAATCATTATGATCTGGACTGCCCAACAGCTCCAATCCCTTGCACATTCAGTGTTTTTGGCTGTCATGAAAAGATGCAGAGGAATCACTTGGCACGACACTTGCAAGAGAATACCCAGTTGCACATGAGACTGTTGGCCCAGGCTGTTCATAATGTTAACCTTGCTTTGCGTCCGTGCGATGCCGCCTCTCCATCCCGGGGATGTCGTCCAGAGGACCCAAATTATGAGGAAACTATCAAACAGTTGGAGAGTCGCCTAGTAAGACAGGACCATCAGATCCGGGAGCTGACTGCCAAAATGGAAACTCAGAGTATGTACGTGGGCGAGCTCAAACGGACCATTCGGACCCTGGAGGACAAG GTTGCCGAAATGGAAGCACAGCAGTGTAAC。(3 )通過Gateway技術(shù)將位于重組載體pENTR-2B-T6RZ_GH上的T6RZ-GH雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體CSII-EF-RfA-IRES2-Venus (日本理化學(xué)研究，www. brc.riken. jp/lab/cfm/)上，得到重組質(zhì)粒 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH (以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)V-T6RZ-GH)。同樣的方法將位于重組質(zhì)粒pENTR-2B-GH上的GH雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus 上，得到 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-GH 重組質(zhì)粒(以下簡(jiǎn)稱為 LV-GH)。具體操作過程如下
pENTR-2B-T6RZ-GH (或荇 pENTR-2B-GH)IOOng
CSIi-EF-RfA-丨 RES2-Venus150ng
LR clonase II enzyme mix (購(gòu)「I Invitrogen 公！ ij)I μ
TE (IOmM Tris-HCK ImMEDTA, ρΗ{[ 為 8 ) 補(bǔ)個(gè):9μ1。25°C下反應(yīng)6小時(shí)，加1μ I蛋白酶K (濃度為2μ g/μ 1)，37°C反應(yīng)10分鐘以清除多余的LR clonase II enzyme。接著取I μ I上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自TAKARA公司)，于30°C在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)22 24小時(shí)，生長(zhǎng)出來的克隆即為陽性克隆。挑取陽性克隆，培養(yǎng)于含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C下培養(yǎng)20小時(shí)，純化質(zhì)粒。通過Kpn I酶切質(zhì)粒檢測(cè)，獲得了正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序，TRAF6RING-ZINC-GH的序列如SEQ ID NO. 2所示，將此重組質(zhì)粒定義為L(zhǎng)V-T6RZ-GH (或者LV-GH)慢病毒質(zhì)粒。用Qiagen公司的質(zhì)粒大量提取試劑盒提取該重組質(zhì)粒。(4 ) LV-T6RZ-GH重組質(zhì)粒的表達(dá)檢測(cè)。
A、用鈣-磷質(zhì)粒導(dǎo)入法，將LV-T6RZ-GH、pCMV-VSV-G-RSV-Rev (購(gòu)自日本理化學(xué)研究所，http://www. brc. riken. jp/lab/cfm)以及pCAG-HIVgp (購(gòu)自日本理化學(xué)研究所)按照質(zhì)量比5:2:2的比例導(dǎo)入到人胚腎293T細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)中，為實(shí)驗(yàn)組；以LV-GH、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照質(zhì)量比5:2:2的比例導(dǎo)入到人胚腎293T細(xì)胞，為對(duì)照組；搜集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液即得到含有LV-T6RZ-GH (或者LV-GH)慢病毒質(zhì)粒的病毒。B、用含有LV-T6RZ-GH質(zhì)粒的病毒感染小鼠NIH3T3細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)。感染步驟如下將5X104fNIH3T3細(xì)胞與I X 106iu病毒液混懸于DMEM培養(yǎng)基中，按200 μ I混合液/孔的用量配制，每200 μ I混合液還包含體積百分比10%的胎牛血清(FBS)、100iu/ml的青霉素和鏈霉素，混勻后放于48well的平板培養(yǎng)皿中，37°C下培養(yǎng)I. 5hr，加入500 μ I培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS+100iu/ml青霉素+ 100iu/ml鏈霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)24hr，傳代培養(yǎng)，用含有LV-GH質(zhì)粒的病毒感染NIH3T3細(xì)胞作為對(duì)照。培養(yǎng)10天后(長(zhǎng)期觀察)，熒光顯 微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)質(zhì)粒的導(dǎo)入率(質(zhì)粒導(dǎo)入后，細(xì)胞表達(dá)Venus)，均為90%以上。收集這些細(xì)胞，通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(步驟見Developmental stage-dependentcollaboration between the TRAF6 and lymphotoxin pathways forB-cell follicleorganization in secondary lymphoid organs. J Immunol. 2007,179(10):6799-6807),利用TRAF6抗體(購(gòu)自SantaCruz公司)和HA抗體(購(gòu)自SantaCruz公司)檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞中T6RZ-GH的表達(dá)情況，結(jié)果如圖I所示。該結(jié)果說明LV-T6RZ-GH重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入小鼠NIH3T3細(xì)胞并表達(dá)TRAF6融合蛋白。C、分別用最終濃度為0. 01μΜ、0. 1μΜ、1μΜ、5μΜ、10μΜ的香豆霉素(coumermycin Al,購(gòu)自Sigma公司)刺激導(dǎo)入LV-T6RZ-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞15min和30min ;用最終濃度為0. 05 μ M的coumermycin Al刺激導(dǎo)入LV-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞15min、30min、60min ;用IL-I刺激(購(gòu)自PEPR0TECH公司)未導(dǎo)入任何質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞15min,通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù),利用ρ-Ι-kB α抗體(購(gòu)自CellSignaling公司)檢測(cè)可知這些濃度的coumermycin Al均可刺激導(dǎo)入LV-T6RZ-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞中的I_kB α的磷酸化，而使用低濃度的coumermycin Al刺激效果更好,與IL-I刺激的陽性對(duì)照相同，而coumermycin Al不能刺激導(dǎo)入LV-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞中的I_kB α的磷酸化(如圖2所示)。D、通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)，內(nèi)參為微管蛋白a-tubulin(購(gòu)自SantaCruz公司)。進(jìn)一步使用最終濃度為0.05μ M的coumermycin Al刺激導(dǎo)入LV-T6RZ-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞15min、30min、60min，均可誘導(dǎo)細(xì)胞中I_kB α的磷酸化；而用最終濃度為0. 05 μ M 的 coumermycin Al 刺激導(dǎo)入 LV-GH 質(zhì)粒的 NIH3T3 細(xì)胞 15min、30min、60min 卻不能誘導(dǎo)I-kBa的磷酸化(如圖3所示)。這些結(jié)果表明coumermycinAl可祀向激活TRAF6依存的信號(hào)通路。E、利用香豆霉素處理未作任何處理的NIH3T3細(xì)胞(與本實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入LV-GH或者LV-T6RZ-GH的NIH3T3相同來源，表達(dá)TRAF6)，沒有ΙκΒα的磷酸化發(fā)生(如圖4所示);同樣的，將TRAF6表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入293Τ細(xì)胞，利用香豆霉素處理，也沒有I κ Ba的磷酸化發(fā)生(結(jié)果沒有顯示)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明利用coumermycin Al刺激導(dǎo)入LV-T6RZ-GH質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞誘導(dǎo)的I-kB a的磷酸化是coumermycin Al靶向激活的TRAF6特異性依存的。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 ·
權(quán)利要求
1.一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白，其特征在于編碼所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種重組載體，其特征在于含有編碼如權(quán)利要求I所述的可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述的重組載體為將SEQIDNO. 2所示的基因克隆至慢病毒載體得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述的慢病毒載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述的重組載體為CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重組質(zhì)粒，其通過如下方法制備得到 (1)以結(jié)核桿菌DNA為模板，以FP和RP為引物，PCR反應(yīng)獲得GyraseB基因；FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ； (2)通過EcoRI酶和Spe I酶分別雙酶切pENTR_2B載體和步驟(I)得到的GyraseB基因，酶切后純化，得到雙酶切的PENTR-2B載體和雙酶切的GyraseB基因；再將雙酶切的PENTR-2B載體和雙酶切的Gyrase B基因連接，得到重組載體pENTR-2B_GyraseB-HA ;用EcoR I酶單酶切重組載體pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到單酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA ； (3)以小鼠脾臟cDNA為模板，F(xiàn)P2和RP2為引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coiI區(qū)域的DNA片段；用EcoRI酶單酶切包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段，得到單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段；FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAGRP2 ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC ； (4)將步驟(2)得到的單酶切后的pENTR-2B-GyraSeB-HA和步驟(3)得到的單酶切后的包含TRAF6基因的RING區(qū)域、ZINC區(qū)域和Coiled-coil區(qū)域的DNA片段連接，得到重組載體 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH ； (5 )通過 Gateway 技術(shù)將位于重組載體 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC_GH 上的 T6RZ-GH 雙鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至慢病毒載體CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重組質(zhì)粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于 步驟(I)和(2)中所述的PCR反應(yīng)的條件為94°C 2min ；94°C 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于 步驟(5)所述的Gateway技術(shù)的反應(yīng)體系為pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GHIOOng CSII-EF-R FA-IR ES2-Venus150ngLR clona.se Ii enzyme mixI ‘u..lTE補(bǔ)至 9jil: 其中，TE 的組成為 IOmM Tris-HCl、ImMEDTA，pH 值為 8 ； 反應(yīng)條件為25°C下反應(yīng)6小時(shí)，加Iiil濃度為2iig/iil的蛋白酶K，37°C反應(yīng)10分鐘。
9.權(quán)利要求3 8任一項(xiàng)所述的重組載體在TRAF6功能研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可靶向激活TRAF6信號(hào)通路的融合蛋白及其重組載體與應(yīng)用。該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，為利用一段gyrase B序列代替小鼠TRAF6的C末端得到；編碼該融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。該融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞后，能接受小分子藥物香豆霉素的持續(xù)刺激，靶向激活TRAF6依存的信號(hào)通路，從而可避免利用受體的配體激活TRAF6信號(hào)通路進(jìn)行疾病治療時(shí)引起的副作用。一種重組載體，含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。該重組載體對(duì)于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病治療研究都具有極其重要的價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102807622SQ20121025034
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者秦俊文, 謝琪璇, 蔡冬青, 秋山泰身, 井上純一郎, 禹艷紅, 齊緒峰, 武征 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)