一種納米金復(fù)合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種納米金復(fù)合物及其制備和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供的納米金復(fù)合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒表面。所述的功能分子具有富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)、功能區(qū)、和位于結(jié)合區(qū)與功能區(qū)之間的過(guò)渡區(qū)。本發(fā)明還提供了所述納米金復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種納米金復(fù)合物及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種納米金復(fù)合物及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]納米金復(fù)合物是一種常用的生物納米材料，它由功能分子通過(guò)一定的方式聯(lián)接在納米金顆粒上，在生物診斷等方面有廣泛的應(yīng)用。
[0003]DNA-納米金復(fù)合物是一種常見(jiàn)的納米金復(fù)合物形式。通常，這種DNA-納米金復(fù)合物是由巰基修飾的DNA通過(guò)金硫鍵在金表面自組裝作用得到的。應(yīng)用這種方法制備DNA-納米金復(fù)合物，需要將DNA進(jìn)行化學(xué)修飾，操作過(guò)程十分復(fù)雜，而且成本很高，操作過(guò)程中還可能形成不需要的雙硫鍵，或存在樣品污染等問(wèn)題。該方法常見(jiàn)的缺點(diǎn)是未完全功能化的納米金顆粒納米金由于表面非特異性吸附，DNA吸附在納米金表面呈現(xiàn)倒伏狀態(tài)；此外，這種方法雖然攜帶的DNA密度很高，但是在高度功能化的納米金顆粒上，DNA的高密度使得目標(biāo)檢測(cè)分子不易接近，影響檢測(cè)效率。
[0004]使用競(jìng)爭(zhēng)性的小分子，如巰基己醇(MCH)，可以通過(guò)取代掉吸附在金表面的DNA并迫使DNA序列保持直立狀態(tài)來(lái)提高雜交效率，但是該方法中使用的競(jìng)爭(zhēng)性小分子數(shù)量和反應(yīng)的控制非常復(fù)雜，并且競(jìng)爭(zhēng)性小分子的引入會(huì)降低納米金顆粒的穩(wěn)定性。
[0005]因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種新型的制備納米金復(fù)合物的方法，能通過(guò)一種簡(jiǎn)單有效的方法將功能分子連接到納米金顆粒上，并能有效調(diào)控納米金粒子表面固定的功能分子的密度、方向以及構(gòu)型，從而提高納米金納米金復(fù)合物的檢測(cè)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種新的納米金-復(fù)合物及其制備和應(yīng)用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種納米金復(fù)合物，所述復(fù)合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的功能分子具有式1-式III任一所示結(jié)構(gòu):
[0009]B-L-RI ；
[0010]R-L-B-L-R11 ；
[0011 ] (B-L-R-L-B)m III ；
[0012] 式中，
[0013]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)；
[0014]R表示功能區(qū)；
[0015]L表示位于B和R之間的任選的過(guò)渡區(qū)；
[0016]m為選自1-20的整數(shù)。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0018](i)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為5-100個(gè)堿基，較佳地5-40個(gè)堿基，更佳地10_30個(gè)堿基；
[0019](ii)結(jié)合區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)poly (A)η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3_20的整數(shù)；
[0020](iii)結(jié)合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或?yàn)?00% ；
[0021](iv)結(jié)合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
(0%。
[0022]在另一優(yōu)選例中，poly (A)η區(qū)段的個(gè)數(shù)為1_3個(gè)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合區(qū)包括DNA、RNA、和/或PNA構(gòu)成的單鏈。
[0024]在另一優(yōu)選 例中，所述的過(guò)渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的過(guò)渡區(qū)是長(zhǎng)度為0-50個(gè)(較佳地5-20個(gè))堿基組成的
寡核苷酸。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的堿基為T(mén)或U，較佳地為Τ。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標(biāo)記或未標(biāo)記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的小分子為膽固醇。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團(tuán)修飾。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的納米金顆粒具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0032](I)納米金顆粒的平均粒徑為l-150nm，較佳地為5-lOOnm，更佳地5_20nm ；
[0033](2)在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述納米金顆粒的表面上功能分子的結(jié)合密度為IX IO5—5 X IO13 個(gè) /cm2,較佳地為 I X IO7-2 X IO13 個(gè) /cm2,更佳佳地為 I X IO9-2 X IO13 個(gè) /cm2,更佳地為 I X IO11-2 X IO13 個(gè) /cm2，最佳地為 I X IO12— 2 X IO13 個(gè) /cm2。
[0035]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種功能分子，所述的功能分子可通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒表面，并且所述的功能分子具有式1-式III任一所示結(jié)構(gòu):
[0036]B-L-RI ；
[0037]R-L-B-L-R 11 ；
[0038](B-L-R-L-B)m III ；
[0039]式中，
[0040]B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)；
[0041]R表示功能區(qū)；
[0042]L表示位于B和R之間的任選的過(guò)渡區(qū)；[0043]m為選自1-20的整數(shù)。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0045](i)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為5-100個(gè)堿基，較佳地5-40個(gè)堿基，更佳地10_30個(gè)堿基；
[0046](ii)結(jié)合區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)poly (A)η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3_20的整數(shù)；
[0047](iii)結(jié)合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或?yàn)?00% ；
[0048](iv)結(jié)合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地
≤0%。
[0049]在另一優(yōu)選例中，poly (A)η區(qū)段的個(gè)數(shù)為1-3個(gè)。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合區(qū)包括DNA、RNA、和/或PNA構(gòu)成的單鏈。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的過(guò)渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的過(guò)渡區(qū)是長(zhǎng)度為0-50個(gè)(較佳地5-20個(gè))堿基組成的
寡核苷酸。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的堿基為T(mén)或U，較佳地為Τ。
[0054]在另一優(yōu)選例中，所述功能分子的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標(biāo)記或未標(biāo)記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
[0055]在另一優(yōu)選例中，所述的小分子為膽固醇。
[0056]在另一優(yōu)選例中，所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。
[0057]在另一優(yōu)選例中，所述的熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團(tuán)修飾。
[0058]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，所述的組合物含有藥學(xué)上可接受的載體或檢測(cè)學(xué)上可接受的載體，以及本發(fā)明第一方面所述的納米金復(fù)合物。
[0059]在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的納米金復(fù)合物的制備方法，包括步驟:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復(fù)合物。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟:
[0061](a)將功能分子與納米金顆粒混合，獲得功能分子與納米金顆粒的混合溶液；
[0062](b)向步驟(a)的混合溶液中加入老化劑，促進(jìn)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)與納米金顆粒的表面的連接，獲得含有第一方面所述的納米金復(fù)合物的溶液體系；和
[0063](C)從步驟(b)的溶液中分離所述的納米金復(fù)合物。
[0064]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(d):對(duì)納米金復(fù)合物進(jìn)行洗滌和/或性能驗(yàn)證。
[0065]在另一優(yōu)選例中，(b)中所述的老化劑選自下組:氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、氯化鎂溶液、或其組合。[0066]在本發(fā)明的第五方面，提供了第一方面所述的納米金復(fù)合物的用途，它被用于制備檢測(cè)試劑或用于制備調(diào)控基因表達(dá)或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
[0067]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測(cè)產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品含有第一方面所述的納米金復(fù)合物，所述復(fù)合物作為檢測(cè)劑。
[0068]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)產(chǎn)品包括測(cè)試片、測(cè)試條、側(cè)流片等。
[0069]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒包括第一方面所述的納米金復(fù)合物或第六方面所述的檢測(cè)產(chǎn)品。 [0070]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)方法，包括步驟:將第一方面所述的納米金復(fù)合物用作檢測(cè)劑，進(jìn)行檢測(cè)。
[0071]在另一優(yōu)選例中，在檢測(cè)時(shí)觀察/檢測(cè)所述檢測(cè)劑與待測(cè)物形成的復(fù)合物。
[0072]在另一優(yōu)選例中，在檢測(cè)時(shí)觀察/檢測(cè)因所述檢測(cè)劑與待測(cè)物的相互作用所導(dǎo)致的變化，所述變化包括:顏色變化或熒光變化。
[0073]在另一優(yōu)選例中，在本發(fā)明第一方面所述的納米金復(fù)合物中，功能分子的功能區(qū)為核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、凝集素、膽固醇。
[0074]在另一優(yōu)選例中，所述方法用于檢測(cè)核酸、小分子(如ATP)、金屬離子(如鉛、汞、銅、銀等)、蛋白、多肽、多糖等。
[0075]在另一優(yōu)選例中，納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酸，用于檢測(cè)序列與功能區(qū)核酸互補(bǔ)的目標(biāo)多核苷酸。
[0076]在另一優(yōu)選例中，2種或2種以上的納米金復(fù)合物同時(shí)與目標(biāo)多核苷酸結(jié)合。
[0077]在另一優(yōu)選例中，所述的目標(biāo)多核苷酸為DNA或RNA。
[0078]在另一優(yōu)選例中，納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酸適配體，用于檢測(cè)核酸適配體的底物。
[0079]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸適配體還包括核酸適配體的活性片段或其互補(bǔ)序列。
[0080]在另一優(yōu)選例中，納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酶，用于檢測(cè)金屬離子。
[0081]在另一優(yōu)選例中，所述的核酶為DNAzyme或RNAzyme。
[0082]在另一優(yōu)選例中，所述的核酶還包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互補(bǔ)序列。
[0083]在另一優(yōu)選例中，納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為抗體，用于檢測(cè)抗原。
[0084]在本方面的第九方面，提供了一種檢測(cè)溶液中待測(cè)物的方法，包括步驟:將第一方面所述的納米金復(fù)合物加入所述的溶液，使得所述納米金復(fù)合物上的功能分子與待測(cè)物結(jié)合或作用，并檢測(cè)溶液的變化。
[0085]在另一優(yōu)選例中，所述的溶液的變化為顏色變化或熒光變化。
[0086]在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)物質(zhì)選自下組:核酸、多肽、ATP，金屬離子(如鉛、汞、銅、銀等)。
[0087]在本方面的第十方面，提供了一種體外非治療性的基因調(diào)控方法，包括步驟:在培養(yǎng)體系中加入第一方面所述的納米金復(fù)合物，并且所述的功能分子具有調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的核苷酸序列。
[0088]在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的核苷酸序列為MiCT0RNA、干擾RNA、反義RNA等。[0089]在另一優(yōu)選例中，所述的功能分子還可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0090]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0091]下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
[0092]圖1顯示了本發(fā)明一種優(yōu)選的納米金復(fù)合物的示意圖；結(jié)合于納米金表面的功能分子包括三部分:結(jié)合區(qū)、過(guò)渡區(qū)和功能區(qū)；結(jié)合區(qū)利用腺嘌呤與金之間的親和作用力固定到納米金表面，并且能通過(guò)改變結(jié)合區(qū)調(diào)控探針之間的距離；過(guò)渡區(qū)位于結(jié)合區(qū)和功能區(qū)之間，起連接過(guò)渡作用；功能區(qū)為實(shí)現(xiàn)具體功能所需的功能分子。
[0093]圖2顯示不同體系的DNA-納米金在不同離子強(qiáng)度下的電解質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性，圖2a右側(cè)為該體系在不同離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液中所呈現(xiàn)的顏色，紅色說(shuō)明該納米金在溶液中分散良好，紫色或藍(lán)色說(shuō)明納米金發(fā)生聚合，結(jié)果顯示該體系的耐鹽度很低，在NaCl濃度僅為50mM時(shí)溶液顏色即變紫，離子強(qiáng)度更高時(shí)顏色即變?yōu)樗{(lán)色，該體系在高離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液中穩(wěn)定性較差。圖2b顯示在含多聚腺嘌呤核苷酸結(jié)合區(qū)的DNA與金納米粒子的體系中，PolyA能夠?qū)⒐丫酆塑账峤Y(jié)合在納米金上，寡聚核苷酸表面的負(fù)電荷使納米金在高離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液中仍然能夠良好地分散，在離子濃度高達(dá)0.3M的NaCl電解質(zhì)溶液中仍十分穩(wěn)定。圖2c顯示巰基修飾的寡聚核苷酸與金納米粒子結(jié)合的體系中在高離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液中也有很好的穩(wěn)定性。
[0094]圖3顯示三種納米金寡聚核苷酸-納米金樣品溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；圖3a顯示DNA中不含多聚腺嘌呤核苷酸組成的結(jié)合區(qū)polyA與金納米粒子的體系在不同NaCl濃度下的紫外可見(jiàn)吸收光譜，說(shuō)明該體系在無(wú)鹽時(shí)分散性良好，在體系中含有300mMNaCl時(shí)納米金即發(fā)生聚合；圖3b和圖3c分別顯示含有多聚腺嘌呤核苷酸組成的結(jié)合區(qū)的DNApolyA與金納米粒子的體系和巰基修飾的寡聚核苷酸與金納米粒子結(jié)合的體系在無(wú)鹽和300mM NaCl時(shí)體系的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。
[0095]圖4顯示含有多聚腺嘌呤核苷酸結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合體系對(duì)其互補(bǔ)富T鏈的雜交解析作用具有良好的抵抗力；所使用的含有多聚腺苷寡聚核苷酸一端標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM，另一端為包含不同數(shù)目的腺嘌呤堿基的polyA，分別含有10個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyAlO,圖4a)，15個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyA15,圖4b)，20個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyA20,圖4c) ,30個(gè)腺嘌呤核苷酸(polyA30,圖4d);各圖中blank線(xiàn)為不經(jīng)處理的寡聚核苷酸-納米金體系的熒光光譜圖，各圖中(polyTIO或polyT15或polyT20或polyT30)線(xiàn)為用同樣長(zhǎng)度的多聚胸腺嘧啶核苷酸與納米金復(fù)合體系雜交處理后體系的熒光光譜圖，各圖中MCH線(xiàn)表示用巰基己醇(MCH)取代處理后的納米金復(fù)合體系的熒光光譜圖。
[0096]圖5顯示通過(guò)改變polyA結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度可以調(diào)控納米金上DNA的組裝密度；圖5a為隨著寡聚核苷酸中PolyA結(jié)合區(qū)長(zhǎng)度的增加，金納米粒子表面所結(jié)合的DNA的密度逐漸降低的理論示意圖；圖5b為通過(guò)熒光光譜的檢測(cè)和計(jì)算得到含有不同長(zhǎng)度polyA(從左到右依次含有polyA5、polyA10、polyA15、polyA20、polyA30)的DNA在納米金上的組裝密度，縱坐標(biāo)為納米金粒子上連接的寡聚核苷酸的密度，結(jié)果顯示隨著polyA長(zhǎng)度的增加，納米金粒子上組裝的寡聚核苷酸密度逐漸降低，與理論示意圖5a—致；圖5c顯示為通過(guò)計(jì)算得到的納米金粒子表面所吸附的脫氧腺嘌呤核苷酸的密度。
[0097]圖6顯示為含有不同長(zhǎng)度polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物納米金流體動(dòng)力學(xué)直徑的動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)圖。圖中，從上到下依次為含有polyA5、pOlyA10、pOlyA15、pOlyA20、polyA30的復(fù)合體系的流體動(dòng)力學(xué)直徑。
[0098]圖7顯示含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物的功能區(qū)部分采取了一種延伸且直立的構(gòu)型；圖中由上到下分別為巰基修飾的寡聚核苷酸-納米金復(fù)合物、含有Po I yA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物的流體動(dòng)力學(xué)直徑的動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)結(jié)果。
[0099]圖8顯示通過(guò)polyA結(jié)合區(qū)組裝的DNA-納米金復(fù)合物的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)；圖8a為通過(guò)polyA組裝的寡聚核苷酸-納米金與完全互補(bǔ)的目標(biāo)雜交物的的熱解曲線(xiàn)，顯示溫度轉(zhuǎn)折點(diǎn)在70°C左右；圖8b為通過(guò)polyA組裝的寡聚核苷酸-納米金復(fù)合結(jié)構(gòu)在一系列溫度循環(huán)中的循環(huán)等離子振動(dòng)變化；當(dāng)溫度有序地在熔鏈點(diǎn)(約70°C )上(80°C )下(60°C )循環(huán)時(shí)，顏色會(huì)重復(fù)地在紅色(說(shuō)明顆粒是分散的)和藍(lán)色(說(shuō)明顆粒是聚集的)之間可逆變化。[0100]圖9顯示基于POlyA組裝的寡聚核苷酸_納米金體系具有非?？斓碾s交動(dòng)力學(xué)，圖9a顯示將兩種通過(guò)polyA組裝的DNA-納米金納米金復(fù)合物與互補(bǔ)DNA鏈混合后Omin (a曲線(xiàn))，Imin (b曲線(xiàn))，IOmin (c曲線(xiàn))，20min (d曲線(xiàn))9,40min (e曲線(xiàn))反應(yīng)過(guò)程的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；圖9b顯示將兩種通過(guò)巰基組裝的DNA-納米金與互補(bǔ)DNA鏈混合后Omin (a曲線(xiàn))，Imin (b曲線(xiàn))，IOmin (c曲線(xiàn))，20min(d曲線(xiàn))，40min(e曲線(xiàn))時(shí)體系的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。上述結(jié)果顯示基于polyA組裝的體系紫外可見(jiàn)吸收峰在40min內(nèi)紅移了 80nm,而巰基組裝的體系在40min內(nèi)僅移動(dòng)了 13nm，表明基于polyA組裝的體系由于雜交作用，納米金較快發(fā)生了較大程度的聚集，基于PolyA組裝的寡聚核苷酸-納米金體系比基于巰基的體系雜交動(dòng)力學(xué)更快。
[0101]圖10顯示基于polyA結(jié)合和基于巰基組裝的寡聚核苷酸-納米金體系納米金的雜交動(dòng)力學(xué)對(duì)比；圖1Oa顯示通過(guò)計(jì)算兩種體系的與反應(yīng)時(shí)間和聚合反應(yīng)幾何學(xué)有關(guān)的特征時(shí)間τ和與聚合生長(zhǎng)的物理過(guò)程有關(guān)的Avrami指數(shù)η比較兩種體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；圖1Ob顯示為兩種納米結(jié)合體系在IOmin內(nèi)檢測(cè)不同濃度(0.5，1，2，4，6，8，IOnM)物的目標(biāo)DNA的Α650/Α520快速(IOmin內(nèi))比值色檢測(cè)的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)和相對(duì)應(yīng)的體系顏色變化。
[0102]圖11顯示基于含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合探針可以通過(guò)熒光檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量分析。
[0103]圖12顯示含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量分析；圖中的待測(cè)DNA濃度分別為0.5nM, InM, 2ηΜ, 4ηΜ, 6ηΜ, 8ηΜ, ΙΟηΜ。Α650/Α520為各待測(cè)DNA濃度下紫外可見(jiàn)吸收光譜圖中650nm和520nm處吸光度信號(hào)強(qiáng)度的比值。
[0104]圖13顯示含有polyA結(jié)合區(qū)的核酸適配體-納米金復(fù)合探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP分子的定量分析；圖中目標(biāo)ATP的濃度依次分別為0.1mM, 0.5mM, 1.5mM, ImM, 2mM ；A520為各待測(cè)ATP濃度下紫外可見(jiàn)吸收光譜圖中520nm處吸光度信號(hào)強(qiáng)度。
[0105]圖14顯示含有polyA結(jié)合區(qū)的寡聚核苷酸-納米金復(fù)合探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的定量分析；圖中顯示鉛離子濃度與紫外光譜信號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖。其中鉛離子濃度依次分別為2μΜ，4μΜ，6μΜ，8μΜ，10μΜ。Α520為各待測(cè)鉛離子濃度下紫外可見(jiàn)吸收光譜圖中520nm處吸光度信號(hào)強(qiáng)度。
[0106]圖15是顯示含有polyA結(jié)合區(qū)的抗體-納米金復(fù)合探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)TNF-a的定量分析；圖中顯示蛋白質(zhì)TNF-a濃度與紫外光譜信號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖。其中，圖中的TNF_a 濃度依次分別為 Ing/mL, 2ng/mL, 4ng/mL, 6ng/mL。A650/A520 為各待測(cè) TNF_a 濃度下紫外可見(jiàn)吸收光譜圖中650nm和520nm處吸光度信號(hào)強(qiáng)度的比值。
[0107]圖16顯示通過(guò)poly A結(jié)合于金表面的siRNA-納米金復(fù)合物對(duì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表達(dá)抑制效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0108]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，功能分子可以通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸(A)或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)與納米金顆粒的表面結(jié)合，從而形成納米金復(fù)合物；所述功能分子包括富含A的寡核苷酸結(jié)合區(qū)、功能區(qū)和位于結(jié)合區(qū)和功能區(qū)之間過(guò)渡區(qū)。本發(fā)明的納米金復(fù)合物可實(shí)現(xiàn)納米金表面上功能分子密度的自我調(diào)控；在納米尺度上可以精確控制功能分子之間的距離，充分保證功能區(qū)的識(shí)別活性，促進(jìn)功能區(qū)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)能力。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0109]術(shù)語(yǔ)
[0110]納米金
[0111]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米金”或“納米金顆?！笨梢曰Q使用，都是指一種微小的，其平均粒徑為l-150nm。納米金顆粒具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物分子結(jié)合，且不影響其生物活性。
[0112]在本發(fā)明中，優(yōu)選的納米金顆粒為5-100nm,更佳地為5-20nm。在納米金顆粒的群體中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，優(yōu)選在5-100nm范圍內(nèi)。
[0113]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以商業(yè)購(gòu)買(mǎi)途徑(如向Sigma-Aldrich公司購(gòu)買(mǎi))或常規(guī)方法制備獲得。
[0114]功能分子
[0115]本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N新的功能分子，該功能分子可通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒表面。
[0116]本發(fā)明的的功能分子具有式1-式III任一所示結(jié)構(gòu):
[0117]B-L-RI ；
[0118]R-L-B-L-R 11 ；
[0119](B-L-R-L-B)m III ；
[0120]式中，B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)；R表示功能區(qū)山表示位于B和R之間的任選的過(guò)渡區(qū)；m為選自1-20的整數(shù)。
[0121]在本發(fā)明中，富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:(i)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為5-100個(gè)堿基，較佳地5-40個(gè)堿基，更佳地10-30個(gè)堿基；(ii)結(jié)合區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1-100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)；(iii)結(jié)合區(qū)中A堿基的含量≥70%,較佳地≥80%,更佳地≥90%,最佳地≥95%，或?yàn)?00% ； (iv)結(jié)合區(qū)中T堿基和U堿基的總量(20%，較佳地< 10%，更佳地< 5%，最佳地< 0%。本發(fā)明優(yōu)選poly(A)n區(qū)段的個(gè)數(shù)為1_3個(gè)。更優(yōu)選地，結(jié)合區(qū)包括DNA、RNAjP /或PNA構(gòu)成的單鏈。
[0122]在本發(fā)明中，過(guò)渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合。過(guò)渡區(qū)優(yōu)選為長(zhǎng)度為0-50個(gè)(較佳地5-20個(gè))堿基組成的寡核苷酸；所述的堿基為T(mén)或U，較佳地為T(mén)。
[0123]在本發(fā)明中，功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標(biāo)記或未標(biāo)記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。所述的小分子也可以為膽固醇。所述的修飾包括:生物素修飾、親和素修飾、羧基修飾、羥基修飾、氨基修飾、糖基修飾、熒光修飾。熒光修飾為熒光分子修飾或熒光團(tuán)修飾。
[0124]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸適配體”或“Apatmer ”可以互換使用，都是指一段DNA或RNA序列，該序列能夠與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性高敏感性高選擇性的結(jié)合，當(dāng)核酸適配體與特定的目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生結(jié)合時(shí)，核酸適配體自身的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這種變化可以進(jìn)行檢測(cè)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用常規(guī)方法(如體外篩選技術(shù)等)可以對(duì)核酸適配體的序列進(jìn)行選擇；使用全人工化學(xué)方法制備所述的核酸適配體。此外，所述的核酸適配體還包括核酸適配體的活性片段或其互補(bǔ)序列。
[0125]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酶”是指具有催化活性的核酸序列，其化學(xué)本質(zhì)雖然是核酸，卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是分子中的特定部位。核酶包括DNAzyme或RNAzyme等,所述的核酶還包括核酶的活性片段，以及核酶或其活性片段的互補(bǔ)序列。一種優(yōu)選的DNAzyme底物鏈(substrate strand)序列如下:
[0126]5，-ACTCATCTGTGAACTCACTAT @ GGAAGAGATGTGTCAACTCGTG-3，
[0127]其中，rA代表組成RNA的腺嘌呤核糖核苷酸，其他的都代表組成DNA的脫氧核糖核苷酸，形成了切割位點(diǎn)(cleavage site)。
[0128]納米金復(fù)合物
[0129]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“納米金復(fù)合物”、“納米金復(fù)合”、“納米金-功能分子復(fù)合物”或“納米金-功能分子復(fù)合體”可以互換使用，所述復(fù)合物或復(fù)合體包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒表面。
[0130]本發(fā)明納米金復(fù)合物的表面上具有適宜的功能分子的結(jié)合密度，所述密度為I X IO5— 5 X IO13 個(gè) /cm2，較佳地為 I X IO7— 2 X IO13 個(gè) /cm2,更佳地為 I X IO9— 2 X IO13 個(gè) /cm2，更佳地為 I X IO11— 2 X IO13 個(gè)/cm2，最佳地為 I X 1012—2 X IO13 個(gè)/cm2。
[0131]本發(fā)明納米金復(fù)合物的納米金顆粒的平均粒徑為l_150nm,較佳地為5-100nm,更佳地5-20nm。在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
[0132]本發(fā)明還提供了納米金復(fù)合物的制備方法:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復(fù)合物。[0133]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，包括步驟:將功能分子與納米金顆?；旌?，獲得功能分子與納米金顆粒的混合溶液；加入老化劑，促進(jìn)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)與納米金顆粒的表面的連接，獲得含有納米金復(fù)合物的溶液體系；從溶液中分離納米金復(fù)合物。優(yōu)選地，還包括步驟:對(duì)納米金復(fù)合物進(jìn)行洗滌和/或性能驗(yàn)證。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以選用常規(guī)的老化劑，如氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、氯化鎂溶液等。
[0134]本發(fā)明還提供了納米金復(fù)合物的應(yīng)用方法，它被用于制備檢測(cè)試劑或用于制備調(diào)控基因表達(dá)或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
[0135]本發(fā)明提供了一種檢測(cè)產(chǎn)品，它含有本發(fā)明的納米金復(fù)合物，將其作為檢測(cè)劑；該檢測(cè)產(chǎn)品抗原包括測(cè)試片、測(cè)試條、側(cè)流片等。 [0136]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)試劑盒，它包括本發(fā)明的納米金復(fù)合物或上述的檢測(cè)產(chǎn)
品O
[0137]可以將本發(fā)明所述的納米金復(fù)合物用作檢測(cè)劑，進(jìn)行檢測(cè)；在檢測(cè)中，優(yōu)選觀察/檢測(cè)所述檢測(cè)劑與待測(cè)物形成的復(fù)合物或觀察/檢測(cè)因所述檢測(cè)劑與待測(cè)物的相互作用所導(dǎo)致的變化；所述變化可以包括:顏色變化或熒光變化。
[0138]本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用納米金復(fù)合物進(jìn)行體外非治療性的基因調(diào)控方法:在培養(yǎng)體系中加入納米金復(fù)合物，所述的功能分子具有調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的核苷酸序列。調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的核苷酸序列為優(yōu)選MicroRNA、干擾RNA、反義RNA。的功能分子還可以包括多肽分子(如TAT多肽)等。
[0139]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“TAT”或“TAT多肽”可以互換使用，將TAT與目標(biāo)分子連接，TAT多肽可以幫助目標(biāo)分子進(jìn)入細(xì)胞(核)。一種優(yōu)選的TAT多肽序列如SEQ ID NO:24所示。
[0140]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0141]1.本發(fā)明的納米金復(fù)合物可實(shí)現(xiàn)納米金表面上連接上的功能分子密度的自我調(diào)控，通過(guò)控制功能分子之間的距離，充分保證功能區(qū)的識(shí)別活性，促進(jìn)功能區(qū)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)能力；
[0142]2.本發(fā)明的納米金復(fù)合物，其功能分子通過(guò)富A結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面，使得功能分子中的功能區(qū)采用更加延伸且直立的構(gòu)型，促進(jìn)功能區(qū)與目標(biāo)分子的識(shí)別效率；
[0143]3.本發(fā)明的制備納米金復(fù)合物的方法簡(jiǎn)單，成本低廉，無(wú)需任何化學(xué)修飾和人工合成的部分。
[0144]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0145]部分實(shí)驗(yàn)材料
[0146]所有使用納米金粒子均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，所有的寡聚核苷酸由TaKaRa公司(Dalian，China)合成并純化。實(shí)驗(yàn)中所用儀器:紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(U-3010紫外可見(jiàn)光譜，日立，日本東京)；熒光光譜儀(F-4500，日立，日本東京)；DelsaTM納米亞微米粒度和Zeta電位粒度儀，貝克曼庫(kù)爾特公司；真彩色數(shù)碼相機(jī)(尼康)。
[0147]實(shí)驗(yàn)方法[0148]納米金復(fù)合物的組裝[0149]首先將金納米顆粒與含富A寡聚核苷酸結(jié)合區(qū)的功能分子以一定的比例(功能分子:納米金=200:1)混合，輕輕吹打使混勻，室溫孵育16小時(shí)后，加入IM PBS(1M NaCl/0.1MPB，ρΗ7.0)使其終濃度為0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次間隔)，室溫下放置16h，12000r，4°C，20min 離心，吸棄上清，加入等量的 0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, ρΗ7.0)洗離三次，雜交溶液(0.3MNaCl/10mM PB, pH7.0)懸浮，4°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0150]納米金復(fù)合物表面DNA密度的定量檢測(cè)
[0151]向含有組裝好的DNA-納米金復(fù)合體的溶液中加入巰基己醇(MCH)(終濃度為20mM)，在室溫下震蕩并過(guò)夜培育，巰基己醇可以將寡聚核苷酸從納米金表面上取代下來(lái)；將被取代下來(lái)的DNA探針通過(guò)離心法進(jìn)行分離，上清液在熒光分光光度計(jì)(F-4500，日立公司，東京，日本)下進(jìn)行熒光檢測(cè)；將該熒光值與通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法得到的熒光線(xiàn)性曲線(xiàn)對(duì)應(yīng)，得到DNA的濃度從而計(jì)算得出DNA的物質(zhì)量。熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是在相同pH的緩沖中，同樣的離子強(qiáng)度和巰基乙醇濃度下用已知濃度的熒光標(biāo)記的寡聚核苷酸檢測(cè)熒光得到的。納米金的濃度由紫外可見(jiàn)吸收光譜(U-3100紫外可見(jiàn)吸收光譜，日立公司，東京，日本)測(cè)得，即根據(jù)納米金在520nm處的吸收強(qiáng)度，代入摩爾吸光系數(shù)計(jì)算求得納米金的濃度從而計(jì)算得出納米金的物質(zhì)量。納米金表面組裝的DNA密度等于DNA的物質(zhì)量除以納米金物質(zhì)的量。
[0152]納米金表面組裝的功能序列的雜交效率檢測(cè)方法
[0153]向200 μ 1，IOnM合成好的含富A結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物中加入3 μ M與其功能區(qū)核酸序列互補(bǔ)的有熒光標(biāo)記的DNA鏈，在雜交條件(0.3Μ PBS, ρΗ7)下反應(yīng)24h。用磷酸鹽緩沖清洗混合物兩次，通過(guò)離心除去未雜交的DNA ;通過(guò)加入氫氧化鈉(終濃度大于50mM,pHll-12)反應(yīng)2h，使雜交結(jié)合的熒光標(biāo)記的DNA與DNA-納米金復(fù)合物解離。通過(guò)離心分離出解離的熒光標(biāo)記的DNA，加入IM HCl將pH調(diào)回中性，用熒光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比得到雜交在多聚腺苷寡聚核苷酸-納米金復(fù)合物上的DNA濃度。
[0154]動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
[0155]在自組裝動(dòng)力學(xué)的研究中，向50 μ L含有8nM DNA-納米金復(fù)合物(兩種DNA-納米金復(fù)合物探針1:1混合)的0.3Μ PBS雜交緩沖溶液中加入2μ L適當(dāng)?shù)腎Oy M的DNAlinker，兩種DNA-納米金復(fù)合物中的DNA功能區(qū)分別與DNAlinker中的不同區(qū)段的序列互補(bǔ)。每?jī)煞昼娺M(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜檢測(cè)。
[0156]熔鏈分析方法
[0157]通過(guò)使用溫度控制儀(PolyScience)在25_80°C之間調(diào)控溫度,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)記錄不同溫度下復(fù)合物的紫外可見(jiàn)吸收光譜。
[0158]動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)方法
[0159]將1.5mL3nM的組裝好的DNA-納米金復(fù)合物加入到比色皿中，使用Delsa? NanoSubmicron Particle Size and Zeta potential Particle Analyzer (貝克曼庫(kù)爾特公司)進(jìn)行檢測(cè)。
[0160]實(shí)施例1
[0161]納米金復(fù)合物的組裝
[0162]首先將金納米顆粒與含富A寡聚核苷酸結(jié)合區(qū)的功能分子以一定的比例(DNA/納米金為200:1)混合，輕輕吹打使混勻，室溫孵育16小時(shí)后，加入IMPBSdM NaCl/0.1M PB，ρΗ7.0)使其終濃度為0.1M PBS (分5~6次加入，5min/次間隔)，室溫下放置16h，12000r,4°C，20min離心，吸棄上清，加入等量的0.1M PBS (0.1M NaCl/lOmM PB, pH7.0)洗離三次，雜交溶液(0.3M NaCl/lOmMPB, pH7.0)懸浮，4°C冰箱長(zhǎng)期保存。圖1顯示了功能分子和納米金復(fù)合物的示意圖。
[0163]實(shí)施例2
[0164] 含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物在電解質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性
[0165]為了確定寡聚核苷酸DNA可以通過(guò)其結(jié)構(gòu)中的polyA結(jié)合區(qū)穩(wěn)定地連接到納米金表面，本實(shí)施例取三種DNA樣品:(a) DNA中無(wú)多聚腺嘌呤核苷酸(polyA)組成的結(jié)合區(qū)、(b) DNA中含有多聚腺嘌呤核苷酸組成的結(jié)合區(qū)A10、(c) DNA端部修飾巰基基團(tuán)，上述DNA中過(guò)渡區(qū)為T(mén)5，功能區(qū)均為ATgAT gTTCg TTgTgo上述三種DNA分別和IOnm納米金顆粒納米金形成DNA-納米金復(fù)合物，對(duì)其在不同離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。
[0166]實(shí)驗(yàn)原理:分散在溶液中的粒徑為IOnm的納米金呈紅色，納米金聚集后由于表面等離子共振效應(yīng)會(huì)使其顏色發(fā)生藍(lán)移，沒(méi)有修飾DNA的納米金在高離子強(qiáng)度環(huán)境中不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集；修飾在納米金表面上DNA可以使納米金穩(wěn)定存在于高離子強(qiáng)度環(huán)境中。
[0167]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示，含polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物和巰基修飾的DNA-納米金復(fù)合物在離子濃度高達(dá)0.3M的NaCl電解質(zhì)溶液中仍然保持紅色并且在520nm處有一個(gè)明顯的特征吸收峰，表明polyA和巰基有相同的作用，可以使DNA連接到納米金上，并可以使納米金在高離子強(qiáng)度環(huán)境下保持很好的穩(wěn)定性；與之相反，不含PolyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金體系非常不穩(wěn)定，在NaCl濃度僅為20mM時(shí)，溶液顏色就有所變化并且其紫外吸收峰發(fā)生藍(lán)移，在離子強(qiáng)度變高后顏色即變?yōu)樗{(lán)色，這種顏色變化說(shuō)明金膠已經(jīng)發(fā)生聚合，證明不含polyA的DNA多聚腺苷寡聚核苷酸不能穩(wěn)定結(jié)合到納米金表面。
[0168]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，功能分子可以通過(guò)與之連接的polyA結(jié)合區(qū)穩(wěn)定地結(jié)合到納米金表面。
[0169]實(shí)施例3
[0170]含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物的熱穩(wěn)定性
[0171]DNA-納米金復(fù)合物的熱穩(wěn)定性對(duì)其實(shí)際用途中有很重要的影響，為了證明含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物有很好的熱穩(wěn)定性，本實(shí)施例使用一條有熒光素標(biāo)記的含PolyA的寡聚核苷酸，將其連接到納米金上，并檢測(cè)它們從納米金上隨著溫度變化的解吸過(guò)程。
[0172]實(shí)驗(yàn)原理:納米金具有猝滅熒光的能力，連接在納米金表面上修飾了熒光分子的DNA表現(xiàn)出很低熒光值，如果修飾了熒光分子的DNA從金表面脫落下來(lái)，體系的熒光值就會(huì)升高。
[0173]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物高度耐熱，即使在高溫(900C )時(shí)，仍只有很少的DNA從納米金表面脫離，這與巰基DNA-納米金復(fù)合物的穩(wěn)定性相當(dāng)。
[0174]上述結(jié)果表明含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物具有良好的熱穩(wěn)定性。
[0175]實(shí)施例4
[0176]富T鏈對(duì)含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物不產(chǎn)生影響
[0177]由于本發(fā)明中DNA是通過(guò)一段polyA結(jié)合區(qū)和納米金結(jié)合，這種DNA-納米金復(fù)合物的穩(wěn)定性可能會(huì)由于與結(jié)合區(qū)序列互補(bǔ)的DNA(富T序列)的雜交作用而變得比較低。本實(shí)施例將一系列修飾了突光分子的富A序列(polyA1(l, PolyA15, poIyA20, poIyA30)按照標(biāo)準(zhǔn)步驟組裝到納米金表面上，然后向這些體系中加入高濃度(2μΜ)的與其對(duì)應(yīng)互補(bǔ)的富T鏈(polyT10, PolyT15, polyT20, polyT3(l)。納米金具有粹滅突光的能力,連接在納米金表面上修飾了熒光分子的PolyA序列表現(xiàn)出很低熒光值，如果修飾了熒光分子的polyA從表面取代下來(lái)，體系的熒光值就會(huì)升高。
[0178]結(jié)果如圖4所示，由于納米金對(duì)連接在DNA末端的熒光分子FAM有淬滅作用，因此復(fù)合體系的熒光值幾乎為零，MCH可以將DNA從納米金上取代下來(lái)，導(dǎo)致體系的熒光值升高；而同等長(zhǎng)度的poly dT處理后的DNA-納米金復(fù)合體系與未經(jīng)處理時(shí)的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，表明只有極少量金納米粒子上的PolyA被A-T互補(bǔ)雜交作用取代下來(lái)。
[0179]上述結(jié)果 表明，納米金上所吸附的polyA非常穩(wěn)定，可以抵抗富A-富T之間的雜交解吸作用。
[0180]實(shí)施例5
[0181]PolyA結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度對(duì)功能分子在納米金表面上組裝密度的影響
[0182]本實(shí)施例試圖通過(guò)改變polyA結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度，從而實(shí)現(xiàn)從空間上調(diào)控組裝在納米金表面上功能分子密度的目的。
[0183]使用一系列結(jié)合區(qū)不同長(zhǎng)度熒光基團(tuán)標(biāo)記的含多聚腺苷寡聚核苷酸，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將其組裝到納米金表面，然后利用基于取代反應(yīng)的熒光法定量金納米粒子表面DNA的組裝密度。如圖5所示，隨著polyA長(zhǎng)度的增加，納米金粒子上組裝的寡聚核苷酸密度逐漸降低(圖5a、圖5b)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不論polyA結(jié)合區(qū)長(zhǎng)度為多少，納米金粒子表面所吸附的腺嘌呤核苷酸的數(shù)目沒(méi)有顯著的差別(圖5c)，說(shuō)明結(jié)合區(qū)所有腺嘌呤核苷酸都可以完全吸附在金納米顆粒的彎曲表面，實(shí)現(xiàn)表面的完全覆蓋。
[0184]上述結(jié)果表明可以通過(guò)調(diào)節(jié)含多聚腺苷結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)控功能分子在納米金表面上組裝密度。
[0185]實(shí)施例6
[0186]含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物上功能區(qū)DNA與目標(biāo)DNA的雜交效率
[0187]DNA-納米金復(fù)合物上的DNA雜交活性對(duì)其在生物檢測(cè)和生物效應(yīng)等實(shí)際應(yīng)用中有重要的影響。傳統(tǒng)利用巰基結(jié)合于納米金的DNA-納米金復(fù)合物，由于其納米金表明的DNA形態(tài)和DNA密度的影響導(dǎo)致其功能區(qū)DNA探針雜交效率很低。含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物,理論上其polyA部分不僅可以使功能分子連接到納米金表面上,還可能屏蔽納米金表面上非特異性作用位點(diǎn)，使功能分子在納米金表面呈垂直構(gòu)型，保持高的生物活性。
[0188]在本實(shí)施例中，發(fā)明人研究了含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物上功能區(qū)DNA與目標(biāo)DNA的雜交效率。首先制備一系列含不同長(zhǎng)度polyA結(jié)合區(qū)的DNA，其過(guò)渡區(qū)均為T(mén)5，功能區(qū)均為ATgAT gTTCg TTgTg，然后檢測(cè)它們與互補(bǔ)DNA鏈的雜交效率。
[0189]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，含有polyA結(jié)合區(qū)的DNA-納米金復(fù)合物上功能區(qū)DNA與目標(biāo)DNA的雜交效率顯著提高，比基于巰基修飾的DNA-納米金復(fù)合物的雜交效率(約5%-10%)提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)；而且隨著polyA長(zhǎng)度的增加，功能區(qū)DNA的雜交效率逐漸提高，含polyA5的DNA的雜交效率約為42%，含polyA30的DNA的雜交效率達(dá)到約90%。[0190]表1
【權(quán)利要求】
1.一種納米金復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物包括納米金顆粒和功能分子，并且所述的功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面。
2.如權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述的功能分子具有式1-式III任一所示結(jié)構(gòu): B-L-RI ； R-L-B-L-R II；
(B-L-R-L-B)m III ； 式中， B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)； R表示功能區(qū)； L表示位于B和R之間的任選的過(guò)渡區(qū)； m為選自1-20的整數(shù)； 或優(yōu)選地， 所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: (i)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為5-100個(gè)堿基，較佳地5-40個(gè)堿基，更佳地10-30個(gè)堿基； (?)結(jié)合區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)； (iii)結(jié)合區(qū)中A堿基的含量>70%，較佳地> 80%，更佳地> 90%，最佳地> 95%，或?yàn)?00% ； (iv)結(jié)合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地≤0%； 或較佳地， 所述的過(guò)渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合； 或優(yōu)選地， 所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標(biāo)記或未標(biāo)記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
3.如權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述的納米金顆粒具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: (1)納米金顆粒的平均粒徑為l_150nm，較佳地為5_100nm，更佳地5_20nm； (2)在納米金顆粒中，80%以上(較佳地90%以上)的納米金顆粒的粒徑在l_150nm范圍內(nèi)，較佳地在5-100nm范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物，其特征在于，所述納米金顆粒的表面上功能分子的結(jié)合密度為I X IO5— 5 X IO13個(gè)/cm`2，較佳地為I X IO7— 2 X IO13個(gè)/cm2，更佳佳地為I X IO9-2 X IO13 個(gè) /cm2,更佳地為 I X 1011—2 X IO13 個(gè) /cm2,最佳地為 I X 1012—2 X IO13 個(gè)/ cm2。
5.一種功能分子，其特征在于，所述的功能分子可通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒表面，并且所述的功能分子具有式1-式III任一所示結(jié)構(gòu): B-L-RI ； R-L-B-L-R II ； (B-L-R-L-B)m III ； 式中， B表示富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)； R表示功能區(qū)； L表示位于B和R之間的任選的過(guò)渡區(qū)； m為選自1-20的整數(shù)； 或優(yōu)選地， 所述的富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: (i)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度為5-100個(gè)堿基，較佳地5-40個(gè)堿基，更佳地10-30個(gè)堿基； (?)結(jié)合區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)poly (A) η區(qū)段，其中η為選自1_100的整數(shù)，較佳地η為選自2-30的整數(shù)，更佳地η為選自3-20的整數(shù)； (iii)結(jié)合區(qū)中A堿基的含量>70%，較佳地> 80%，更佳地> 90%，最佳地> 95%，或?yàn)?00% ； (iv)結(jié)合區(qū)中T堿基和U堿基的總量≤20%,較佳地≤10%,更佳地≤5%，最佳地≤0%； 或較佳地， 所述的過(guò)渡區(qū)由選自下組的成分組成:寡核苷酸、多肽、高分子鏈、小分子、或其組合； 或優(yōu)選地， 所述的功能區(qū)為修飾或未修飾的、以及標(biāo)記或未標(biāo)記的選自下組的分子(moiety):核酸、核酸適配體、核酶(DNAzyme或RNAzyme)、蛋白質(zhì)、多肽、抗體、探針、酶、凝集素、配體、小分子、膽固醇。
6.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有藥學(xué)上可接受的載體或檢測(cè)學(xué)上可接受的載體，以及權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物。
7.—種權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括步驟:將功能分子與納米金顆粒接觸，使得功能分子通過(guò)富含腺嘌呤核苷酸或其類(lèi)似物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)結(jié)合于納米金顆粒的表面，從而形成納米金復(fù)合物。
8.權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物的用途，其特征在于，它被用于制備檢測(cè)試劑或用于制備調(diào)控基因表達(dá)或調(diào)節(jié)蛋白活性的藥物組合物。
9.一種檢測(cè)產(chǎn)品，其特征在于，所述的產(chǎn)品含有權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物，所述復(fù)合物作為檢測(cè)劑。
10.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的檢測(cè)試劑盒包括權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物或權(quán)利要求9所述的檢測(cè)產(chǎn)品。
11.一種檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟:將權(quán)利要求1所述的納米金復(fù)合物用作檢測(cè)劑，進(jìn)行檢測(cè); 或優(yōu)選地， 納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酸，用于檢測(cè)序列與功能區(qū)核酸互補(bǔ)的目標(biāo)多核苷酸； 或較佳地， 納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酸適配體，用于檢測(cè)核酸適配體的底物； 或優(yōu)選地， 納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為核酶，用于檢測(cè)金屬離子； 或較佳地， 納米金復(fù)合物的功能分子的功能區(qū)為抗體，用于檢測(cè)抗原。
12.—種體外非治療性的基因調(diào)控方法，其特征在于，包括步驟:在培養(yǎng)體系中加入權(quán)利要求I所述的納米金復(fù)合物，并且所述 的功能分子具有調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK103540651SQ201210241611
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】樊春海, 裴昊, 黃慶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所