一種抗hiv-1藥物的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗HIV-1藥物的篩選方法，將BST-2的氨基端連接生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白，Vpu的羧基端連接生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移受體蛋白，使BST-2和Vpu之間產(chǎn)生生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）信號，進而將兩種融合蛋白共表達在細胞中，并建立穩(wěn)定表達兩種融合蛋白的細胞系，添加待檢樣品至此細胞中，檢測細胞BRET信號的變化，若BRET值下降，則待檢樣品為抗HIV-1陽性藥物。利用該方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-1的藥物，為抗HIV-1藥物的篩選提供了新途徑。
【專利說明】—種抗HIV-1藥物的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗Hiv-1藥物的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病(acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)為當前在全球范圍內(nèi)流行的重大傳染病之一，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染導致人體免疫機能缺陷，而易于發(fā)生機會性感染和腫瘤的臨床綜合征。在過去的20多年里造成2000多萬人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已達4000萬左右，艾滋病對人類健康，社會穩(wěn)定造成嚴重威脅。在艾滋病疫苗尚未研制成功的現(xiàn)階段，藥物治療是艾滋病防治的主要手段。目前已經(jīng)有4類24種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物應用于艾滋病的抗病毒治療，包括11種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)，3種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)，9種蛋白酶抑制劑(PI)和I種融合抑制劑(FI)。但病毒的進化使得耐藥性不斷產(chǎn)生，這就需要不斷尋求針對新靶點的新型抗艾滋病病毒藥物。
[0003]引起世界范圍流行的艾滋病的病原體主要是人類免疫缺陷病毒I (Humanimmunodeficiency virus typel, HIV-1), HIV-1的致病機理及其與宿主因素的相互作用十分復雜。對抗病毒的宿主細胞因子TsglOl、AP0BEC3G等越來越受到關(guān)注。因此，了解病毒與宿主的關(guān)系及其相互作用機制是尋找有效的抗病毒藥物和治療策略的新途徑。病毒在進化過程中需要不斷的克服宿主細胞的限制作用才能得以在宿主體內(nèi)生存，其中HIV-1自身的輔助蛋白Vpu可克服宿主限制因子BST-2 (bone marrow stromal cell antigen2,又稱⑶317，HMl.24)，從而促進病毒從宿主細胞的釋放。
[0004]BST-2因最近發(fā)現(xiàn)能抑制HIV-1的釋放而引起了科學界極大的關(guān)注，它能將新生的病毒粒子粘附于病毒感染細胞表面又得名Tetherin。BST-2是一種拓撲結(jié)構(gòu)較為獨特的膜蛋白，含有兩個疏水區(qū)。該蛋白質(zhì)的氨基端位于胞質(zhì)中，隨后是一個約19個氨基酸的跨膜蛋白域(TM)及胞外卷曲螺旋基序，其羧基端為約17個氨基酸的糖基磷脂酰肌醇錨定點(GPI anchor)。位于細胞表面的BST-2，其GPI錨定點位于病毒出芽部位-脂伐中，而跨膜區(qū)位于脂伐外，通過胞外的半胱氨酸殘基形成二聚體或多聚體的形式而將出芽的病毒和宿主細胞連接，使病毒粒子束縛于細胞表面，從而抑制病毒的釋放。
[0005] 如前所述，BST-2的這種抑制病毒釋放的作用可被HIV-1的輔助蛋白Vpu拮抗。Vpu也為跨膜蛋白，具有兩個主要的結(jié)構(gòu)域:氨基端的疏水跨膜域和羧基端的具有兩個可磷酸化絲氨酸殘基的胞質(zhì)域。Vpu可與BST-2共定位，兩種蛋白通過各自的跨膜區(qū)產(chǎn)生相互作用，進而通過胞質(zhì)區(qū)的β -TrCP結(jié)合位點，將BST-2與細胞內(nèi)的泛素化通路相連，以內(nèi)體-溶酶體途徑或蛋白酶體途徑降解BST-2，使其在細胞表面的含量減少，從而促進HIV-1病毒粒子的釋放。因此，可將BST-2與Vpu跨膜區(qū)的相互作用作為新的藥物靶標，破壞兩者相互之間的聯(lián)系，抑制Vpu降解BST-2，從而恢復BST-2向細胞表面的運輸而達到病毒釋放減少的目的。
[0006]BRET (Bioluninescence resonance energy transfer 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)為一種在活細胞內(nèi)實時監(jiān)測兩種蛋白質(zhì)相互作用的方法。此方法將兩種目標蛋白各自與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白(如Renilla的熒光素酶，Rluc)和受體蛋白(如EYFP)融合表達，當兩種目標蛋白產(chǎn)生相互作用時，距離會小于10nm，這時加入外源底物(如Coelenterazine h)而使Rluc產(chǎn)生激發(fā)光,此激發(fā)光可由一對偶極子介導向受體蛋白EYFP轉(zhuǎn)移，從而激發(fā)EYFP產(chǎn)生發(fā)射光，通過儀器可檢測蛋白質(zhì)發(fā)生作用前后的信號變化，是一種研究蛋白質(zhì)之間相互作用的良好方法。
[0007]目前國內(nèi)關(guān)于艾滋病藥物篩選的方法層出不窮，但方法不夠簡便，或者作用機制不甚明確，因此，亟待推出新的簡單高效，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量并且機制明確的藥物篩選方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對上述不足，本發(fā)明提供一種抗HIV-1藥物的篩選方法。
[0009]本發(fā)明提供的抗HIV-1藥物的篩選方法，包括步驟:添加待檢樣品至能穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系的細胞中，檢測細胞BRET信號的變化，若BRET信號下降，則待檢樣品為抗HIV-1陽性藥物；所述RB是將BST-2的氨基端與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白連接而成的，所述VE是將Vpu的羧基端與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移受體蛋白連接而成的，使BST-2和Vpu之間產(chǎn)生BRET信號。
[0010]其中，所述生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白選自:海腎熒光素酶Rluc。
[0011]其中，所述生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移受體蛋白選自:增強型黃色熒光蛋白EYFP。
[0012]其中，所述細胞系為293細胞系。
[0013]本發(fā)明提供了一種篩選穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系的方法，是將雙表達RB和VE的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，添加終濃度為lmg/ml的抗生素G418,初篩10-14天,將細胞進行單克隆化操作，擴大培養(yǎng)后，經(jīng)觀察和檢測儀檢測，兩種蛋白表達均良好的細胞系確定為穩(wěn)定表達RB、VE的細胞系。
[0014]在本發(fā)明的實施例中，使用熒光顯微鏡觀察和Iuciferase檢測儀進行檢測。
[0015]其中，所述雙表達RB和VE的質(zhì)粒為pRB-VE，能在細胞內(nèi)同時表達RB和VE兩種蛋白。
[0016]本發(fā)明還提供了上述方法篩選得到的穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系。
[0017]本發(fā)明提供了一種用于篩選抗HIV-1藥物的穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系。
[0018]優(yōu)選地，用于篩選抗HIV-1藥物的穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系為293細胞系。
[0019]本發(fā)明提供了一種真核雙表達質(zhì)粒，其為pRB-VE，其核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
[0020]本發(fā)明提供了一種構(gòu)建上述真核雙表達質(zhì)粒的方法，包括以下步驟:
[0021]I)質(zhì)粒pRB構(gòu)建:
[0022]a)以phBST-2為模板，以引物
[0023]F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC ；
[0024]R: CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG 進行 PCR 擴增，得到 hBST-2 片段；
[0025]b)以pRluc_N2為模板，以引物
[0026]F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC,
[0027]R: CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC 進行 PCR 擴增，得到 Rluc 片段；[0028]c)將Rluc基因克隆到真核表達載體pcDNA?3.l/V5_His A中，酶切位點為把11(111^(301?1，然后在此載體中克隆進1^51'-2基因，酶切位點為如《，Xbal，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pRB ；
[0029]2)質(zhì)粒pVE的構(gòu)建:
[0030]a)以PVpu為模板，以引物
[0031 ] F:CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT，
[0032]R: CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA 進行 PCR 擴增，得到 Vpu 片段；
[0033]b)將Vpu基因克隆進載體pEYFP-Nl中，酶切位點NheI，HindIII，構(gòu)建質(zhì)粒pVE ；
[0034]3)質(zhì)粒pRB-VE的構(gòu)建:
[0035]a)以質(zhì)粒pRB為模板，以引物
[0036]F:CGCGGATCCCCACCATGGCTTCCaAGGTGTAC，
[0037]R: AGCTTTGTTTAAACTCACTGCAGCAGAGCGCT 進行 PCR 擴增得到 RB 片段，
[0038]b)以質(zhì)粒pVE為模板，以引物
[0039]F:CGGGGTACCCCACCATGGTGCCCATTATTGTC，
[0040]R: CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC 進行 PCR 擴增得到 VE 片段；[0041]c)將RB，VE分別克隆進載體pYr-adshuttle-3中，RB克隆位點為MCS1:BamHI, PmeI, VE 克隆位點為 MCSI1:KpnI, HindIII，構(gòu)建質(zhì)粒 pRB-VE。
[0042]本發(fā)明提供了上述方法在篩選抗HIV-1藥物中的應用。
[0043]本發(fā)明提供了真核表達質(zhì)粒pRB和pVE或真核表達質(zhì)粒pRB_VE在篩選抗HIV-1藥物中的應用。
[0044]本發(fā)明提供了 293細胞系在篩選抗HIV-1藥物中的應用。
[0045]本發(fā)明運用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(Bioluminescence resonance energytransfer I, BRET)技術(shù)，以人類宿主細胞因子BST-2和HIV-1病毒輔助蛋白Vpu之間的相互作用為藥物靶點，應用BRET方法，針對雙表達BST-2和Vpu的穩(wěn)定表達細胞系，篩選出破壞兩種蛋白質(zhì)相互作用的小分子化合物，建立了細胞水平的抗HIV-1藥物篩選模型。進而提供了一種篩選抗HIV-1藥物的方法。在此方法中，將待測化合物直接加入到此穩(wěn)定表達蛋白的細胞中，觀察BRET信號較對照組(只加溶劑DMS0)是否降低，如若降低，說明兩種蛋白間的相互作用受到了化合物的抑制，可作為初篩陽性結(jié)果。本發(fā)明中的藥物篩選方法操作簡單，避免了每次實驗前轉(zhuǎn)染細胞的繁瑣程序，只需加藥-再培養(yǎng)-測定幾個簡單的步驟，有效地實現(xiàn)快速、高通量。利用該方法能夠方便、快速地篩選抗HIV-1藥物，為HIV-1的治療藥物的篩選提供了新途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1是質(zhì)粒pRB的圖譜。
[0047]圖2是質(zhì)粒pVE的圖譜。
[0048]圖3是質(zhì)粒pRB-VE圖譜。
[0049]圖4是穩(wěn)定表達細胞株中RB和VE蛋白表達western檢測圖。
【具體實施方式】[0050]以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0051]若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0052]實施例1
[0053]1、構(gòu)建表達載體
[0054]以 phBST-2 (購自 NIH AIDS Reagent Program)為模板，以引物 F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC, R: CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG 擴增，得到 hBST-2 片段。
[0055]以pRluc-N2 (購自 PerkinElmer 公司)為模板，以引物 F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC, R: CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC 擴增，得到 Rluc 片段，
[0056]WpVpu (購自 NIH AIDS Reagent Program)為模板，以引物 F: CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT, R: CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA 擴增，得到 Vpu 片段。
[0057]將Rluc基因(酶切位點為Hindlll, EcoRI)克隆到真核表達載體pcDNA?3.1/V5-His A(購自Invitrogen公司)中，繼而在此載體中克隆進人源的BST-2基因(酶切位點為NotI，XbaI)，構(gòu)建質(zhì)粒pRB JfHIV-1的輔助蛋白Vpu克隆進載體pEYFP-Nl (購自Clontech公司)中，酶切位點為NheI, HindIII,構(gòu)建質(zhì)粒pVE。
[0058]PCR反應體系:
【權(quán)利要求】
1.一種抗HIV-1藥物的篩選方法，其特征在于，添加待檢樣品至能穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系的細胞中，檢測細胞BRET信號的變化，若BRET信號下降，則待檢樣品為抗HIV-1陽性藥物； 所述RB是將BST-2的氨基端與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白連接而成的，所述VE是將Vpu的羧基端與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移受體蛋白連接而成的，使BST-2和Vpu之間產(chǎn)生BRET信號。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移供體蛋白選自:海腎突光素酶Rluc。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移受體蛋白選自:增強型黃色熒光蛋白EYFP。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞系為293細胞系。
5.一種篩選穩(wěn)定表達RB和VE的細胞系的方法，其特征在于，將雙表達RB和VE的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,添加終濃度為lmg/ml的抗生素G418,初篩10-14天,將細胞進行單克隆化操作，擴大培養(yǎng)后，經(jīng)觀察和檢測儀檢測，兩種蛋白表達均良好的細胞系確定為穩(wěn)定表達RB、VE的細胞系。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述雙表達RB和VE的質(zhì)粒為pRB-VE，能在細胞內(nèi)同時表達RB和VE兩種蛋白。
7.一種真核雙表達質(zhì)粒，其為pRB-VE，其核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
8.—種構(gòu)建權(quán)利要求7所述真核雙表達質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟: .1)質(zhì)粒PRB構(gòu)建: a)以phBST-2為模板，以引物
F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC ； R: CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG 進行 PCR 擴增，得到 hBST-2 片段； b)以pRluc-N2為模板，以引物
F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC, R: CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC 進行 PCR 擴增，得到 Rluc 片段； c)將Rluc基因克隆到真核表達載體pcDNA?3.l/V5_His A中，酶切位點為把11(111^(301?1，然后在此載體中克隆進1^51'-2基因，酶切位點為如《，Xbal，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pRB ； .2)質(zhì)粒pVE的構(gòu)建: a)以pVpu為模板，以引物
F:CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT, R: CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA 進行 PCR 擴增，得到 Vpu 片段； b)將Vpu基因克隆進載體pEYFP-Nl中，酶切位點NheI，HindIII，構(gòu)建質(zhì)粒pVE； .3)質(zhì)粒pRB-VE的構(gòu)建: a)以質(zhì)粒pRB為模板，以引物
F:CGCGGATCCCCACCATGGCTTCCaAGGTGTAC, R: AGCTTTGTTTAAACTCACTGCAGCAGAGCGCT 進行 PCR 擴增得到 RB 片段， b)以質(zhì)粒pVE為模板，以引物F:CGGGGTACCCCACCATGGTGCCCATTATTGTC, R: CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC 為引物進行 PCR 擴增得到 VE 片段； c)將 RB, VE 分別克隆進載體 pYr-adshuttle-3 中，RB 克隆位點為 MCS1: BamHI, PmeI, VE克隆位點為MCSI1:KpnI，Hindlll，構(gòu)建質(zhì)粒pRB_VE。
9.真核表達質(zhì)粒pRB和pVE或質(zhì)粒pRB-VE在篩選抗HIV-1藥物中的應用。
10. 293細胞系在篩選抗HIV- 1藥物中的應用。
【文檔編號】C12Q1/66GK103540644SQ201210239795
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月10日
【發(fā)明者】郭斐, 龐曉靜, 胡斯奇 申請人:中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所