專利名稱：納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種具有近紅外吸收功能和光熱轉(zhuǎn)換性能
的、貴金屬納米材料及制備方法和利用光熱轉(zhuǎn)換性能在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體地說(shuō) 是提供了一種納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾十年來(lái)金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)是貴重金屬的納米材料由于在催 化，感光，光電子，信息存儲(chǔ)，生物傳感器，表面增強(qiáng)拉曼光譜(Raman)散射等領(lǐng)域具有現(xiàn)實(shí) 的和潛在的應(yīng)用前景。金屬納米材料的基本物理性質(zhì)與其尺寸、形貌和結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。最 近幾年，空的納米金膠體由于其具有獨(dú)特的物理性質(zhì)和廣闊的應(yīng)用前景引起了科學(xué)界的廣 泛關(guān)注?？盏募{米金結(jié)構(gòu)在近紅外區(qū)(800nm-1200nm人體組織的透射窗口 )的特殊吸收性 質(zhì)使其成為理想的光熱轉(zhuǎn)換的藥物載體，這在生物醫(yī)學(xué)上具有重要意義。有人提出，調(diào)整納 米金殼在紅外區(qū)的吸收，并將其注射到一定深度的生物組織當(dāng)中去，用適當(dāng)?shù)募t外光照射， 使其進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換達(dá)到熱療目的。美國(guó)科學(xué)家正在嘗試將這種材料用于紅外熱療治療癌 癥。Y.Xia研究組在Science上報(bào)導(dǎo)了高質(zhì)量Au、Ag立方體納米顆粒的合成及結(jié)構(gòu)。他們 利用多羥基過(guò)程以乙二醇為還原劑，以PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)為分散劑和保護(hù)劑通過(guò)對(duì) 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和化學(xué)配比的控制，制備了 Ag的球、線、立方晶并以其為模板分別制備 了空的Au球殼、管、盒子并對(duì)其吸收性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)了金納米球殼在近紅外區(qū)域具 有強(qiáng)的表面等離子體共振吸收特性。2003年，美國(guó)的Halas小組報(bào)導(dǎo)了將包覆在Si02球上 的Au殼(100nm)置于生物體中，成功殺死癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，展示了金屬納米材料在癌癥 治療方面誘人的前景。納米球殼可與一定的抗體結(jié)合，該結(jié)合物在抗體的驅(qū)動(dòng)下移向抗原， 從而準(zhǔn)確的完成細(xì)胞的靶向定位。同時(shí)她們又提出許多新想法，她們認(rèn)為，可以同時(shí)利用納 米球殼對(duì)近紅外光的吸收特性實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的殺傷，又可以利用其對(duì)光的散射作用進(jìn)行 光學(xué)成像實(shí)現(xiàn)對(duì)病變部位的監(jiān)測(cè)。最近Y. Xia研究組將金納米盒子與與乳腺癌癥腫瘤細(xì)胞 靶向連接，在培養(yǎng)皿中通過(guò)紅外激光輻照取得了很好的療效[5]，更清晰地展示了金屬納米 材料在紅外治療方面的誘人前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種納米金球殼材料，具有可調(diào)制的近紅外吸收功能和優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn) 換性質(zhì)。 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了上述納米金球殼材料的制備方法，具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好， 制得的材料其物理性能穩(wěn)定的特點(diǎn)。 本發(fā)明還公開(kāi)了該納米金球殼材料在制備抗癌藥物中的用途。
本發(fā)明的納米金球殼材料，其特征在于 為準(zhǔn)球殼形，內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，球的直徑在20 100nm之間，球殼的厚度大約為 5nm，紅外吸收見(jiàn)圖2，光熱轉(zhuǎn)換特性見(jiàn)圖3。
本發(fā)明納米金球殼材料的制備方法，包括以下步驟 1、合成銀納米粒子，使其均勻分散于去離子水中，形成水溶膠在lOOmL去離子水中分別加入0. 2M硝酸銀水溶液和等量的0. 2M表面活性劑，攪
拌30min，使其混合均勻；然后一次性加入0. 01M還原劑溶液，攪拌60min后停止，制得的銀
納米水溶膠為淺黃色； 2 、還原氯金酸形成金殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取10mL由步驟1制得的納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL，充分?jǐn)嚢?；?于IO(TC回流10分鐘，逐滴滴入0. OOIM氯金酸(HAuCl4)水溶液，充分反應(yīng)，使含銀納米顆 粒模板在回流狀態(tài)下還原氯金酸(HAuCl》，形成殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料； 所述的表面活性劑選自檸檬酸或十六烷基_3-甲基溴化銨或聚乙烯吡咯烷酮； 所述的還原劑包括硼氫化納(NaBH4)或抗壞血酸； 反應(yīng)式如下BH4—+2H20+8Ag+ — 8Ag+B02—+8H+ 3Ag (s) +AuCl4— (aq) — Au (s) +3Ag+ (aq) +4C1— (aq) 本發(fā)明納米金球殼材料為空的納米結(jié)構(gòu)，呈球形，通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)條件，球的直徑可 以控制在20 100nm之間；球殼的厚度大約為5nm(見(jiàn)圖1)，可以分散在水溶液中，形成一 種穩(wěn)定的水溶膠，水溶膠為深藍(lán)色。 發(fā)明具有良好的水溶性、熱穩(wěn)定性以及對(duì)光有強(qiáng)的紅外吸收(見(jiàn)圖2)，隨著滴入 氯金酸(HAuCl4)體積的增加吸收峰位發(fā)生紅移，在(700-lOOOnm)的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，并可移至 近紅外區(qū)吸收進(jìn)紅外光。 本發(fā)明的光熱轉(zhuǎn)換特性見(jiàn)圖3，當(dāng)按體積比稀釋不同濃度的樣品經(jīng)波長(zhǎng)為 808-nm(功率密度5W/cm2)近紅外激光照射后，溫度迅速升高。
以下實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的作用
試驗(yàn)例1 圖3為加入不同濃度金納米球殼細(xì)胞經(jīng)2W/cm2激光照射不同時(shí)間的抑制率曲線。 納米球殼的初始濃度約為5ii g/mL，分別按體積比的60%、80%、100%加入到細(xì)胞中。如圖 所示，對(duì)細(xì)胞的抑制率隨樣品濃度的增大和照射時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，照射30min后最高的 抑制率為60%，與對(duì)照組比較(P < 0. 05)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。 按體積比將樣品稀釋為不同濃度(25-100% )，經(jīng)波長(zhǎng)為808-nm(功率密度5W/ cm2)的近紅外激光照射后，溫度迅速升高。在10min內(nèi)溫度最高可升高3(TC。見(jiàn)圖4。
試驗(yàn)例2
體外細(xì)胞試驗(yàn)
(1)小牛血清制備 冷凍的小牛血清置于4°C的冰箱融化后，56t:水浴30min滅活補(bǔ)體，分裝于10mL的
小瓶?jī)?nèi)，-2(TC保存，用前融化。 (2)胰酶配制 配制濃度為25%的胰蛋白酶。稱取胰蛋白酶O. 25g，溶于100mL生理鹽水中，加 NaHC(^調(diào)pH 7. 2，充分溶解后，G6漏斗過(guò)濾除菌，10mL小瓶分裝后保存與_20°C ，用前融化。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清的全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于37°C ， 5% C02， 95%空氣和
100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞每?jī)商靷鞔鷵Q液一次。 (4)細(xì)胞凍存用0. 25%的胰酶消化收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清，加入 細(xì)胞冷凍液(含20%小牛血清，10% DMS0， 70%培養(yǎng)基)，混勻，細(xì)胞濃度為0. 5 1 X 107/ mL，4t:放兩小時(shí)，-2(TC過(guò)夜，于_701:放置兩個(gè)小時(shí)，置于液氮中長(zhǎng)期保存。
(5)細(xì)胞存活試驗(yàn) 3-(4， 5- 二甲基噻唑-2?；?_2， 5 二苯基四氮唑溴鹽，簡(jiǎn)稱MTT或噻唑藍(lán)。 根據(jù)細(xì)胞代謝活動(dòng)與活細(xì)胞數(shù)直接成比例的原理，通過(guò)測(cè)定靶細(xì)胞代謝活性的減
少來(lái)反映實(shí)驗(yàn)藥物所致靶細(xì)胞的死亡。氧化型MTT進(jìn)入細(xì)胞后被線粒體脫氫酶還原生成紫
色formazan顆粒，經(jīng)溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細(xì)胞數(shù)有關(guān)，與靶細(xì)胞對(duì)
照孔比較可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞百分率。 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用0. 25%的胰酶消化，調(diào)細(xì)胞濃度為4X10VmL，接種 于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)16h，待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入樣品(樣品在加入前經(jīng)過(guò)離心分 離、水洗，并高壓滅菌處理)，終體積為100 ii L，設(shè)三個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用808nm的激 光輻照后，每孔加入MTT (5mg/mL) 10 y L，繼續(xù)培養(yǎng)至少4h，小心吸棄上清液，加二甲基亞砜 (100 y L/孔)，輕微震蕩，檢測(cè)A492光密度值。 抑瘤率(IR) % = (l-實(shí)驗(yàn)組平均光密度值/對(duì)照組平均光密度值)％
加入金納米球殼的細(xì)胞經(jīng)不同功率的激光照射后抑制率隨激光功率的升高而升 高。提高激光照射功率對(duì)于抑制率的提高有著明顯的作用，在加金納米球殼的實(shí)驗(yàn)孔中抑 制率接近90%，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)圖4。 取傳代的H印-A-22細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并攝影，結(jié) 果如圖5所示。接種24h后，H印-A-22細(xì)胞亮度較高，折光性好，細(xì)胞緊密相靠，連接成片， 細(xì)胞形狀不規(guī)則，有梭形細(xì)胞存在，這說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞處于分裂期，具有較高的活性。接種 后加入金納米球殼并經(jīng)激光輻照，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞呈球形彼此重疊堆積在一起，亮度低， 表明細(xì)胞的狀態(tài)較差，活性降低，處于凋亡期。
試驗(yàn)例3 體內(nèi)測(cè)溫將0. lmL樣品注射到小鼠右后腿部(距體表約2mm) ， 20min后將測(cè)溫儀
的溫度探頭用套管針深入到小鼠右后腿注射過(guò)樣品的部位，用除毛膏除去小鼠腿部的毛，
用功率密度為1. 5W/cm2的激光照射小鼠腿部，同時(shí)在測(cè)溫裝置上監(jiān)測(cè)溫度變化。 由圖7可以看出，注射了本發(fā)明樣品的小鼠腿部經(jīng)激光照射后溫度升高較快，持
續(xù)照射6min后，溫度升高到4(TC以上，并且在激光的照射下繼續(xù)升高。因此，我們可以通過(guò)
調(diào)節(jié)激光器的輸出功率來(lái)控制溫度使其恒定在40-45t:之間，通過(guò)熱作用殺死腫瘤細(xì)胞，抑
制腫瘤生長(zhǎng)。 本發(fā)明的積極效果在于 本發(fā)明納米金球殼材料經(jīng)近紅外激光照射后，將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，使局域 范圍內(nèi)的溫度升高，以殺死腫瘤細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞在42t:左右可被殺死)，抑制腫瘤組織的生 長(zhǎng)或與抗腫瘤藥物一起使用，提高藥效，達(dá)到治療目的。
5
納米金球殼狀材料具有可調(diào)制的近紅外吸收特性和優(yōu)良的光熱轉(zhuǎn)換性質(zhì)。在生物 醫(yī)學(xué)、生物探測(cè)等微觀技術(shù)領(lǐng)域里極具實(shí)用性，即可作為顯影劑應(yīng)用在紅外斷層成像技術(shù) 中，又可作為熱敏劑用于紅外熱療中治療腫瘤等疾病和促進(jìn)藥效。本發(fā)明作為顯影劑比臨 床上使用的有機(jī)染料具有更好的穩(wěn)定性，不易分解，光穩(wěn)定性好；比放射性元素更安全；作 為熱敏劑，它可以吸收紅外光，可減少對(duì)人體的傷害。


圖1本發(fā)明納米金球殼材料的形貌和中空殼狀結(jié)構(gòu)圖。
圖2本發(fā)明納米金球殼材料的吸收光譜圖。 圖3本發(fā)明納米金殼材料的細(xì)胞的抑制率隨照射時(shí)間的變化曲線圖。
圖4本發(fā)明納米金球殼材料的光熱轉(zhuǎn)換性質(zhì)圖。
圖5本發(fā)明納米金球殼材料癌細(xì)胞抑制率。 圖6本發(fā)明納米金球殼材料接種入細(xì)胞后，用808nm激光輻照前后細(xì)胞形態(tài)變化
(左處于分裂期的活細(xì)胞；右輻照后凋亡的細(xì)胞)。 圖7本發(fā)明金納米殼材料注入小鼠體內(nèi)后的測(cè)溫曲線。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M檸檬酸，充分?jǐn)?拌；性加入濃度為10mM lmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出銀納米水 溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢瑁糜贗O(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
實(shí)施例2 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M Ag冊(cè)3水溶液；加入lmL 0. 2M十六烷基-3-甲 基溴化銨溶液，充分?jǐn)嚢瑁患尤霛舛葹?0mM lmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停 止，制得出銀納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢?，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
實(shí)施例3 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M聚乙烯吡咯烷 酮水溶液，充分?jǐn)嚢瑁患尤霛舛葹閘OmMlmL硼氫化納(NaBH4)溶液，攪拌60分鐘后停止，制 得出銀納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至lOOmL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢?，置?00°C回流10分鐘，再逐滴滴入3mL ImM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
實(shí)施例4 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M檸檬酸，充分?jǐn)?拌；加入濃度為10mM lmL抗壞血酸溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出銀納米水溶膠；
2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢?，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
實(shí)施例5 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在lOOmL去離子水中加入lmL 0. 2M Ag冊(cè)3水溶液，加入lmL 0. 2M十六烷基-3-甲 基溴化銨溶液，充分?jǐn)嚢瑁患尤霛舛葹?0mM lmL抗壞血酸溶液，攪拌60分鐘后停止，制得出 銀納米水溶膠。 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取10mL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢?，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
實(shí)施例6 納米金球殼狀材料制備過(guò)程如下，具體分兩步
1、合成含銀納米粒子的水溶膠 在100mL去離子水中加入lmL 0. 2M AgN03水溶液，加入lmL 0. 2M聚乙烯吡咯烷 酮水溶液，充分?jǐn)嚢?；加入濃度?0mM lmL抗壞血酸溶液。攪拌60分鐘后停止，制得出銀 納米水溶膠； 2、還原氯金酸形成金球殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料 取lOmL納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL將其移入250mL的三口燒瓶 中，充分?jǐn)嚢?，置于IO(TC回流10分鐘，再逐滴滴入3mL lmM的氯金酸(HAuCl4)水溶液，繼續(xù) 反應(yīng)30分鐘，至反應(yīng)液顏色穩(wěn)定為止，還原氯金酸(HAuCl》，既得本發(fā)明。溶液為深藍(lán)色。
權(quán)利要求
一種納米金球殼材料，其特征在于為準(zhǔn)球殼形，內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，球的直徑在20～100nm之間，球殼的厚度大約為5nm，紅外吸收光普見(jiàn)圖2，光熱轉(zhuǎn)換特性見(jiàn)圖3。
2. 權(quán)利要求1所述納米金球材料的制備方法，包括以下步驟1) 合成銀納米粒子，使其均勻分散于去離子水中，形成水溶膠在100mL去離子水中分別加入0. 2M硝酸銀水溶液和等量的0. 2M表面活性劑，攪拌30min，使其混合均勻；然后一次性加入0. 01M還原劑溶液，攪拌60min后停止，制得的銀納米水溶膠為淺黃色；2) 還原氯金酸形成金殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料取10mL由步驟1制得的納米銀膠體溶液，用去離子水稀釋至100mL，充分?jǐn)嚢?；置于IO(TC回流10分鐘，逐滴滴入0. 001M氯金酸(HAuCl4)水溶液，充分反應(yīng)，使含銀納米顆粒模板在回流狀態(tài)下還原氯金酸(HAuCl》，形成殼狀結(jié)構(gòu)的納米材料；所述的表面活性劑選自檸檬酸或十六烷基_3-甲基溴化銨或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇；所述的還原劑包括硼氫化納(NaBH4)或抗壞血酸。
3. 權(quán)利要求1所述的納米金球殼材料在制備抗癌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種納米金球殼材料及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于金屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域。利用濕化學(xué)法，選擇金為研究?jī)?nèi)容，通過(guò)有機(jī)和無(wú)機(jī)溶液的界面進(jìn)行反應(yīng)制得。本發(fā)明納米金球殼材料經(jīng)近紅外激光照射后，將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，使局域范圍內(nèi)的溫度升高，以殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)或與抗腫瘤藥物一起使用，提高藥效，達(dá)到治療目的。還可作為顯影劑應(yīng)用在紅外斷層成像技術(shù)中，又可作為熱敏劑用于紅外熱療中治療腫瘤等疾病和促進(jìn)藥效。本發(fā)明作為顯影劑比臨床上使用的有機(jī)染料具有更好的穩(wěn)定性，不易分解，光穩(wěn)定性好；比放射性元素更安全；作為熱敏劑，它可以吸收紅外光，可減少對(duì)人體的傷害。
文檔編號(hào)A61K47/32GK101711872SQ200910217880
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者宋宏偉, 王宇, 白雪, 董彪 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)