專利名稱：一種利用人體廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法。
背景技術(shù)：
人胚胎干細(xì)胞(hESCs)是唯一可分化為含生殖細(xì)胞在內(nèi)所有體細(xì)胞的干細(xì)胞。1998年人胚胎干細(xì)胞首次建系，目前已成功將hESCs誘導(dǎo)分化出幾乎所有3個(gè)胚層的細(xì)胞類型，但定向分化機(jī)制、細(xì)胞移植等研究亟待進(jìn)一步深入。我國明確將“干細(xì)胞研究”作為國家中長期發(fā)展規(guī)劃重要資助項(xiàng)目，將該領(lǐng)域作為趕超國外先進(jìn)研究水平的突破點(diǎn)。2003年國家科技部、衛(wèi)生部為促進(jìn)我國干細(xì)胞研究的迅速開展，聯(lián)合下發(fā)了 “人胚胎干細(xì)胞研究的倫理指導(dǎo)原則”，為干細(xì)胞研究提供了倫理保障。但截止2010年底，在美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站上登記的hESCs系僅64株，且多個(gè)細(xì)胞系存在問題，hESCs株遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用的需要，目前國內(nèi)尚無一株人胚胎干細(xì)胞系在NIH注冊(cè)成功，因此，亟需一種高效的建立胚胎干細(xì)胞系的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法，可有效解決現(xiàn)有人胚胎干細(xì)胞的建立方法操作復(fù)雜，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干細(xì)胞系遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用的需要的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是，收集并培養(yǎng)廢棄胚胎，分別制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，按照O. 55、. 65 X IO5個(gè)/cm2的密度，混合上述細(xì)胞制備成混合飼養(yǎng)層，采用機(jī)械法分離廢棄胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)置于混合飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，建立人胚胎干細(xì)胞系。本發(fā)明操作簡單，可以有效利用臨床上大量廢棄的新鮮及冷凍胚胎，并利用最佳鋪皿密度，節(jié)約了飼養(yǎng)層細(xì)胞，大大降低了建立胚胎干細(xì)胞系的成本，為將來進(jìn)一步開發(fā)利用胚胎干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明包括以下步驟
(O收集并培養(yǎng)廢棄胚胎收集新鮮的廢棄胚胎或?qū)鋬龅呐咛ミM(jìn)行解凍收集新鮮的廢棄胚胎，其方法為將2-3天的不適合移植和冷凍的廢棄胚胎，移入胚胎培養(yǎng)液微滴中(卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養(yǎng)液，囊胚期胚胎移入囊胚培養(yǎng)液中)，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第5 7天，每日觀察更換培養(yǎng)液；
對(duì)冷凍的胚胎進(jìn)行解凍從液氮中取出裝有胚胎的麥管，室溫氣浴30s，31°C水浴30s，用無菌剪刀剪斷麥管，斷端接一段帶空氣的注射器，剪斷另一端，將胚胎吹入空的器皿中，加入O. 8ml的解凍液①，IOmin后依次移入O. 8ml解凍液①+②，解凍液②，解凍液②+③，各5min，胚胎移入解凍液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一個(gè)微滴中，37°C孵育IOmin后移入胚胎培養(yǎng)液中；
胚胎解凍液配制所述的解凍液①為摩爾濃度為O. 5M的蔗糖解凍液(市售產(chǎn)品，SIGMA公司，型號(hào)8005);解凍液②為摩爾濃度為O. 2M的蔗糖解凍液(市售產(chǎn)品，SIGMA公司，型號(hào)8007);解凍液③為HEPES-緩沖HTF含12mg/mlHSA (市售產(chǎn)品，SIGMA公司，型號(hào)8013);解凍液①+②為解凍液①和解凍液②等體積混合的混合液；解凍液②+③為解凍液②和解凍液③等體積混合的混合液；
所述的胚胎培養(yǎng)液包括卵裂期胚胎培養(yǎng)液和囊胚培養(yǎng)液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養(yǎng)液，囊胚期胚胎移入囊胚培養(yǎng)液中；所述的卵裂期胚胎培養(yǎng)液微滴為Iml體積濃度10%的血清替代品(serum protein substitute, SPS,市售產(chǎn)品，SAGE公司)加入9mlQuinn’s-1026 (市售產(chǎn)品，SAGE公司)配成卵裂期胚胎培養(yǎng)液，在35mm的培養(yǎng)皿中做25 μ L微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜；
所述的囊胚培養(yǎng)液微滴為Iml體積濃度10%的血清替代品(市售產(chǎn)品，SAGE公司)加入 9ml Quinn’ s-1029 (市售產(chǎn)品，SAGE公司)配成囊胚培養(yǎng)液，在35mm的培養(yǎng)皿中做25 μ L微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜；
(2)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備分別制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞選取性成熟的昆明雌雄鼠，按性別比I: I合籠，次日觀察雌鼠陰道口，見到陰栓即定為孕O. 5天；斷頸處死孕12. 5 14. 5天的雌鼠，浸泡在盛有體積濃度為75%酒精的燒杯內(nèi)lmin，在無菌條件下暴露子宮，分離子宮系膜，剪斷子宮角，取出整個(gè)子宮，用含青霉素-鏈霉素(100IU/ml)的磷酸緩沖液漂洗3 5次；沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用磷酸緩沖液充分漂洗，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，磷酸緩沖液漂洗3遍，去除胎鼠頭尾、四肢和內(nèi)臟，磷酸緩沖液漂洗其軀干3遍，充分去除紅細(xì)胞；用無菌眼科剪將鼠胚軀干剪成Imm3以下的碎塊，吸于離心管中，室溫下靜置5 10 min，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；加入ImL質(zhì)量濃度為O. 25%胰酶，輕輕吹打30 60 s后，加入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，室溫下靜置5 10 min，收集上層細(xì)胞懸液，重復(fù)該步驟5 6次，每次消化后均收集上層單細(xì)胞懸液，最后一次消化后廢棄剩余組織塊；對(duì)收集到的單細(xì)胞懸液1000 rpm/min離心5min,棄上清,加入飼養(yǎng)層培養(yǎng)基輕輕吹打，制備成均勻的單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，混勻，標(biāo)記培養(yǎng)日期，細(xì)胞名稱，編號(hào)等，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，可見呈三角形或梭形的成纖維細(xì)胞；待細(xì)胞長滿即可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要消化傳代或凍存復(fù)蘇；
制備小兒包皮成纖維細(xì)胞取下的小兒包皮組織，立即放入提前4°C預(yù)冷的無菌生理鹽水的滅菌容器中；將包皮組織在含青霉素-鏈霉素(100IU/ml)的生理鹽水中反復(fù)充分漂洗，去除血跡；去除皮下的疏松結(jié)締組織，將皮片剪成0. 5cmX0. 5cm大小，磷酸緩沖液漂洗兩次；加入ImL質(zhì)量濃度為0. 25%胰酶，4°C消化12 h后，加入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，分離真皮和表皮，37°C條件下I型膠原酶(200 U/ml)消化真皮60min，加入飼養(yǎng)層培養(yǎng)基中和，收集細(xì)胞懸液離心，用飼養(yǎng)層培養(yǎng)基洗3次；將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察，隔天換培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿則可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要消化傳代或者凍存復(fù)蘇；
所述的消化傳代為棄去培養(yǎng)皿中的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，磷酸緩沖液漂洗2遍，加入3-5ml質(zhì)量濃度O. 25%胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞縮回偽足，變圓而未脫落時(shí)，吸出胰酶，加飼養(yǎng)層培養(yǎng)基中和；用吸管吸取培養(yǎng)基吹打瓶底至細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液移至離心管中，1000 rpm/min離心5min,棄上清液,加入4_5ml飼養(yǎng)層培養(yǎng)基吹打均勻，按傳代比例1:3 1:5進(jìn)行傳代，選用3 5代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞；
所述的凍存為每天觀察培養(yǎng)瓶中小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞，待長至飼養(yǎng)層培養(yǎng)基的80 90%時(shí)，可準(zhǔn)備凍存，漂洗、消化操作同上述消化傳代步驟；1000rpm/min離心5min,棄上清,得到細(xì)胞沉淀,加入1-1. 5ml冷凍保護(hù)液,輕輕吹打混勻,冷凍液中細(xì)胞密度為5 10 X IO6個(gè)/ml ;將細(xì)胞懸液裝入冷凍管中，每管裝I. 0ml，冷凍管標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)和凍存日期。依次置于4°C 30min，-20°C 2h, -80°C 6 8h，投入液氮；
所述的復(fù)蘇為從液氮中取出凍存管，輕輕旋松瓶蓋，氣浴30s后立即旋緊瓶蓋，投入、37°C水浴中并不斷搖動(dòng)使其融化；將凍存管內(nèi)融化的細(xì)胞懸液移入離心管中，沿管壁緩慢加入3ml37°C預(yù)熱過的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基,混勻，1000 rpm/min離心5min,棄上清；向細(xì)胞沉淀中加入5ml飼養(yǎng)層培養(yǎng)基，混懸后接種至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞為大小較均一的圓形，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；次日換液，觀察；
(3)混合飼養(yǎng)層的制備
向培養(yǎng)皿中加入質(zhì)量濃度為O. 1%的明膠溶液，至覆蓋住培養(yǎng)皿皿底，室溫下靜置
I.5^2. 5小時(shí)，吸出明膠溶液，得明膠包被的培養(yǎng)皿，待用；收集步驟(2)中制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后，分別避光條件下加入絲裂霉素C溶液，置于35 38°C、體積濃度為4 6%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4小時(shí)后，除去培養(yǎng)瓶中的絲裂霉素C溶液，磷酸緩沖液漂洗5遍后分別加入2ml質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞偽足縮回，變圓而未脫落時(shí)，棄去胰酶，加入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打瓶底使細(xì)胞脫落后，移至離心管內(nèi)，1000 rpm/min離心5min，棄上清，得細(xì)胞沉淀，向離心管中分別加入2 4 ml的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基吹打混勻，分別得小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液；按照細(xì)胞個(gè)數(shù)1:1的比例混合小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，得混合細(xì)胞懸液，按照O. 55、. 65 X IO5個(gè)/cm2的密度，將上述混合細(xì)胞懸液均勻鋪在制備的明膠包被的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿放入35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中，12h細(xì)胞貼壁后即可用做飼養(yǎng)層，在24 48h內(nèi)使用，使用前提前4h更換干細(xì)胞培養(yǎng)基；
(4)人胚胎干細(xì)胞系的建立
采用機(jī)械法分離步驟(I)所得的廢棄胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)取Iml注射器，在解剖顯微鏡下用注射器針頭將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)周圍的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞切除，盡量避免損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；
傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長速度的差異，原代克隆生長3 7天傳代，之后每隔4 7天傳代I次，用Iml注射器的針頭在克隆上進(jìn)行機(jī)械切割，切割時(shí)選取較致密厚實(shí)的克隆，棄去分化的克隆，用巴斯德吸管將切后的克隆接種到新制備的飼養(yǎng)層上，傳代比例1:3 1:5。所述的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基為440ml高糖DMEM，5ml非必需氨基酸，5ml青/鏈霉素，50ml胎牛血清經(jīng)過O. 22um濾器過濾，4°C保存。本發(fā)明還對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液，在制備的明膠包被的培養(yǎng)皿中的鋪皿密度進(jìn)行了研究，相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表I:表I不同密度飼養(yǎng)層上克隆的生長情況 面11密度/cm2 |hESCs克隆形態(tài)觀察
τ>α 5ig清晰，克隆飽滿且明顯隆起，易形成囊狀擬胚體。
0.8X IO5 同上，無明顯差異。_
0Γ6Χ105 ig清晰，細(xì)胞顯著堆積生長，克隆隆起明顯，飽滿，細(xì)胞緊密
04X105 I邊緣模糊，較易分化，克隆不飽滿，無明顯隆起，接種后分化快
經(jīng)過試驗(yàn)，觀察不同密度飼養(yǎng)層上克隆的生長情況，當(dāng)鋪皿密度為O. 6 X IO5個(gè)/cm2時(shí)，邊緣清晰，細(xì)胞顯著堆積生長，克隆隆起明顯，飽滿，細(xì)胞緊密，并且以此密度鋪皿能夠大大節(jié)約鋪皿細(xì)胞數(shù)量，節(jié)省了制作飼養(yǎng)層的成本。 本發(fā)明經(jīng)過多次反復(fù)試驗(yàn)，均得到相同或相似的結(jié)構(gòu)，表明該發(fā)明所述方法穩(wěn)定可靠，對(duì)建立的人胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行了相關(guān)鑒定，試驗(yàn)資料如下
實(shí)驗(yàn)I堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, AKP) 4%多聚甲醒固定克隆30min,PBS (Hyclone)漂洗 3 次，依次經(jīng) TSMl (O. IM NaCl, O. IM TRIS, IOmM MgCl2,0. IM HCl 調(diào) PH至 8.0)、TSM2 (O. IM NaCl,O. IM TRIS,50mM MgCl2,0. IM HCl 調(diào) PH 至 9. 5)各作用 IOmin,PBS漂洗3次，加入AKP顯色液(NBT/BCIP，Vector)室溫避光顯色2h。顯微鏡下觀察顯色程度，蒸餾水沖洗，甘油封片后觀察。實(shí)驗(yàn)2免疫熒光檢測(cè)
4%多聚甲醛固定克隆30min，PBS漂洗3次，O. 1% Triton-X-IOO室溫下5 mins，然后將克隆放于含 3%BSA 的 PBS 中封閉 30mins，加入 I 40 (v v)稀釋的 SSEA-4, SSEA-1,NANOG,S0X2，TRA-l-60—抗(Santa Cruz)，濕盒中4°C過夜。次日PBS漂洗，避光條件下加入1:100(v/v)稀釋的相應(yīng)的FITC標(biāo)記的二抗(北京中杉)，濕盒中37°C培養(yǎng)箱30min，PBS漂洗，甘油封片，突光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子0CT-4的表達(dá)
Trizol提取胚胎干細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)4體外分化成擬胚體
胰酶消化細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為4X104/ml，懸滴在培養(yǎng)皿蓋上，每滴30 μ I，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱，每天觀察。3天后簡單擬胚體形成，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用不含bFGF的hESCs培養(yǎng)液培養(yǎng)，吹打使細(xì)胞懸浮。每天取出1-2次，輕輕晃動(dòng)，必要時(shí)換液。培養(yǎng)5-10天后，可見囊狀擬胚體。實(shí)驗(yàn)5體內(nèi)分化成畸胎瘤
機(jī)械切割hESCs克隆成50-100個(gè)小細(xì)胞團(tuán)塊，接種至SCID小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)后腿或腹股溝處，每天觀察。8-12周，腫瘤直徑達(dá)Icm時(shí)，取出腫瘤，PBS漂洗，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)6核型分析
1.5ml干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入30μ I秋水仙素(終濃度O. 2μ g/ml)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h。PBS漂洗2次，O. 05%胰酶消化細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞，終止消化，3000rpm離心去上清，加入0.07511101/1的1((^低滲液1.51111，室溫下作用15min。加入數(shù)滴固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)預(yù)固定,離心去上清,依次經(jīng)Iml固定液作用40min、20min,離心去上清,加入固定液2 3滴，混勻后滴片。濕度50%，221條件下晾干玻片，901烤片30min，0. 05%胰酶作用3-10s，0. 9%NaCL快速漂洗2次，Giemsa染液染色lOmin，雙蒸水漂洗，自然晾干，油鏡下觀察分析。
經(jīng)過上述試驗(yàn)鑒定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)本發(fā)明所述方法建立起來的胚胎干細(xì)胞系具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠達(dá)到實(shí)際臨床醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并且采用上述方法，廢棄胚胎序貫培養(yǎng)到囊胚后，優(yōu)質(zhì)囊胚的建系率可以達(dá)到31. 7%，達(dá)到國際先進(jìn)水平。表2混合飼養(yǎng)層上建系情況說明
權(quán)利要求
1.一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)收集并培養(yǎng)廢棄胚胎收集新鮮的廢棄胚胎或?qū)鋬龅呐咛ミM(jìn)行解凍，按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)； (2)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備按照常規(guī)方法分別制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞； (3)混合飼養(yǎng)層的制備分別收集步驟(2)中制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，分別經(jīng)磷酸緩沖液漂洗，絲裂霉素C處理后，得到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液；按照細(xì)胞個(gè)數(shù)I :1的比例混合小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞，得混合細(xì)胞懸液，按照O. 55、. 65 X IO5個(gè)/cm2的密度，將上述混合細(xì)胞懸液均勻鋪在明膠包被的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿放入35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 14h即得混合飼養(yǎng)層； (4)人胚胎干細(xì)胞系的建立采用常規(guī)的機(jī)械法分離步驟(I)所得的廢棄胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)置于步驟(3)所得的混合飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，建立人胚胎干細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟 (O收集并培養(yǎng)廢棄胚胎收集新鮮的廢棄胚胎或?qū)鋬龅呐咛ミM(jìn)行解凍 收集新鮮的廢棄胚胎，其方法為將2-3天的不適合移植和冷凍的廢棄胚胎，移入胚胎培養(yǎng)液微滴中，置于35 38 °C、體積濃度為4" %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第5 7天,每日觀察更換培養(yǎng)液； 對(duì)冷凍的胚胎進(jìn)行解凍從液氮中取出裝有胚胎的麥管，室溫氣浴30s，31°C水浴30s，用無菌剪刀剪斷麥管，斷端接一段帶空氣的注射器，剪斷另一端，將胚胎吹入空的器皿中，加入O. 8ml的解凍液①，IOmin后依次移入O. 8ml解凍液①+②，解凍液②，解凍液②+③，各5min，然后將胚胎移入解凍液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一個(gè)微滴中，37°C孵育IOmin后，移入胚胎培養(yǎng)液中； 所述的解凍液①為摩爾濃度為O. 5M的蔗糖解凍液；解凍液②為摩爾濃度為O. 2M的蔗糖解凍液；解凍液③為HEPES-緩沖HTF含12mg/mlHSA ;解凍液①+②為解凍液①和解凍液②等體積混合的混合液；解凍液②+③為解凍液②和解凍液③等體積混合的混合液； 所述的胚胎培養(yǎng)液包括卵裂期胚胎培養(yǎng)液和囊胚培養(yǎng)液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養(yǎng)液，囊胚期胚胎移入囊胚培養(yǎng)液中；所述的卵裂期胚胎培養(yǎng)液微滴為Iml體積濃度10%的血清替代品(市售產(chǎn)品，SAGE公司)加入9ml Quinn’ s-1026 (市售產(chǎn)品，SAGE公司)配成卵裂期胚胎培養(yǎng)液，在35mm的培養(yǎng)皿中做25 μ L微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜；所述的囊胚培養(yǎng)液微滴為Iml體積濃度10%的血清替代品(市售產(chǎn)品，SAGE公司)加入9ml Quinn’ s-1029 (市售產(chǎn)品，SAGE公司)配成囊胚培養(yǎng)液，在35mm的培養(yǎng)皿中做25 μ L微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35 38°C、體積濃度為的CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜； (2)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備分別制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞 制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞選取性成熟的昆明雌雄鼠，按性別比I: I合籠，次日觀察雌鼠陰道口，見到陰栓即定為孕O. 5天；斷頸處死孕12. 5 14. 5天的雌鼠，浸泡在盛有體積濃度為75%酒精的燒杯內(nèi)lmin，在無菌條件下暴露子宮，分離子宮系膜，剪斷子宮角，取出整個(gè)子宮，用含青霉素-鏈霉素(100IU/ml)的磷酸緩沖液漂洗3 5次；沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用磷酸緩沖液充分漂洗，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，磷酸緩沖液漂洗3遍，去除胎鼠頭尾、四肢和內(nèi)臟，磷酸緩沖液漂洗其軀干3遍，充分去除紅細(xì)胞；用無菌眼科剪將鼠胚軀干剪成Imm3以下的碎塊，吸于離心管中，室溫下靜置5 10 min，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；加入Iml質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶，輕輕吹打30 60 s后，力口入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，室溫下靜置5 10 min，收集上層細(xì)胞懸液，重復(fù)該步驟5 6次，每次消化后均收集上層單細(xì)胞懸液，最后一次消化后廢棄剩余組織塊；對(duì)收集到的單細(xì)胞懸液1000 rpm/min離心5min,棄上清,加入飼養(yǎng)層培養(yǎng)基,輕輕吹打,制備成均勻的單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，混勻，標(biāo)記培養(yǎng)日期，細(xì)胞名稱，編號(hào)等，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，可見呈三角形或梭形的成纖維細(xì)胞；待細(xì)胞長滿即可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要消化傳代或凍存復(fù)蘇； 制備小兒包皮成纖維細(xì)胞取下的小兒包皮組織，立即放入提前4°C預(yù)冷的無菌生理鹽水的滅菌容器中；將包皮組織在含青霉素-鏈霉素(100IU/ml)的生理鹽水中反復(fù)充分漂洗，去除血跡；去除皮下的疏松結(jié)締組織，將皮片剪成O. 5cmX0. 5cm大小，磷酸緩沖液漂洗兩次；加入Iml質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶，4°C消化12 h后，加入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，分離真皮和表皮，37°C條件下I型膠原酶(200 U/ml)消化真皮60min，加入飼養(yǎng)層培養(yǎng)基中和，收集細(xì)胞懸液離心，用飼養(yǎng)層培養(yǎng)基洗3次；將細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察，隔天換培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿則可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要消化傳代或者凍存復(fù)蘇； 所述的消化傳代為棄去培養(yǎng)皿中的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞，磷酸緩沖液漂洗2遍，加入3-5ml質(zhì)量濃度O. 25%胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞縮回偽足，變圓而未脫落時(shí)，吸出胰酶，加飼養(yǎng)層培養(yǎng)基中和；用吸管吸取培養(yǎng)基吹打瓶底至細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液移至離心管中，1000 rpm/min離心5min,棄上清液,加入4_5ml飼養(yǎng)層培養(yǎng)基吹打均勻，按傳代比例I :3 I :5進(jìn)行傳代，選用3 5代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞； 所述的凍存為每天觀察培養(yǎng)瓶中小鼠胚胎成纖維細(xì)胞或小兒包皮成纖維細(xì)胞，待長至飼養(yǎng)層培養(yǎng)基的80 90%時(shí)，可準(zhǔn)備凍存，漂洗、消化操作同上述消化傳代步驟；1000rpm/min離心5min,棄上清,得到細(xì)胞沉淀,加入1-1. 5ml冷凍保護(hù)液,輕輕吹打混勻,冷凍液中細(xì)胞密度為5 10 X IO6個(gè)/ml ;將細(xì)胞懸液裝入冷凍管中，每管裝I. 0ml，冷凍管標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)和凍存日期，依次置于4°C 30min, -20°C 2h，-80°C 6 8h，投入液氮；所述的復(fù)蘇為從液氮中取出凍存管，輕輕旋松瓶蓋，氣浴30s后立即旋緊瓶蓋，投入37°C水浴中并不斷搖動(dòng)使其融化；將凍存管內(nèi)融化的細(xì)胞懸液移入離心管中，沿管壁緩慢加入3ml37°C預(yù)熱過的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基,混勻，1000 rpm/min離心5min,棄上清；向細(xì)胞沉淀中加入5ml飼養(yǎng)層培養(yǎng)基，混懸后接種至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞為大小較均一的圓形，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；次日換液，觀察； (3)混合飼養(yǎng)層的制備 向培養(yǎng) 皿中加入質(zhì)量濃度為O. 1%的明膠溶液，至覆蓋住培養(yǎng)皿皿底，室溫下靜置I.5^2. 5小時(shí)，吸出明膠溶液，得明膠包被的培養(yǎng)皿，待用；收集步驟(2)中制備的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后，分別避光條件下加入絲裂霉素C溶液，置于35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4小時(shí)后，除去培養(yǎng)瓶中的絲裂霉素C溶液，磷酸緩沖液漂洗5遍后分別加入2ml質(zhì)量濃度為O. 25%的胰酶，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞偽足縮回，變圓而未脫落時(shí)，棄去胰酶，加入等體積的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打瓶底使細(xì)胞脫落后，移至離心管內(nèi)，1000 rpm/min離心5min，棄上清，得細(xì)胞沉淀，向離心管中分別加入2 4 ml的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基吹打混勻，分別得小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液；按照細(xì)胞個(gè)數(shù)I :1的比例混合小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，得混合細(xì)胞懸液，按照O. 60 X IO5個(gè)/cm2的密度，將上述混合細(xì)胞懸液均勻鋪在制備的明膠包被的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿放入35 38°C、體積濃度為4飛％的CO2培養(yǎng)箱中，12h細(xì)胞貼壁后即可用做飼養(yǎng)層； (4)人胚胎干細(xì)胞系的建立 采用常規(guī)的機(jī)械法分離步驟(I)所得的廢棄胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)取Iml注射器，在解剖顯微鏡下用注射器針頭將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)周圍的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞切除，盡量避免損傷內(nèi)細(xì)胞團(tuán)； 傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長速度的差異，原代克隆生長3 7天傳代，之后每隔4 7天傳代I次，用Iml注射器的針頭在克隆上進(jìn)行機(jī)械切割，切割時(shí)選取較致密厚實(shí)的克隆，棄去分化的克隆，用巴斯德吸管將切后的克隆接種到新制備的飼養(yǎng)層上，傳代比例I :3 I :.5 ； 所述的飼養(yǎng)層培養(yǎng)基為440ml高糖DMEM，5ml非必需氨基酸，5ml青/鏈霉素，50ml胎牛血清經(jīng)過O. 22um濾器過濾，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細(xì)胞系的方法，可有效解決現(xiàn)有人胚胎干細(xì)胞的建立方法操作復(fù)雜，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干細(xì)胞系遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用的需要的問題。解決的技術(shù)方案是，收集并培養(yǎng)廢棄胚胎，分別制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小兒包皮成纖維細(xì)胞，按照0.55~0.65×105個(gè)/cm2的密度，混合上述細(xì)胞制備成混合飼養(yǎng)層，采用機(jī)械法分離廢棄胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)置于混合飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，建立人胚胎干細(xì)胞系。本發(fā)明操作簡單，可以有效利用臨床上大量廢棄的新鮮及冷凍胚胎，并利用最佳鋪皿密度，節(jié)約了飼養(yǎng)層細(xì)胞，大大降低了建立胚胎干細(xì)胞系的成本，為將來開發(fā)利用胚胎干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102703381SQ20121022156
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月30日
發(fā)明者姚桂東, 孔慧娟, 孫瑩璞, 宋文妍, 戴善軍, 李婧, 王芳, 辛志敏, 金海霞 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院