專利名稱：化合物在生物合成核酸以增加細(xì)菌培養(yǎng)物的產(chǎn)率中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物引子 培養(yǎng)物。更具體的，本發(fā)明提供了乳酸菌(LAB)引子培養(yǎng)物的制備方法，其中，乳酸菌被接種到含有至少一種產(chǎn)率增加劑的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)，該產(chǎn)率增加劑是選自由一種或多種用于核酸的生物合成中的化合物或其一種或多種衍生物組成的組。該引子培養(yǎng)物可用于食品、飼料和醫(yī)藥制品的制造中。
背景技術(shù)：
微生物培養(yǎng)物被廣泛用于食品、飼料和醫(yī)藥工業(yè)，用以生產(chǎn)發(fā)酵制品，包括絕大多數(shù)奶制品，例如奶酪、酸奶和黃油，以及還包括肉類、焙烤、酒或蔬菜制品中。另外，微生物培養(yǎng)物還被用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)，包括酶和多種有用的化合物。這些微生物培養(yǎng)物通常被稱作引子培養(yǎng)物，并在工業(yè)化繁殖工廠中被生產(chǎn)和分發(fā)到發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，如乳制品工廠中，其中，引子培養(yǎng)物被用于它們的生產(chǎn)過程。乳酸菌培養(yǎng)物尤其被廣泛用作弓I子培養(yǎng)物。這里所用的術(shù)語“乳酸菌”(LAB)是指由革蘭氏陽性、微嗜氧菌或厭氧菌，其對糖進(jìn)行發(fā)酵，所產(chǎn)生的酸中包括乳酸(為主要產(chǎn)生的酸)、醋酸和丙酸。工業(yè)上最為有用的乳酸菌是屬于乳球菌屬(Lactococcus species (spp.))、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌屬(Pediococcus spp.)、短桿菌屬(Brevibacterium spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌屬(Propionibacterium spp.)中的乳酸菌。此外，屬于嚴(yán)格厭氧菌群的產(chǎn)乳酸的菌中的雙歧桿菌(bifidobacteria)，即雙歧桿菌屬，其常被單獨(dú)用作食物引子培養(yǎng)物或與乳酸菌結(jié)合使用，通常被包括在乳酸菌組中。甚至是某些葡萄球菌(例如，肉葡萄球菌(S. carnosus)、馬胃葡萄球菌(S. equorum)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、小牛葡萄球菌(S. vitulinus)、木糖葡萄球菌(S. xylosus))屬中的細(xì)菌也被稱為LAB (Mogensen等(2002)Bulletin of the IDF No. 377，10-19)。LAB引子培養(yǎng)物的生產(chǎn)涉及將適當(dāng)數(shù)量的LAB細(xì)胞接種到特異性的發(fā)酵介質(zhì)中，在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下進(jìn)行繁殖。在工業(yè)化生產(chǎn)中，需竭力做到在發(fā)酵過程結(jié)束時獲得高濃度的繁殖的細(xì)胞。這就對支持細(xì)胞生長以獲得期望的高的生物質(zhì)量產(chǎn)率的發(fā)酵條件和發(fā)酵介質(zhì)產(chǎn)生較高要求。液體介質(zhì)在600nm的光學(xué)密度(0D_)是一種評價培養(yǎng)物樣品中細(xì)菌細(xì)胞密度的精確方法。術(shù)語“高光學(xué)密度條件”是指在發(fā)酵過程結(jié)束時，繁殖的細(xì)胞濃度高達(dá)0D_為10或以上的發(fā)酵。為了降低生產(chǎn)成本，工業(yè)化的發(fā)酵通常使用復(fù)雜的不明確的發(fā)酵介質(zhì)進(jìn)行。這樣的介質(zhì)的主要成分可以是酵母提取物、玉米淀粉、乳清蛋白質(zhì)或其它基于乳汁的介質(zhì)，它們都具有復(fù)雜的成分。對于選擇的發(fā)酵而言，是使用通常由純的化學(xué)物質(zhì)制成的化學(xué)成分來確定的介質(zhì)。純的化學(xué)物質(zhì)，例如特異性的能量源或碳源，也通常被添加到復(fù)合發(fā)酵介質(zhì)中用于特異性的用途。無論在哪種情況下，對微生物細(xì)胞的存活能力而言發(fā)酵介質(zhì)的組合物可能是最優(yōu)化的，但對于獲得高的微生物的生物質(zhì)量產(chǎn)率而言就不一定是最優(yōu)化的。多數(shù)細(xì)胞生長所需的化合物，是需要消耗能量以提供細(xì)胞生產(chǎn)。這通常需要通過表達(dá)編碼相應(yīng)生物合成的酶的基因。這些酶的合成需要氨基酸和能量。由于必須合成相對更多的酶來生長，這樣就對細(xì)胞施加了 “蛋白質(zhì)負(fù)擔(dān)”。由于形成細(xì)胞成分所需的前體必須從其它途徑獲得，這又給細(xì)胞帶來了額外的負(fù)擔(dān)。在核酸生物合成中所用到的一些化合物被發(fā)現(xiàn)是用于所謂的冷凍保護(hù)劑，以及減少冷凍和解凍過程中對活細(xì)胞的存活性帶來的破壞性影響。W000/39281描述了在DNA的生物合成中，使用肌苷酸鹽(MP)和其它化合物來穩(wěn)定儲存中的液體引子培養(yǎng)物的代謝活性。已知的是LAB具有復(fù)雜的生長因子需要，且在DNA和/或RNA的生物合成中涉及的化合物在具有確定了化學(xué)組成的介質(zhì)中激發(fā)LAB的生長。但是，一些報道顯示，盡管添加這些化合物產(chǎn)生了較短的停滯期或較高的初始生長速率，但卻沒有或僅略微提高產(chǎn)率(Klistrup(2005)FEMS Microbiol Rev. 29,555-590 ；Nygaard(1951) J Bact 61,497-505 ；Weinman (1964) J Bact 87，263_269)。添加涉及在DNA生物合成中的化合物甚至可能抑制產(chǎn)率(Weinman (1964) J Bact 87，263-269)。如在實施例3和4中所示，添加涉及在DNA生物合成中的化合物也沒有增加達(dá)到了高光學(xué)密度條件的發(fā)酵的生物質(zhì)量的產(chǎn)率。因此，需要提供一種新的方法來提高在高光學(xué)密度條件下進(jìn)行的發(fā)酵的生物質(zhì)量
的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題可通過提供一種方法來制備LAB的微生物培養(yǎng)物，以在高光學(xué)密度條件下提高生物質(zhì)量的產(chǎn)率。Richardson在1936年(Biochem J. 30, 2186)曾經(jīng)報道，尿卩密唳對于葡萄球菌的厭氧生長至關(guān)重要，當(dāng)對相同有機(jī)體的好氧生長無關(guān)緊要。因此，當(dāng)將核酸生物合成中涉及的化合物添加到復(fù)雜的發(fā)酵介質(zhì)中，而令人感到十分驚奇是發(fā)現(xiàn)LAB引子培養(yǎng)物在有氧培養(yǎng)或生廣中有可能提聞生物質(zhì)量的廣率。因此，本發(fā)明的第一方面涉及在通氣和高光學(xué)密度條件下發(fā)酵，獲得增加的乳酸菌培養(yǎng)物的產(chǎn)率的方法，該方法包括以下步驟i)在培養(yǎng)介質(zhì)中培育乳酸菌，并在一定條件下使得發(fā)酵進(jìn)行到在600nm測量的光學(xué)密度(0D_)為10，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少一種產(chǎn)率增加劑，其選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸和它們的衍生物組成的組，濃度為確保在發(fā)酵結(jié)束時培養(yǎng)介質(zhì)含有至少I y M的所述至少一種產(chǎn)率增加劑；以及ii)收集所述乳酸菌以獲得乳酸菌培養(yǎng)物，
其中，比起在相同條件下和相似介質(zhì)中但在發(fā)酵結(jié)束時含有少于IuM的各產(chǎn)率增加劑來培養(yǎng)微生物的情況下，產(chǎn)率增加劑增加了收集到的乳酸菌的產(chǎn)率。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)介質(zhì)含有至少5 ii M的至少一種產(chǎn)率增加劑，例如，至少IOiiM,如至少50 ii M的至少一種產(chǎn)率增加劑。特別的，所述培養(yǎng)介質(zhì)含有至少5 ii M的選自MP、GMP、肌苷和鳥嘌呤的組的試劑。優(yōu)選的，所述相似介質(zhì)含有少于5 PM的各產(chǎn)率增加劑，例如少于I PM，如少于0. 5uM的各產(chǎn)率增加劑。特別的，所述相似介質(zhì)含有少于5 ii M的選自IMP、GMP、肌苷和鳥嘌呤的組的試劑。本發(fā)明的第二方面涉及根據(jù)在此描述的本發(fā)明第一方面和其實施方式獲得的引子培養(yǎng)物。本發(fā)明的第三方面涉及培養(yǎng)介質(zhì)，其包含至少一種產(chǎn)率增加劑，該產(chǎn)率增加劑選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸和它們的衍生物組成的組。本發(fā)明的弟四方面涉及制備食品、詞料制品、醫(yī)藥制品、奶味制品和奶釀味制品的 方法，所述方法包括向食物、飼料或醫(yī)藥制品的起始材料中加入根據(jù)本發(fā)明第二方面和其實施方式的有效量的微生物引子培養(yǎng)物，并使該接種的起始材料處于微生物體保持代謝活性的條件下。本發(fā)明的第五方面涉及由按此處描述的本發(fā)明第四方面和其實施方式獲得的發(fā)酵的食物、飼料或醫(yī)藥制品。定義在對發(fā)明的詳細(xì)實施方式作描述前，先對這里所用的特定術(shù)語提供進(jìn)一步定義。這里，術(shù)語“嘌呤堿基”意在包括具有嘌呤核心結(jié)構(gòu)的含環(huán)氮的堿基。因此，在本文中，術(shù)語“嘌呤堿基”意為任選取代的嘌呤。具體的嘌呤堿基的例子包括腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤。類似地，術(shù)語“嘧啶堿基”意在包括具有嘧啶核心結(jié)構(gòu)的含環(huán)氮的堿基。因此，在本文中，術(shù)語“嘧啶堿基”意為任選取代的嘧啶。具體的嘧啶堿基的例子包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本文中，術(shù)語“核苷酸”意指2-脫氧核糖(DNA)單體或核糖(RNA)單體，其通過I號碳原子連接到嘌呤堿基，如腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤上，或通過I號碳原子連接到嘧啶堿基，如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。另外，DNA或RNA單體通過其5號碳原子連接到磷酸基上。具體的核苷酸的例子包括腺苷單磷酸(AMP)、鳥苷單磷酸(GMP)、尿苷單磷酸(UMP)、胞苷單磷酸(CMP)、黃嘌呤單磷酸(XMP)，肌苷單磷酸(IMP)、脫氧腺苷單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷單磷酸(dGMP)、胸苷單磷酸(dTMP)、脫氧胞苷單磷酸(dCMP)、脫氧黃嘌呤單磷酸(dXMP)和脫氧肌苷單磷酸(dMP)。MP尤為優(yōu)選。這里所用的術(shù)語“核苷”意指2-脫氧核糖(DNA)單體或核糖(RNA)單體，其通過I號碳原子連接到嘌呤堿基，如腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤上，或通過I號碳原子連接到嘧啶堿基，如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶上。具體的核苷例子包括腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧胞苷和脫氧肌苷。肌苷尤為優(yōu)選。由以上對術(shù)語“核苷”和“核苷酸”的定義可以理解，核苷酸可被認(rèn)為是包含通過糖單元的第5號碳原子連接的磷酸基的核苷。因此，這里描述的核苷酸也可認(rèn)為是“核苷”-5'-單磷酸。例如，肌苷酸(IMP)可指肌苷-5'-單磷酸，脫氧肌苷酸(dIMP)可指脫氧肌苷-5'-單磷酸等。本文中，術(shù)語“衍生物”當(dāng)與術(shù)語“核苷酸”或“核苷”連用時，意指那些在其糖(即2-脫氧核糖或核糖)單元發(fā)生了改性的核苷酸或核苷，或那些在其含環(huán)氮堿基發(fā)生了改性的核苷酸或核苷，或者是那些在其糖單元和其含環(huán)氮堿基都發(fā)生了改性的核苷酸或核苷。例如，脫氧核糖單元的2' -H基或核糖單元的2' -OH基可發(fā)生改性，例如，加入2' -F基、2，-0-甲基等。類似的，含環(huán)氮的堿基可含有一個或多個通常不出現(xiàn)在腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶上的取代基。具體的例子包括5-甲基胞嘧啶(MeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6— 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。這里使用的術(shù)語“發(fā)酵”是指在有氧或厭氧條件下繁殖或培育微生物細(xì)胞的過程。這里使用的術(shù)語“引子培養(yǎng)物”是指用于發(fā)酵的培養(yǎng)介質(zhì)的含微生物細(xì)胞的配置物。在本文中，術(shù)語“產(chǎn)率”是指在給定體積的發(fā)酵中所產(chǎn)生的生物質(zhì)量。產(chǎn)率可通過 多種途徑計算；這里，采用兩種不同方法來測量產(chǎn)率。I)為體積的每單位的生物質(zhì)量(減去背景)，在發(fā)酵結(jié)束時通過Icm光程測量發(fā)酵介質(zhì)的600nm的光學(xué)密度(OD6J，或者2)通過在實施例2 :發(fā)酵結(jié)束時的分析過程QAm-043中描述的Pearce測試中的具有“酸化活性”為4. 8-5. I的F-DVS培養(yǎng)物來測量其kg數(shù)。術(shù)語“F-DVS”是指在實施例I中描述的所謂的冷凍直投式培養(yǎng)物。術(shù)語卜啉化合物”是指環(huán)狀四吡咯衍生物，這些衍生物的結(jié)構(gòu)延伸自卟啉，由各種功能基團(tuán)取代位于吡咯核心的頂點(diǎn)處的碳原子而得。它們也指所述衍生物的復(fù)合物，其中，由金屬原子與卟啉環(huán)的四個氮原子中的兩個形成配位鍵。該定義包括但不限于尿卟啉、糞卟啉、原卟啉和血卟啉，以及它們的鹽和酯及與金屬原子的復(fù)合物。特別優(yōu)選的卟啉化合物是原卟啉IX和它與鐵原子的復(fù)合物，特別是血紅素和氯化血紅素，以及葉綠素的衍生物,如葉綠酸。在本文中，詞句“乳酸菌”(LAB)是指由革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、非運(yùn)動的、微嗜氧或厭氧菌組成的一組細(xì)菌，它們對糖進(jìn)行發(fā)酵，所產(chǎn)生的酸中包括乳酸為主要產(chǎn)生的酸，并包括醋酸、甲酸和丙酸。工業(yè)上最為有用的乳酸菌是屬于乳球菌屬(Lactococcusspecies (spp.))、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌屬(Pediococcus spp.)、短桿菌屬(Brevibacterium spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)和丙酸菌屬(Propionibacteriumspp.)中的乳酸菌。此外，屬于嚴(yán)格厭氧菌群的產(chǎn)乳酸菌中的雙歧桿菌(bifidobacteria),即雙歧桿菌屬，常被單獨(dú)用作食物引子培養(yǎng)物或與乳酸菌結(jié)合使用，通常被包括在乳酸菌組中。甚至是某些葡萄球菌(例如，肉葡萄球菌(S. carnosus)、馬胃葡萄球菌(S. equorum)、松鼠葡萄球菌(S. sciuri)、小牛葡萄球菌(S. vitulinus)、木糖葡萄球菌(S. xylosus))屬中的細(xì)菌也被稱為 LAB(Mogensen 等(2002)Bulletin of the IDF No. 377，10-19)。通常用作LAB引子培養(yǎng)物菌株的乳酸菌被大致分為嗜溫有機(jī)物，其最適宜的生長溫度在約30°C，以及嗜熱有機(jī)物，其最適宜的生長溫度范圍是在約40到約45°C之間。典型的屬于嗜溫性的有機(jī)物包括乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、腸膜明串珠菌乳脂亞種(Leuconostocmesenteroides subsp. cremoris)、戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酸乳酸生物變種(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp. casei)和副干釀乳桿菌副干釀亞種(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)。嗜熱性乳酸菌的菌種包括如，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。在介質(zhì)中的產(chǎn)率增加劑的濃度可由于如進(jìn)入到微生物細(xì)胞中的含量而隨著時間而發(fā)生改變，因此有必要指明要進(jìn)行測量或確定產(chǎn)率增加劑的濃度的特定的時間點(diǎn)。因此，用于描述介質(zhì)中的產(chǎn)率增加劑的濃度的術(shù)語“起始”是指在介質(zhì)中加入微生物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)前的介質(zhì)中的產(chǎn)率增加劑的濃度，或者是指在介質(zhì)中剛加入微生物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后的介質(zhì)中的產(chǎn)率增加劑的濃度。根據(jù)本發(fā)明的引子培養(yǎng)物的一個重要的應(yīng)用是作為所謂的益生菌。在本文中，術(shù)語“益生菌”應(yīng)被理解為那些以活細(xì)胞的形式而被人或動物攝食后，可提供改善的健康條 件，例如通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)或幫助消化營養(yǎng)物而抑制胃腸道中有害的微生物。這樣的有益生作用的產(chǎn)物的一個典型例子是“甜酸奶”。以下僅通過實施例對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行描述。


圖I示出了在厭氧條件下進(jìn)行3個嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)的發(fā)酵的產(chǎn)率；附圖示出了在發(fā)酵器中，測量的生物質(zhì)量為非濃縮的發(fā)酵介質(zhì)樣品的0D600對時間(小時)的函數(shù)。實心三角表示加入了 0. 2%w/w IMP,實心圓表示加入了 0. 2% w/w的肌苷,實心方塊表示沒有加入產(chǎn)率增加劑。0. 2% w/w的肌苷大約為7mM的肌苷；圖2在包含相對大量的嘌呤的富含復(fù)合物的介質(zhì)中，在發(fā)酵過程中的多種核化合物和光學(xué)密度的水平；簡言之，乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在包含酵母提取物和其它復(fù)合物成分的復(fù)合物介質(zhì)中進(jìn)行有氧生長。以PM表示的濃度(主軸)和0D600(次軸)對時間作圖。縮寫G，鳥嘌呤；A，腺嘌呤；Hx，次黃嘌呤；X，黃嘌呤；IR，肌苷；GR，鳥苷；GdR，脫氧鳥苷；AR，腺苷；圖3在加入了 2g/L的肌苷的介質(zhì)中的發(fā)酵過程中的嘌呤化合物的水平；簡言之，除了向每升介質(zhì)中加入了 2g的肌苷外，乳酸乳球菌(菌株CHCC2862)在與圖2相同的復(fù)合物介質(zhì)中進(jìn)行有氧生長。以PM表示的濃度(主軸)和0D600X100(次軸)對時間作圖。注意，肌苷的水平是由次軸表示?？s寫G，鳥嘌呤；A，腺嘌呤；Hx，次黃嘌呤；X，黃嘌呤；IR，肌苷；GR,鳥苷；GdR,脫氧鳥苷；AR,腺苷,和IR,肌苷(注意以不同的軸表不肌苷)。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的解決問題的方案是提供制備LAB的微生物培養(yǎng)物的方法，以獲得在高光學(xué)密度條件下增加的產(chǎn)率，該方法是在有氧條件下，在含有至少一種產(chǎn)率增加劑的介質(zhì)中發(fā)酵培養(yǎng)物，該產(chǎn)率增加劑選自由一種或多種涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何這樣的化合物的一種或多種衍生物所組成的組。
并不限于任何理論，可以認(rèn)為產(chǎn)率的增加與至少一種產(chǎn)率增加劑在整個發(fā)酵的過程中一直存在于發(fā)酵介質(zhì)中的情況有關(guān)。觀察到當(dāng)介質(zhì)中的產(chǎn)率增加劑被耗盡時，導(dǎo)致了多種酶系統(tǒng)的重新合成(見實施例6)，并可以認(rèn)為這種耗能的重新合成導(dǎo)致了產(chǎn)率的降低。這種至少一種產(chǎn)率增加劑在整個發(fā)酵的過程中一直存在于發(fā)酵介質(zhì)中的情況可通過起始的含有足量的產(chǎn)率增加劑的介質(zhì)中培育LAB，從而保證至少一種這樣的試劑在整個發(fā)酵的過程中始終保留于介質(zhì)中。這樣的介質(zhì)例如可以是起初含有至少ImM，優(yōu)選至少3mM，更優(yōu)選至少3mM的至少一種產(chǎn)率增加劑的培養(yǎng)介質(zhì)，這些產(chǎn)率增加劑選自由一種或多種涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何這樣的化合物的一種或多種衍生物所組成的組。這樣的介質(zhì)可通過使用那些特別是富含產(chǎn)率增加劑的成分來配置，這些產(chǎn)率增加劑選自由一種或多種涉及核酸的生物的化合物或者是由任何這樣的化合物的一種或多種 衍生物所組成的組。一種這樣的成分可以是酵母提取物，特別是所謂的“富集的”或“增強(qiáng)的”酵母提取物制劑，其特別富含嘌呤和/或嘧啶。除了使用富含產(chǎn)率增加劑的制劑來配置介質(zhì)外，也可向標(biāo)準(zhǔn)的介質(zhì)配方中加入純的制劑。例如，培養(yǎng)介質(zhì)可以是復(fù)合發(fā)酵介質(zhì)，向每升介質(zhì)中加入至少0. 2g,優(yōu)選為至少
0.8g，更優(yōu)選為至少2g的至少一種產(chǎn)率增加劑。也可通過在發(fā)酵中一次或多次加入所述至少一種產(chǎn)率增加劑，從而保證在整個發(fā)酵的過程中至少有一種產(chǎn)率增加劑保留于介質(zhì)中。本發(fā)明在許多工業(yè)界采用的高光學(xué)密度條件下尤為有用。在本發(fā)明的選擇的實施方式中，所述高光學(xué)密度條件的特征是在發(fā)酵結(jié)束時，OD600高于15，優(yōu)選高于20，更優(yōu)選高于30，進(jìn)一步優(yōu)選高于40，最優(yōu)選高于50。在優(yōu)選的實施方式中，其中所述本發(fā)明第一方面方法中獲得的微生物的產(chǎn)率增加至少I. 2倍，優(yōu)選為增加至少I. 3倍，更優(yōu)選為增加至少I. 4倍，進(jìn)一步優(yōu)選為增加至少I. 5倍，最優(yōu)選為增加至少I. 6倍。根據(jù)本發(fā)明，微生物是在有氧條件下進(jìn)行發(fā)酵。優(yōu)選的，微生物培養(yǎng)物在通氣和營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行發(fā)酵，介質(zhì)中含有或加入了至少一種卟啉化合物。在優(yōu)選的實施方式中，LAB在通氣條件下于含B卜啉的營養(yǎng)介質(zhì)中培育，這在W000/0542中有描述,其中，所述介質(zhì)進(jìn)一步含有至少一種產(chǎn)率增加劑，其選自由一種或多種涉及核酸的生物合成的化合物或者是由任何這樣的化合物的一種或多種衍生物所組成的組。W000/0542作為參考附件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用熟知的技藝進(jìn)行通氣，例如，通過搖動或攪拌培養(yǎng)介質(zhì)，或通過向培養(yǎng)介質(zhì)中通入含有氧的如空氣的氣體混合物。在優(yōu)選的實施方式中，所述產(chǎn)率增加劑是選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸，以及它們的衍生物組成的組。所述產(chǎn)率增加劑可以是嘌呤堿基，優(yōu)選是選自由腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤組成的組。所述產(chǎn)率增加劑可以是嘧啶堿基，優(yōu)選是選自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶組成的組。所述產(chǎn)率增加劑可以是核苷，優(yōu)選的是，其中所述核苷是選自由腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧胞苷和脫氧肌苷組成的組。在優(yōu)選的實施方式中，所述核苷是選自由腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、胸苷和肌苷組成的組。最優(yōu)選的是，其中所述的核苷是肌苷。所述產(chǎn)率增加劑可以是核苷酸，優(yōu)選的，所述核苷酸是選自由腺苷單磷酸(AMP)、鳥苷單磷酸(GMP)、尿苷單磷酸(UMP)、胞苷單磷酸(CMP)、黃嘌呤單磷酸(XMP)、肌苷單磷酸(IMP)、脫氧腺苷單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷單磷酸( dGMP)、胸苷單磷酸(dTMP)、脫氧胞苷單磷酸(dCMP)、脫氧黃嘌呤單磷酸(dXMP)和脫氧肌苷單磷酸(dIMP)組成的組。在優(yōu)選的實施方式中，所述核苷酸是選自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和MP組成的組。最優(yōu)選的，所述核苷酸是頂P。一優(yōu)選的實施方式是，所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少兩種產(chǎn)率增加劑，優(yōu)選是選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸和它們的衍生物組成的組。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少兩種產(chǎn)率增加劑，選自由核苷和核苷酸組成的組。最優(yōu)選的是，其中所述核苷是肌苷，所述核苷酸是IMP。一優(yōu)選的實施方式是，其中所述培養(yǎng)介質(zhì)起始為包含l_70mM的各產(chǎn)率增加劑。更優(yōu)選的，其中所述培養(yǎng)介質(zhì)起始為包含l_60mM的各產(chǎn)率增加劑，例如
I.3-60mM,如 I. 5-50mM,優(yōu)選為 2_40mM，如 2. 5-30mM,例如 3_20mM，更優(yōu)選為 3_15mM，例如4-10mM,如約 7mM。令人吃驚的是，通過本發(fā)明的方法，有時可獲得濃度足以用于生產(chǎn)F-DVS而無需濃縮培養(yǎng)物的LAB培養(yǎng)物。但是，即使采用本方法，但大多數(shù)培養(yǎng)物需經(jīng)過濃縮而獲得商用的弓I子培養(yǎng)物。這樣的培養(yǎng)物可優(yōu)選通過離心或超過濾而收集和濃縮。在一優(yōu)選的實施方式中，微生物的培養(yǎng)是在高光學(xué)密度條件的工業(yè)相關(guān)條件下進(jìn)行的。因此，一優(yōu)選的實施方式是培養(yǎng)物的高光學(xué)密度(OD)在600nm的Icm光程介質(zhì)中達(dá)到 OD600 = IO-OD600 = 200，更優(yōu)選的是 OD600 = 15 -0D- = 100，進(jìn)一步優(yōu)選的是 OD600 =20-0D— = 90，最優(yōu)選的是 OD600 = 25-0D— = 80。另外，優(yōu)選的實施方式中，培養(yǎng)過程是在含有5L-100，000L，優(yōu)選300L-20，000L的
培養(yǎng)介質(zhì)的大式發(fā)酵器中進(jìn)行?！獌?yōu)選的實施方式中，培養(yǎng)過程包括控制溫度和/或pH。優(yōu)選的，培養(yǎng)物包括一種或多種有機(jī)物,選自由雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)、短桿菌屬(Brevibacterium spp.)、丙酸菌屬(Propionibacterium spp.)、乳球菌屬(Lactococcus spp.)(包括乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris,))、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)(包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus))、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、乳酸片球菌屬(Pediococcusspp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp.)和酒球菌屬(Oenococcus spp.)。培養(yǎng)物可包含一種或多種最適宜的生長溫度在約30°C的嗜溫有機(jī)物，優(yōu)選一種或多種選自由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis subsp. cremoris)、腸膜明串珠菌乳月旨亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis)、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp. casei)和副干酪乳酸桿菌副干酪亞種(Lactobacillusparacasei subsp. paracasei)組成的組中的嗜溫有機(jī)物。培養(yǎng)物可包含一種或多種最適宜的生長溫度在約40°C到約45°C的嗜熱有機(jī)物，優(yōu)選一種或多種選自由嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp. lactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusac i dophi Ius)組成的組中的嗜熱性有機(jī)物。優(yōu)選的培養(yǎng)物是LAB-培養(yǎng)物,其包含一種或多種選自由乳球菌屬(Lactococcusspp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc spp.)、乳酸片球菌屬(Pediococcusspp.)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)組成的組中的有機(jī)物。培養(yǎng)物可以是LD-培養(yǎng)物，其包含一種或多種選自由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酸乳酸生物變種(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar. diacetylactis)和腸膜明串珠菌乳脂亞種(Leuconostoc mesenteroidessubsp. cremoris)組成的組中的有機(jī)物。培養(yǎng)物可以是0-培養(yǎng)物，其包含一種或多種選自由乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactissubsp. cremoris)組成的組中的有機(jī)物。在優(yōu)選的實施方式中，培養(yǎng)物中含有乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。商業(yè)的引子培養(yǎng)物通常可以冷凍的培養(yǎng)物的形式供給。在低溫下，在這樣的冷凍的培養(yǎng)物中，通常細(xì)胞的大部分代謝活動停止，但細(xì)胞可在該懸浮液中在一段延長的時間內(nèi)維持其活力。由于濃縮的冷凍培養(yǎng)物可直接在生產(chǎn)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，從而在商業(yè)上非常吸引人。通過使用這樣的濃縮的冷凍培養(yǎng)物，最終用戶消除了費(fèi)時費(fèi)力的中間發(fā)酵步驟，在該步驟中，引子培養(yǎng)物經(jīng)擴(kuò)增，且最終用戶還進(jìn)一步減少了烈性污染的危險。這樣的濃縮的培養(yǎng)液可被稱為DVS-直投式 培養(yǎng)物。也可以制備FD-DVS ，濃縮的凍干的直投式 培養(yǎng)物來代替濃縮的冷凍培養(yǎng)物。這樣的培養(yǎng)物具有額外的優(yōu)勢，它們的優(yōu)點(diǎn)是可不用冷凍而進(jìn)行運(yùn)輸。因此，在一優(yōu)選的實施方式中，用于制備產(chǎn)率增加的微生物培養(yǎng)物的方法如下所述并進(jìn)一步包括iii)冷凍所述收集的微生物以獲得冷凍的微生物細(xì)胞。所述方法可進(jìn)一步包括iv)從所述冷凍的細(xì)胞中使水分升華以獲得凍干的細(xì)胞。換句話說，其中所收集的微生物培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為凍干的細(xì)胞培養(yǎng)物。該方法可進(jìn)一步包含V)包裝由上述步驟iii)或iv)中獲得的細(xì)胞。、
通常觀察到冷凍和解凍對活的細(xì)胞的存活能力會產(chǎn)生破壞性影響。這些影響一般被描述為細(xì)胞脫水和在冷凍過程中在細(xì)胞溶質(zhì)中形成冰晶。然而，可使用若干冷凍保護(hù)劑來保證在可控的和造成最低傷害的形式下進(jìn)行冷凍，例如保證在冷凍過程中細(xì)胞溶質(zhì)中不發(fā)生冰晶化或?qū)⒈Щ种频阶钚?。?yōu)選的，向收集的微生物中加入至少一種冷凍保護(hù)劑。優(yōu)選的，冷凍保護(hù)劑是選自由一種或多種涉及核酸的生物合成的化合物或任何這樣的化合物的一種或多種衍生物所組成的組。優(yōu)選的適合于加入到收集的微生物中的優(yōu)選的冷凍保護(hù)劑的例子基本上對應(yīng)于在此描述的優(yōu)選的產(chǎn)率增加劑。向收集的微生物中加入冷凍保護(hù)劑在早先提出的專利申請PCT/DK2004/000477中有過描述。在PCT/DK2004/000477中描述的優(yōu)選的冷凍保護(hù)劑也是本發(fā)明中的優(yōu)選的冷凍保護(hù)劑。PCT/DK2004/000477的全部內(nèi)容在此并入作為參考。
本發(fā)明的另外的實施方式是在此描述的制備產(chǎn)率增加的微生物培養(yǎng)物的方法，并進(jìn)一步包含通過噴霧干燥、真空干燥、空氣干燥或任何適用于干燥細(xì)菌培養(yǎng)物的干燥方法來干燥收集的微生物。優(yōu)選的本發(fā)明的第二方面的引子培養(yǎng)物是以弓I子培養(yǎng)物濃縮物的形式提供，例如含有至少IO8CFU的引子培養(yǎng)物有機(jī)物。本發(fā)明的第三方面涉及一種培養(yǎng)介質(zhì)，其包含至少一種產(chǎn)率增加劑，選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸以及它們的衍生物組成的組。盡管在發(fā)酵過程中大量的產(chǎn)率增加劑被消耗，仍有足夠量的保留于培養(yǎng)物的上清液中以確保濃縮的培養(yǎng)物可被確認(rèn)為本方法得出的介質(zhì)(見實施例5或6)。優(yōu)選的本發(fā)明的第四方面的食物制品是選自由奶制品、蔬菜制品、肉制品、飲料、果汁、酒和焙烤制品組成的組。優(yōu)選的奶制品是選自由奶酪、酸奶、黃油和接種的甜奶和液體發(fā)酵乳制品組成的組。在一有趣的方面，本發(fā)明提供了獲得產(chǎn)率增加的由微生物產(chǎn)生的化合物的方法，所述方法包含以下步驟i)在含有至少一種選自由一種或多種涉及核酸的生物合成的化合物或任何這樣的化合物的一種或多種衍生物組成的組中的產(chǎn)率增加劑的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)微生物；以及iii)獲得所述由微生物產(chǎn)生的化合物，其中，與在相同介質(zhì)中當(dāng)沒有可測量的產(chǎn)率增加劑條件下培養(yǎng)微生物的情況相t匕，產(chǎn)率增加劑導(dǎo)致了由微生物產(chǎn)生的化合物的產(chǎn)率的增加。由所述的微生物產(chǎn)生的化合物包括但不限于酶、蛋白質(zhì)、代謝物、糖脂類、抗生素、細(xì)菌素、氨基酸、味素、揮發(fā)物。這些化合物可通過重組DNA技術(shù)或其它傳統(tǒng)方法生產(chǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步通過以下的非限制性實施例和附圖加以說明。實施例實施例I :在三種不同類型的培養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)率為了說明向已經(jīng)富集的并優(yōu)化的介質(zhì)中加入額外的含嘌呤的化合物的作用，比較了三種類型的工業(yè)級規(guī)模的培養(yǎng)物。所有的三種類型的培養(yǎng)物菌株營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行通氣培育，在該介質(zhì)中，至少有一種卟啉化合物存在，或如在國際專利申請WO 00/05342 (EMIL方法)那樣被添加，并且，在所有的情況下，這種培養(yǎng)物是所謂的“0-培養(yǎng)物”，其包含乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp. lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)。0-培養(yǎng)物通常被用于制作無孔奶酪(Cheddar, Cheshire, Feta)。具體的培養(yǎng)物可通過商業(yè)渠道獲得，商品名為 R 604,由 Hansen A/S, Hoersholm, Denmark (目錄號:200113)提供。三種介質(zhì)不于表I中。
基拙培養(yǎng) 指定的培養(yǎng)物加入的酶提取物其它添加物
介質(zhì)
^舊的EMIL1.7 %w/w標(biāo)準(zhǔn)酵母提
BD-5-ex3*
(Old EMIL)取物林
~新的EMIL1.7 %w/w新的酵母■!是
BD-5-ex3*
(NewEMIL)取物 **
~超級 EMIL1.7 %w/w 新的酵母提 0.2 %w/w IMP***
BD-5-ex3*
(Super EMIL)取物林0.2 %w/w 肌苷 00*BD-5-ex3是根據(jù)WO 00/05342和WO 01/52668的優(yōu)化的含卟啉的培養(yǎng)介質(zhì)。#標(biāo)準(zhǔn)酵母提取物和新的酵母提取物是兩種可通過商業(yè)渠道獲得的酵母提取物。***IMP 是肌苷-5'-單磷酸(IMP) (Alsiano A/S, Birkeroed, DK)。00 月幾苷是肌苷(Alsiano A/S, Birkeroed, DK)。培養(yǎng)過程是在550L或10，000L的工業(yè)發(fā)酵槽中在30°C下，使用0. 5% (w/w)的上述作為接種體的培養(yǎng)物進(jìn)行的。發(fā)酵是按WO 00/05342中所描述那樣在有氧條件下進(jìn)行。發(fā)酵物可酸化到pH為6. 2。然后，通過可控地添加13. 4N NH4OH而將pH維持在6. 2。當(dāng)沒有進(jìn)一步的堿的消耗被檢測出時，冷卻相應(yīng)的培養(yǎng)物到約10°C。冷卻后，培養(yǎng)介質(zhì)中的細(xì)菌通過離心被濃縮到6-18倍，然后在液氮中I個大氣壓下冷凍成小球，制成所謂的冷凍直投式培養(yǎng)物(F-DVS)。F-DVS小球被儲存在_50°C待進(jìn)一步分析。通過兩種不同方式來確定發(fā)酵的產(chǎn)率，I)通過以在600nm測量的光學(xué)密度(0D_)表示的獲得的生物質(zhì)量，或者2)通過在實施例2 :分析過程QAm-043中描述的Pearce測試中的具有“酸化活性”為4. 8-5. I的F-DVS培養(yǎng)物的kg數(shù)。結(jié)果示于下表2中。表2.以0D_測量的發(fā)酵產(chǎn)率
權(quán)利要求
1.通氣和高光學(xué)密度條件下發(fā)酵，獲得增加產(chǎn)率的乳酸菌培養(yǎng)物的方法，該方法包括以下步驟 i)在培養(yǎng)介質(zhì)中于一定條件下培育乳酸菌，使得發(fā)酵進(jìn)行到在600nm測定的光學(xué)密度(OD6J為10，其中所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少一種卟啉化合物和至少一種產(chǎn)率增加劑，所述產(chǎn)率增加劑選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸和它們的衍生物組成的組，其濃度為確保在發(fā)酵結(jié)束時培養(yǎng)介質(zhì)含有至少I U M的所述至少一種產(chǎn)率增加劑，其中所述衍生物選自5-甲基胞嘧啶CfeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤；以及 ii)收集所述乳酸菌以獲得乳酸菌培養(yǎng)物， 其中，與在相同條件下和在含有少于IuM的各產(chǎn)率增加劑的相似介質(zhì)中來培養(yǎng)微生物相比，在發(fā)酵結(jié)束時產(chǎn)率增加劑增加了收集到的乳酸菌的產(chǎn)率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)最初含有至少ImM的至少一種產(chǎn)率增加劑，其選自由一種或多種用于核酸的生物合成中的化合物或者由任何這樣的化合物的一種或多種衍生物所組成的組，其中所述衍生物選自5-甲基胞嘧啶(sfeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
3.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)是復(fù)合物發(fā)酵介質(zhì)，向每升該介質(zhì)中加入至少0. 2g的至少一種產(chǎn)率增加劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述至少一種產(chǎn)率增加劑是在發(fā)酵過程中加入的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述高光學(xué)密度的條件的特征是在發(fā)酵結(jié)束時0D_聞于15。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述產(chǎn)率增加至少I.2倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述產(chǎn)率增加劑是嘌呤堿基，該嘌呤堿基選自由腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述產(chǎn)率增加劑是嘧啶堿基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，所述嘧啶堿基是選自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求I的方法,其中,所述產(chǎn)率增加劑是核苷。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，所述核苷是選自由腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧胞苷和脫氧肌苷組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中，所述核苷是選自由腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷和肌苷組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中，所述核苷是肌苷。
14.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述產(chǎn)率增加劑是核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述核苷酸是選自由腺苷單磷酸(AMP)、鳥苷單磷酸(GMP)、尿苷單磷酸(UMP)、胞苷單磷酸(CMP)、黃嘌呤單磷酸(XMP)、肌苷單磷酸(IMP)、脫氧腺苷單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷單磷酸(dGMP)、脫氧胸苷單磷酸(dTMP)、脫氧胞苷單磷酸(dCMP)、脫氧黃嘌呤單磷酸(dXMP)和脫氧肌苷單磷酸(dIMP)組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中，所述核苷酸是選自由AMP、GMP、UMP、CMP、XMP和IMP組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中，所述核苷酸是IMP。
18.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少兩種產(chǎn)率增加劑，選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸和它們的衍生物組成的組，其中所述衍生物選自5-甲基胞嘧啶CfeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)包含至少兩種產(chǎn)率增加劑，選自由核苷和核苷酸組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中，所述核苷是肌苷，所述核苷酸是IMP。
21.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含l_70mM的各產(chǎn)率增加劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含l_60mM的各產(chǎn)率增加劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含I.3-60mM的各產(chǎn)率增加劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含I.5-50mM的各產(chǎn)率增加劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含2-40mM的各產(chǎn)率增加劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含2.5-30mM的各產(chǎn)率增加劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含3-20mM的各產(chǎn)率增加劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含3-15mM的各產(chǎn)率增加劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含4-10mM的各產(chǎn)率增加劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)介質(zhì)起始包含7mM的各產(chǎn)率增加劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)介質(zhì)的OD_達(dá)到一光學(xué)密度為OD_=10-0D_=200。
32.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)介質(zhì)的OD_達(dá)到一光學(xué)密度為OD_= 15-OD_=100。
33.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)介質(zhì)的OD_達(dá)到一光學(xué)密度為OD_= 20-0D_=80。
34.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)過程是在含有5L-100，000L的培養(yǎng)介質(zhì)的大式發(fā)酵器中進(jìn)行。
35.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)過程是在含有300L-20，000L的培養(yǎng)介質(zhì)的大式發(fā)酵器中進(jìn)行。
36.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)過程包括控制溫度和/或pH。
37.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包括一種或多種有機(jī)物，選自由雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸菌屬、包括乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種的乳球菌屬、包括嗜酸乳桿菌的乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳酸片球菌屬、明串珠菌屬和酒球菌屬組成的組。
38.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包含一種或多種具有最適宜的生長溫度在30°C的嗜溫有機(jī)物。
39.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包含一種或多種選自由乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌乳脂亞種、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種、干酪乳桿菌干酪亞種和副干酪乳桿菌副干酪亞種組成的組中的嗜溫有機(jī)物。
40.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包含一種或多種具有最適宜的生長溫度在40 V到45 V的嗜熱有機(jī)物。
41.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包含一種或多種選自由嗜熱鏈球菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌乳酸亞種、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸性乳桿菌組成的組中的嗜熱有機(jī)物。
42.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物是LD-培養(yǎng)物，其包含一種或多種選自由乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰乳酸生物變種和腸膜明串珠菌乳脂亞種組成的組中的有機(jī)物。
43.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物是O-培養(yǎng)物，其包含一種或多種選自由乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種組成的組中的有機(jī)物。
44.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中，培養(yǎng)物包含乳酸乳球菌。
45.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，所述方法進(jìn)一步還包括 iii)冷凍所述收集的微生物以獲得冷凍的微生物細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，所述方法進(jìn)一步還包括 iv)從所述冷凍的細(xì)胞中使水分升華以獲得凍干的細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46的方法，所述方法進(jìn)一步還包括 V)包裝由上述步驟iii)或iv)中獲得的細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求44-46中任意一項的方法，其中，向收集的微生物中加入至少一種冷凍保護(hù)劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中，向收集的微生物中加入至少一種冷凍保護(hù)劑。
50.一種培養(yǎng)介質(zhì)，其包含至少一種產(chǎn)率增加劑和至少一種卟啉化合物，所述產(chǎn)率增加劑選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸以及它們的衍生物組成的組。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的培養(yǎng)介質(zhì)，其中，所述介質(zhì)如權(quán)利要求I所定義。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化合物在生物合成核酸以增加細(xì)菌培養(yǎng)物的產(chǎn)率中的應(yīng)用。微生物引子培養(yǎng)物。更具體的，制備微生物發(fā)酵劑培養(yǎng)物的方法，其中，微生物在包含至少一種產(chǎn)率增加劑的培養(yǎng)介質(zhì)中被接種，該產(chǎn)率增加劑是選自由嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸以及它們的衍生物組成的組。該微生物引子培養(yǎng)物可用于生產(chǎn)食物制品、飼料制品和醫(yī)藥制品。
文檔編號C12N1/38GK102747026SQ201210207738
公開日2012年10月24日 申請日期2006年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者克里斯蒂·加里格斯, 尼爾斯·馬丁·索羅森, 羅格·溫德爾·克林格拉姆, 蘇珊娜·格恩, 馬丁·B.·皮德森 申請人:科·漢森有限公司