專利名稱：高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物領域，特別涉及高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法。
背景技術：
纖維素是植物細胞壁的主要成分，約占植物干重的1/3 1/2，是地球上分布最廣、含量最豐富、生成量最高的有機化合物，是自然界中數量最大的可再生資源，纖維素的利用與轉化對于解決目前世界能源危機、糧食短缺和環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。纖維素降解主要有酸降解和酶降解，酸降解需要一定的壓力和溫度，對設備的要求較高，生產過程會產生大量的廢棄物，難于達到環(huán)保的要求。酶降解反應條件溫和，是纖 維素利用與轉化的發(fā)展目標。纖維素酶的來源廣泛，廣泛存在于自然界的生物體中，細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。研究表明，細菌產生的纖維素酶的量較低，主要是葡聚糖內切酶，少數細菌能分泌外切葡聚糖酶，而且這些酶主要是胞內酶或是附于細胞壁上，很少能分泌到細胞外，增加了提純的難度，在工業(yè)上很少采用。放線菌中的分枝桿菌和原放線菌幾乎不產纖維素酶或產量極低，產量稍高的主要是黑紅旋絲放線菌、玫瑰色放線菌和纖維放線菌，但在工業(yè)上仍難以應用。用于生產的纖維素酶一般來自于霉菌，比較典型的有木霉屬、曲霉屬和青霉屬。綠色木霉及其近緣菌株等較為典型，是目前公認的較好的纖維素酶生產菌。木霉菌株具有產酶量大和酶系比較齊全等優(yōu)點，但它們卻不能利用木質素，其纖維素酶比活力及￠-葡萄糖苷酶活力不太高，并且生產較緩慢。鑒于酵母生長快、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢，近年來不斷有研究采用生物技術通過重組基因工程菌的方法獲得了一些產纖維素酶的酵母菌株。酵母菌菌株生產纖維素酶的重要研究意義在于，利用產纖維素酶的酵母菌轉化纖維素類物質生產單細胞蛋白比其他有用產物要比細菌和絲狀真菌更有優(yōu)勢，特別是酵母菌可以直接利用纖維素生產酒精，這一潛在用途使其極具研究價值。如文獻報道了從康氏木霉TK-4-775菌株中克隆到cbhl基因，并在畢赤酵母中成功實現cbhl的分泌型活性表達，但酶活為僅為24. 1U/L (康氏木霉纖維素酶CBHI基因克隆及在畢赤酵母中的表達研究.釀酒科技.2011年第I期)。雖然這種利用重組基因工程菌的方法獲得產纖維素酶的酵母菌有較大的應用潛力，但菌株的遺傳性能往往不太穩(wěn)定，且其安全性如果應用于食品、動物飼料等領域則還需進一步進行評估才能用于生產。非人工轉基因的酵母產纖維素酶在遺傳性能和安全性上更有優(yōu)勢，但目前研究結果表明一般的酵母菌很少產纖維素酶或不產酶，國外有報道篩選出了關來自于熱帶植物葉面酵母菌菌株產生纖維素酶，但酶活較低。國內最近報道了從來自于海洋環(huán)境的酵母菌種庫中篩選得到了能產纖維素酶的酵母菌(一株產纖維素酶海洋酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化.中國海洋大學學報.2007年12月增刊II)，報道并對其產酶培養(yǎng)基做了優(yōu)化，其最終纖維素酶產葡聚糖內切酶(CMCase)活達到4. 51U/mg,濾紙酶活達到4. 75U/mg，酶活較低。因此，提供一種高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法具有現實意義。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明提供高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法。該高產纖維素酶的酵母菌株的保藏編號為CGMCC No. 6057，該酵母菌株易培養(yǎng)，生產安全性高，遺傳穩(wěn)定性較好，其代謝產物纖維素酶容易分離純化，且其代謝產物纖維素酶的酶活較高。為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案本發(fā)明提供了一種高產纖維素酶的酵母菌株，其保藏編號為CGMCC No. 6057。本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株為東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)已于2012年04月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)進行保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6057。海南島盛產一種以椰子水作為生產培養(yǎng)基的發(fā)酵產品“椰纖果”(俗稱“椰果”或“高纖椰果”)，這種發(fā)酵產物主要成分是細菌纖維素(Bacterial cellulose, BC)，纖維素通常占干重的95%以上。由于采用淺盤靜置發(fā)酵，最終的發(fā)酵得到的細菌纖維素具有一定厚度，呈白色凝膠狀。細菌纖維素的結構與植物纖維素的結構一致，同屬于天然纖維素，其分子結構上與天然(植物)纖維素相同，均是D-葡萄糖之間以P -1，4糖苷鍵聚合而成，細菌纖維素與植物纖維素的主要區(qū)別在于無木質素、果膠和半纖維素等伴生產物，具有高結晶度(可達95%，植物纖維素的為65%)，以及高的聚合度(DP值2000 8000)。從分子結構和纖維素酶催化水解纖維素的機理來看，能夠降解植物纖維素的纖維素酶也能夠降解細菌纖維素，但目前這方面的研究較少報道。目前細菌纖維素主要的規(guī)模化生產方式是淺盤培養(yǎng)，這種發(fā)酵方式是在一個相對潔凈的發(fā)酵房內擺放相當數量的淺盤，在淺盤中裝入經滅菌的培養(yǎng)基，然后接入能產纖維素的木醋桿菌菌種，經靜置發(fā)酵后，塊狀的纖維素凝膠就在淺盤中產生，這種發(fā)酵方式導致在發(fā)酵生產的過程中特別容易遭受污染，通常是微生物污染，導致細菌纖維素發(fā)酵失敗。在研究細菌纖維素生產過程中的污染發(fā)現，有些淺盤由于在發(fā)酵過程中被污染，導致細菌纖維素凝膠膜不能形成，但有些淺盤中，發(fā)酵開始的2-3天內形成了一定厚度的纖維素凝膠膜，隨著培養(yǎng)時間的延長，這層纖維素膜并沒有像正常的淺盤內會越來越厚，最終會“消失”或“部分消失”，消失的部分似乎被“溶解”，不再呈現完整的纖維素膜。結果表明，被污染的細菌纖維素凝膠膜被降解了，或者說纖維素被降解成了小分子的物質。本發(fā)明發(fā)現，這是由于某些能夠污染“細菌纖維素凝膠”的微生物產生了一些可以降解纖維素的物質，而且這種降解高效，推測有纖維素酶的參與。更深入的研究發(fā)現能夠降解“椰果”的微生物有三類較為普通的兩類為霉菌和細菌，這兩類微生物能夠產纖維酶已有較多的報道和研究，另外一類為酵母菌，鮮有報導。本發(fā)明發(fā)現，獲得的酵母菌不僅能夠產纖維素酶，而且纖維素酶的活性更高，能更有效率的降解細菌纖維素凝膠膜。通常如果在淺盤中培養(yǎng)的細菌纖維素凝膠上污染了霉菌或細菌，一般不會完全降解纖維素凝膠膜，僅有局部少量的纖維素凝膠被降解。而在細菌纖維素凝膠的淺盤生產中如果污染了本發(fā)明提供的能降解纖維素的酵母菌，大面積甚至是整片凝膠膜都完全被降解。因此，本發(fā)明提供了上述高產纖維素酶的酵母菌株，其保藏編號為CGMCC No. 6057。本發(fā)明還提供了一種保藏編號為CGMCC No. 6057的高產纖維素酶的酵母菌株的篩選方法，包括如下步驟步驟I :淺盤發(fā)酵生產纖維素凝膠，選取降解的纖維素凝膠，收集降解的纖維素凝膠中降解部分的培養(yǎng)液；步驟2 :取培養(yǎng)液于培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得第二培養(yǎng)液，純化、鑒定即得。作為優(yōu)選,培養(yǎng)基的配制方法為I 5g白砂糖或果葡糖衆(zhòng)作為碳源,0. 05 0. Ig硫酸銨或尿素作為氮源，用100 150mL的椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5 6. 5，殺菌。作為優(yōu)選，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為20 30mg/100mL，維生素C含量為4 6mg/100mL。作為優(yōu)選，殺菌具體為于100°C殺菌5 15min。作為優(yōu)選，純化具體為取所述第二培養(yǎng)液接種到固體培養(yǎng)基中經平板涂布法分離，挑取菌落，即得。作為優(yōu)選，固體培養(yǎng)基的配制方法為取I 5g白砂糖或果葡糖漿作為碳源，
0.05 0. Ig硫酸銨或尿素作為氮源，瓊脂I 2g，用100 150mL的椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5 6,于121°C殺菌3 5min。作為優(yōu)選，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為20 30mg/100mL，維生素C含量為4 6mg/100mL。作為優(yōu)選，鑒定包括生理生化檢驗、16sRNA鑒定。作為優(yōu)選，鑒定還包括挑取菌落接種于纖維素凝膠培養(yǎng)，檢測纖維素凝膠是否降解。具體地，高產纖維素酶酵母的篩選采用下述方法進行采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 V 35°C，培養(yǎng)時間為2天飛天。上述液體培養(yǎng)基配方為1克飛克白砂糖或果葡糖漿作為碳源，0. 05克I克硫酸銨或尿素作為氮源，用100ml-150ml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5-6. 5。培養(yǎng)基采用100°C殺菌5分鐘 15分鐘。分離由于采樣中的微生物種類較多，將上述培養(yǎng)液中的微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為1克飛克白砂糖或果葡糖漿作為碳源，0. 05克I克硫酸銨或尿素作為氮源，瓊脂I克-2克，用 100ml-150ml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5飛.5。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘 5分鐘。篩選將步驟3中挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cnT0. 5cm時，將步驟3中編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天天，培養(yǎng)溫度25°C 35°C，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。
再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌住與標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏，斜面培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基。本發(fā)明提供高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法。該高產纖維素酶的酵母菌株的保藏編號為CGMCC No. 6057，該酵母菌株易培養(yǎng)，生產安全性高，遺傳穩(wěn)定性較好，其代謝產物纖維素酶容易分離純化，且其代謝產物纖維素酶的酶活較高，具有較高的應用價值。本發(fā)明還提供了一種產纖維素酶的酵母菌株的篩選方法，通過從采用淺盤發(fā)酵生產方式的細菌纖維素凝膠中，對被微生物污染并發(fā)生降解的纖維素凝膠中進行采樣，然后分離純化出可以產纖維素酶的酵母菌株。生物保藏說明高產纖維素酶的酵母菌株，分類命名為東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis),于2012年04月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，保藏編號為CGMCC No. 6057。


圖I示葡萄糖標準曲線；其中橫坐標為葡萄糖濃度，單位為mg/mL ;縱坐標為OD值；標準曲線方程為 y=0. 253x+0. 0989，R2=O. 9993 ；圖2示本發(fā)明提供的高產纖維素酵母菌株CMCA酶活力測定結果；其中，橫坐標為實驗組，從左至右分別為實施例I至6提供的酵母菌株，縱坐標為酶活，單位為ymol/(mL min);從左至右酶活分別為 70. 9,80. 05,71. 40,70. 9,72. 21,74. 50 ；圖3示本發(fā)明提供的高產纖維素酵母菌株FPA酶活力測定結果；其中，橫坐標為實驗組，從左至右分別為實施例I至6提供的酵母菌株，縱坐標為酶活，單位為U mol/(mL min);酶活分別為 37. 23,39. 75,45. 94,41. 63,46. 75,40. 98 ；圖4示本發(fā)明提供的高產纖維素酵母菌株顯微鏡圖。
具體實施例方式本發(fā)明公開了高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明實施例I采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 V，培養(yǎng)時間為5天。上述液體培養(yǎng)基配方為2克白砂糖作為碳源，0. 05克尿素作為氮源，用IOOml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至5. 5。培養(yǎng)基采用100°C殺菌5分鐘。分離將微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為瓊脂2克，其他成分同步驟2中的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘。篩選將挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天天，培養(yǎng)溫度30°C，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的 酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏備用。其中，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為 20 30mg/100mL，維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。實施例2采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35 V，培養(yǎng)時間為2天。上述液體培養(yǎng)基配方為5克果葡糖漿作為碳源，0. I克硫酸銨或尿素作為氮源，用150ml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)PH值至5. O。培養(yǎng)基采用100°C殺菌10分鐘。分離由于采樣中的微生物種類較多，將上述培養(yǎng)液中的微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為瓊脂2克，其他成分同步驟2中的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘。培養(yǎng)基采用121°C殺菌5分鐘。篩選將挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天，培養(yǎng)溫度常溫，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏，斜面培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基。其中，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為 20 30mg/100mL，維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。實施例3采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時間為3天。上述液體培養(yǎng)基配方為5克白砂糖作為碳源，0. I克硫酸銨作為氮源，用150ml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至5. O。培養(yǎng)基采用100°C殺菌5分鐘。分離由于采樣中的微生物種類較多，將上述培養(yǎng)液中的微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為瓊脂1.5克，其他成分同步驟2中的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘。培養(yǎng)基采用121°C殺菌5分鐘。篩選將中挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 5cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度常溫，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。·再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏，斜面培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基。其中，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為 20 30mg/100mL，維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。實施例4采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時間為5天。上述液體培養(yǎng)基配方為1克白砂糖作為碳源，0. 08克尿素作為氮源，用IOOml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)PH值至4. 5。培養(yǎng)基采用100°C殺菌15分鐘。分離將微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為瓊脂I克，其他成分同步驟2中的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘。篩選將挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天天，培養(yǎng)溫度25°C，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏備用。其中，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為 20 30mg/100mL，維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。實施例5
采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。培養(yǎng)將采樣的濾紙放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為5天。上述液體培養(yǎng)基配方為4克白砂糖作為碳源，0. 09克尿素作為氮源，用150ml的新鮮椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至6. 5。培養(yǎng)基采用100°C殺菌15分鐘。分離將微生物采用平板涂布法進行分離，對酵母菌落進行編號備用。平板涂布法采用的固體培養(yǎng)基為配方為瓊脂I克，其他成分同步驟2中的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用121°C殺菌3分鐘。篩選將挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天天，培養(yǎng)溫度35°C，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。保藏將篩選出的產纖維素酶的酵母菌用試管斜面法進行保藏備用。其中，椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%，還原糖含量為1%_1. 5%，鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為 20 30mg/100mL，維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。實施例6采樣在采用淺盤發(fā)酵生產細菌纖維素凝膠的椰果廠中取樣，挑選那些被微生物污染而造成降解的纖維素凝膠膜，用滅過菌的濾紙條沾取污染區(qū)域的培養(yǎng)液，放入無菌的空試管中，塞上棉花塞備用。一次平板劃線分離融化培養(yǎng)基將麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化。 倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，按無菌操作法倒4只平板(每皿約15ml)，平置，待凝固。倒平板的方法右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。作分區(qū)標記在皿底將整個平板劃分成A、B、C、D四個面積不等的區(qū)域。各區(qū)之間的交角應為120°C左右(平板轉動一定角度約60°C)，以便充分利用整個平板的面積，而且采用這種分區(qū)法可使D區(qū)與A區(qū)劃出的線條相平行，并可避免此兩區(qū)線條相接觸。劃線操作挑取樣品選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無菌操作法挑取少量菌種。劃A區(qū)將平板倒置于煤氣(酒精)燈旁，左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養(yǎng)基一面向著煤氣燈(這時皿蓋朝上，仍留在煤氣燈旁)，右手拿接種環(huán)先在A區(qū)劃3— 4條連續(xù)的平行線(線條多少應依挑菌量的多少面定)。劃完A區(qū)后應立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過多而影響后面各區(qū)的分離效果。在燒接種環(huán)時，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的污染。劃其他區(qū)將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使B區(qū)轉到上方，接種環(huán)通過A區(qū)(菌源區(qū))將菌帶到B區(qū)，隨即劃數條致密的平行線。再從B區(qū)作C區(qū)的劃線。最后經C區(qū)作D區(qū)的劃線，D區(qū)的線條應與A區(qū)平行，但劃D區(qū)時切勿重新接觸A、B區(qū)，以免極該兩區(qū)中濃密的菌液帶到D區(qū)，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。恒溫培養(yǎng)將劃線平板倒置，于37°C培養(yǎng)2-3天后觀察。
二次平板劃線分離待一次平板分離各菌株長成后，選取酵母菌株進行二次平板劃線分離，操作同上。菌種涂布稀釋分離純化用滅菌好的固體培養(yǎng)基在電磁爐的鐵鍋中水浴加熱至融化，冷卻到大約50°C左右，于無菌操作室中進行操作。倒大概15-20毫升培養(yǎng)基于已滅菌好的平板內并搖勻，待平板冷卻后，用接種環(huán)挑取二次平板劃線分離所得酵母菌種放入滅菌好的第一根9ml放有無菌水的試管中搖勻，然后吸取Iml的菌液轉移到第二根試管中，依次操作直至稀釋五個數量級為止，每個數量級使用一支移液管，然后分別用無菌的移液管從相對應試管菌液中吸取0. 3ml滴到相應平板培養(yǎng)基上，再用滅菌的涂棒進行涂勻。蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置，放于37 °C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。將挑選出的酵母菌落進行篩選，挑選出能產纖維素酶的酵母菌。方法如下在若干個廣口的玻璃瓶中培養(yǎng)細菌纖維素凝膠，培養(yǎng)至凝膠厚度0. 2cm時，將編號的酵母菌用接種環(huán)接入纖維素凝膠表面，培養(yǎng)I天天，培養(yǎng)溫度35 °C，觀察細菌纖維素凝膠表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的則為產纖維素酶的酵母。再經生理生化試驗鑒定為酵母菌。經16sRNA鑒定，本發(fā)明提供的高產纖維素酶的酵母菌株與東方伊薩酵母標準株的同源性為99. 0%。實施例7實驗組取實施例I至6提供的酵母菌株，備用。對照組取纖維素酶(來源于綠色木霉)，進口分裝，購自海南青鳥生物科技有限公司。斜面菌種的活化當平板上的酵母菌有菌落長出時，在無菌操作室中將菌株接種到麥芽汁斜面固體培養(yǎng)基上，于37°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，待有菌落長出時保存于4°C冰箱中備用。菌株培養(yǎng)菌種一代發(fā)酵培養(yǎng)將不同樣液所得的酵母菌分別挑取兩環(huán)，接種到裝有50ml YH)液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在28°C，180r/min振蕩搖床下，培養(yǎng)48h，作為種子液。菌種二代產酶培養(yǎng)將一代發(fā)酵培養(yǎng)所得的種子液接種到含50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中再次進行搖瓶發(fā)酵，在28°C，160r/min振蕩搖床下，培養(yǎng)24h，獲得二代產酶培養(yǎng)液。離心分離
取IOmL菌種二代產酶培養(yǎng)液，用高速離心機以5000r/min離心20min，離心完成后收集上清液，在0 4°C下保存，所得上清液作為酶液進行酶活測定。還原糖測定方法取上清液，按照Miller的方法，使用DNS試劑，通過測定540nm波長下的光吸收值來確定還原糖的含量，并以葡萄糖為標準來表示。纖維素酶活力測定方法采用Mandels等的測定方法濾紙酶活(FilterPaper Activity,簡稱 FPA)
取25ml的刻度試管，加入經稀釋的0. 5ml酶液和I. 5ml相應ph的緩沖液，并加入一條lcmX6cm的濾紙，50°C下保溫lh。用DNS試劑測定所形成的還原糖量，并扣去空白。其酶活力單位用國際單位(I y mol/(min ml))來表示。羧甲基纖維素(還原糖法)酶活力(CMCA-DNS)測定方法取25ml的刻度試管，加入經適當稀釋的酶液0. 5mL和ImL質量分數為1%的CMC-Na緩沖溶液，50°C保溫30min。將酶液置于沸水浴中滅活5min作為對照組。用DNS試劑來測定所形成的還原糖量，并扣去空白。其酶活力單位用國際單位(I u mol/(min -mL))來表示。纖維素酶酶活力單位的定義在酶的催化下，每分鐘形成Iumol葡萄糖時所用該酶的量為I個酶活國際單位(I U mol/(min mL))。葡萄糖標準曲線的制作用不同濃度的葡萄糖溶液作為標準溶液，與DNS共熱反應顯色后，測出其吸光度OD值，結果如圖I所示。從圖I可知，標準曲線y=0. 253x+0. 0989，線性相關系數R2為
0.9993，線性相當好，可以用于酶活力的測定。酶活力測定結果CMCA酶活力測定結果對篩選出13株酵母上述方法進行產酶培養(yǎng)后，離心分離后測定其上清夜CMCA酶活力，結果發(fā)現各株酵母培養(yǎng)液均有一定CMCA酶活。FPA酶活力的測定結果對篩選出13株酵母上述方法進行產酶培養(yǎng)后，離心分離后測定其上清液FPA酶活力，結果發(fā)現各株酵母培養(yǎng)液均有一定FPA酶活，如圖3所示。本發(fā)明提供的酵母菌株實驗組在產酶培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，測定的CMCA酶活達74. 6 u mol/ml. min)，FPA濾紙酶活達46. 7 u mol/ (ml. min)，離心后的清液干物重為4%,如按干重計算 CMCA 酶活達 1865 u mol/ (ml. min), FPA 濾紙酶活達 1167. 5 u mol/ (ml. min)。而對照組來自于木霉的酶制劑，CMCA酶活在1200-1800 u mol/(ml. min)，FPA濾紙酶活在300-600 u mol/ (ml. min)左右。相對于對照組的酶制劑來說，本發(fā)明提供的保藏編號為CGMCC No. 6057的酵母菌株具有顯著的高產纖維素酶的特點，試驗組中的酵母菌株經產酶培養(yǎng)后的培養(yǎng)液具有的酶活力都顯著高于對照組的商品化酶制劑，可想而知，本發(fā)明提供的酵母菌株經產酶培養(yǎng)后的培養(yǎng)液經濃縮后(濃縮倍數與對照組商品化酶制劑濃縮倍數相同)制得酶制劑極顯著高于對照組商品化的酶制劑的酶活。試驗結果表明，本發(fā)明提供的酵母菌株經產酶培養(yǎng)后的培養(yǎng)液經濃縮后(濃縮倍數與對照組商品化酶制劑濃縮倍數相同)制得酶制劑極顯著高于對照組商品化的酶制劑的酶活(P ( 0.01)。綜合上述分析，本發(fā)明實施例I至6提供的酵母菌能大量地產生纖維素酶，而且具 有較高的酶活力。酵母菌安全性高，而且具有酶的外分泌性和產酶量高的特點，全面系統(tǒng)地收集分離產酶酵母，建立產酶酵母種質資源庫，對研究酵母菌及其它微生物的產纖維素酶機理、酶的修飾、酶的結構與組成、產酶基因及克隆、直至生產應用等都有重要的意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種高產纖維素酶的酵母菌株，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No. 6057。
2.一種保藏編號為CGMCC No. 6057的高產纖維素酶的酵母菌株的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :淺盤發(fā)酵生產纖維素凝膠，選取降解的纖維素凝膠，收集所述降解的纖維素凝膠中降解部分的培養(yǎng)液； 步驟2 :取所述培養(yǎng)液于培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得第二培養(yǎng)液，純化、鑒定即得。
3.根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配制方法為I 5g白砂糖或果葡糖衆(zhòng)作為碳源，0. 05 0. Ig硫酸銨或尿素作為氮源,用100 150mL的椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5 6. 5，殺菌。
4.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述椰子水中總固形物含量為3. 8% 4. 2%,還原糖含量為1%_1. 5%,鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為20 30mg/IOOmL,維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。
5.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述殺菌具體為于10(TC殺菌5 15min。
6.根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述純化具體為取所述第二培養(yǎng)液接種到固體培養(yǎng)基中經平板涂布法分離，挑取菌落，即得。
7.根據權利要求6所述的篩選方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基的配制方法為取I 5g白砂糖或果葡糖衆(zhòng)作為碳源，0. 05 0. Ig硫酸銨或尿素作為氮源,瓊脂I 2g,用100 150mL的椰子水進行溶解，調節(jié)pH值至4. 5 6，于121°C殺菌3 5min。
8.根據權利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述椰子水中總固形物含量為3.8% 4. 2%,還原糖含量為1%_1. 5%,鉀含量為300 400mg/100mL，鈣含量為20 30mg/100mL,維生素 C 含量為 4 6mg/100mL。
9.根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述鑒定包括生理生化檢驗、16sRNA鑒定。
10.根據權利要求9所述的篩選方法，其特征在于，所述鑒定還包括挑取所述菌落接種于纖維素凝膠培養(yǎng)，檢測所述纖維素凝膠是否降解。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領域，特別涉及高產纖維素酶的酵母菌株及其篩選方法。該高產纖維素酶的酵母菌株的保藏編號為CGMCC No.6057，該酵母菌株易培養(yǎng)，生產安全性高，遺傳穩(wěn)定性較好，其代謝產物纖維素酶容易分離純化，且其代謝產物纖維素酶的酶活較高，具有較高的應用價值。本發(fā)明還提供了一種產纖維素酶的酵母菌株的篩選方法，通過從采用淺盤發(fā)酵生產方式的細菌纖維素凝膠中，對被微生物污染并發(fā)生降解的纖維素凝膠中進行采樣，然后分離純化出可以產纖維素酶的酵母菌株。
文檔編號C12Q1/04GK102703337SQ20121018938
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者馮愛國, 向東, 李斌, 王志國, 王錫彬, 鐘春燕 申請人:海南光宇生物科技有限公司, 海南大學