專利名稱：一種新布尼亞病毒np蛋白的編碼序列及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領域，具體涉及一種新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列及其應用。
背景技術(shù)：
新布尼亞病毒(Novel Bunyavirus, SFTS Bunyavirus),是發(fā)熱伴血小板減少綜合癥(Fever with Throbocytopenia Associated Syndrome, SFTS)的病原，為布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬的一種新型病毒，于2009年在中國首先發(fā)現(xiàn)。患者出現(xiàn)以發(fā)熱、血小板減少、多器官功能紊亂等為特征的嚴重急性傳染病。到目前為止，全國已有河南、江蘇、湖北和遼寧等16個省發(fā)現(xiàn)1000多病例，造成50余人死亡。國家疾控中心已經(jīng)成功的分離到該病病毒，并對其進行了病原學和臨床醫(yī)學等研究。目前該病毒序列已經(jīng)闡明，病毒蛋白已經(jīng)鑒定,nucleocapsid protein (NP)蛋白約占病毒總蛋白90%,為鑒定病原最敏感的病毒抗原。但是研究發(fā)現(xiàn)從病毒直接分離NP蛋白成本高，且有潛在風險。使用源于病毒的編碼序列直接構(gòu)建大腸桿菌重組蛋白表達系統(tǒng)表達效率低下，難以低成本獲得高純度重組NP蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列及其應用。本發(fā)明提出的依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列，為SEQ ID No. I所示。本發(fā)明提出的所述新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列的應用，是將上述新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列克隆到pQE表達質(zhì)粒(Qiagen，德國)，轉(zhuǎn)化E Coli. M15菌株(Qiagen,德國),常規(guī)培養(yǎng),誘導表達，Hitrap (Amersham Pharmacia,美國)純化，即可以得到高產(chǎn)量、高純度新布亞病毒重組NP蛋白。本發(fā)明涉及一種依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列以及應用，具體就是制備重組新布尼亞病毒NP蛋白的方法，其步驟為
1)依據(jù)EColi.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計以及合成的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列；
2)密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列克隆到大腸桿菌表達質(zhì)粒PQE30,制備pQE30-rNP重組質(zhì)粒，其DNA為SEQ ID No. 2所示；編碼的重組NP蛋白氨基酸序列為SEQ ID No. 3所示；
3)pQE30-rNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E Coli. M15菌；
4)常規(guī)培養(yǎng)誘導重組蛋白表達；以及
5)使用Hitrap純化重組新布尼亞病毒NP蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點在于使用依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列來制備表達質(zhì)粒，進一步進行誘導表達純化來制備重組新布尼亞病毒NP蛋白。與傳統(tǒng)病毒源性蛋白制備比較，后續(xù)純化制備工藝簡單，有更大的安全性；與使用病毒源性編碼序列比較，在細菌重組蛋白表達水平高，純化效率高。密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列生產(chǎn)重組蛋白成本較低，更容易工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I:合成密碼子優(yōu)化NP蛋白編碼序列測序圖。圖2 pQE30-rNP重組質(zhì)粒測序圖。其中，劃線部分為PQE30質(zhì)粒骨架序列，其他部分為密碼子優(yōu)化的NP蛋白編碼序列；開放讀框為796到23，其中796-760位pQE30骨架編碼，其余部分插入的合成密碼子優(yōu)化NP蛋白編碼序列。 圖3 :使用依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列表達純化新布尼亞病毒NP蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。本實施例僅僅用于對本發(fā)明的說明，不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例I :依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列制備
依據(jù)Genbank公布的新布尼亞病毒NP蛋白序列(Genbank登錄號ADZ04472),按照通用遺傳密碼表和大腸桿菌密碼子偏好合成新布尼亞病毒NP蛋白編碼序列，其DNA如SEQ IDNo. I所示，(圖I)。采用常規(guī)克隆方法(分子克隆3)，將合成片段插入pQE30表達質(zhì)粒Bam HI位點和Sal I位點之間，構(gòu)建pQE30-rNP重組質(zhì)粒，測序正確后作為重組NP蛋白表達質(zhì)粒(圖2)。重組NP蛋白表達質(zhì)粒pQE30-rNP的DNA序列為SEQ ID No. 2所示。對應編碼重組NP蛋白的編碼序列位于151到888 nt，編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列為SEQ ID No. 3所示。實施例2 :重組新布尼亞病毒NP蛋白表達純化
取測序正確的pQE30-rNP重組質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E Coli. M15，選取一個克隆接種到3 mL含 ampillin 50 ug/mL 及 kanamycin 25 ug/mL 的 LB 培養(yǎng)基中，37°C 250 rpm 過夜培養(yǎng)。取培養(yǎng)物3 mL到30 mL相同培養(yǎng)基，37°C 250 rpm培養(yǎng)約3 h至0D600=0. 6，取出I mL培養(yǎng)物到一 I. 5 mL的EP管并置于冰上，加2 M的IPTG 9 uL，繼續(xù)培養(yǎng)并每小時取出I mL培養(yǎng)物，至第5 h，其余的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到50 mL離心管。4°C 4000 rpm 5 1^11，去上清，1.5 mL EP管中的細菌各加H20 50 uL及2倍蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液50 uL，100 V 5 min，每管加樣10 uL作SDS-PAGE,常規(guī)Coomassie brilliant blue染色判斷是否表達。50 mL離心管中的細菌加I倍的磷酸緩沖液2 mL，超聲破菌，15000 rpm離心25 min，上清移到另一個離心管，沉淀中加水2 mL并混勻。用前述的方法作SDS-PAGE判斷表達產(chǎn)物是在上清還是在包涵體。重組新布尼亞病毒NP蛋白純化1000 mL誘導表達重組新布尼亞病毒NP蛋白的細菌,4000 rpm離心5 min,去上清,加I倍磷酸緩沖液20 mL,混勻，15瓦超聲破菌I min ,10次，15000 rpm離心25 min,上清通過O. 4 μ m的復合纖維膜,濾過液通過HIS-TRAP柱，以含20、40、80、160 mM咪唑的I倍磷酸緩沖液逐級洗脫，每個濃度4 mL，收集所有液體，作SDS-PAGE確定洗脫條件并保存含融合蛋白的洗脫液供進一步研究。如圖3所示表達重組新布尼亞病毒NP蛋白蛋白的細菌有一個明顯的分子量約為30 KDa表達條帶，純化時在 160 mM米唑濃度下可以高純度洗脫，基因工程人類重組新布尼亞病毒NP蛋白蛋白分子量約為30 KDa。
權(quán)利要求
1.一種新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列，其特征在于依據(jù)E Coli.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計，其DNA序列為SEQ ID No. I所示。
2.一種重組新布尼亞病毒NP蛋白的制備方法，其特征在于具體步驟為 1)依據(jù)EColi.密碼子偏好作密碼子優(yōu)化設計以及合成新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列，其DNA為SEQ ID No. I所示； 2)將密碼子優(yōu)化設計的新布尼亞病毒NP蛋白的編碼序列克隆到大腸桿菌表達質(zhì)粒PQE30，制備pQE30-rNP重組質(zhì)粒，其DNA為SEQ ID No. 2所示；編碼的重組NP蛋白氨基酸序列為SEQ ID No. 3所示； 3)pQE30-rNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E Coli. M15菌； 4)常規(guī)培養(yǎng)誘導重組蛋白表達；以及 5)使用Hitrap純化重組新布尼亞病毒NP蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領域，具體涉及一種全合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的新布尼亞病毒NP蛋白編碼序列及其應用。新布尼亞病毒NP蛋白編碼序列如SEQIDNo.1所示。將編碼序列SEQIDNo.1克隆到pQE30表達質(zhì)粒，使用EColi.M15表達重組蛋白，以Hitrap純化重組新布尼亞病毒NP蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過對NP蛋白編碼按EColi.密碼子偏好重新設計，人工合成，提高了EColi.表達新布尼亞病毒NP蛋白的效率，降低了制備重組新布尼亞病毒NP蛋白的成本，提高了產(chǎn)品的純度。
文檔編號C12R1/19GK102703474SQ201210170810
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者沈琦, 陳金中 申請人:復旦大學