專利名稱：一種非編碼基因的高通量鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的基因鑒定方法，特別是HIiCT0RNA基因的鑒定方法。
背景技術(shù)：
microRNA或稱為miRNA，即微RNA，是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA小分子；1993年在秀麗線蟲{Caenorhabditis eIegans)中首次被Lee等人發(fā)現(xiàn)(/ed),其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用得到了學(xué)界的廣泛認(rèn)可。在動(dòng)物、植物和微生物(病毒)中廣泛存在，并具有一定保守性。microRNA通常由6(Tl20 nt的前體分子在酶的加工下形成，成熟體長度一般為19^25 nt。microRNA通過與靶基因堿基互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能，在細(xì)胞命運(yùn)決定中具有重要的調(diào)控作用。microRNA是基因表達(dá)、修飾和翻譯的調(diào)節(jié)者。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在干細(xì)胞的自我復(fù)制、定向分化和組織再生中，都起著非常重要的作用，并且參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞重編程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控等重要的生命過程。而細(xì)胞是組成生命體的一個(gè)基礎(chǔ)，細(xì)胞代謝上的障礙將會(huì)導(dǎo)致癌癥、心腦血管疾病、發(fā)育異常、農(nóng)作物疾病……因此，microRNA涉及了發(fā)育、疾病以及糧食等一系列重大問題。同時(shí)，microRNA也正在成為 新型的biomarker,是疾病診斷分型與新型藥物研發(fā)中的新星。microRNA的研究多次入選Science年度十大科技進(jìn)展，已經(jīng)成為生物科技領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn)?；蜩b定是microRNA研究中的基礎(chǔ)。microRNA的鑒定方法主要有2大類基于實(shí)驗(yàn)的方法與結(jié)合計(jì)算機(jī)分析的高通量鑒定，前者能較為準(zhǔn)確的鑒定出研究對(duì)象中的microRNA基因，但一次鑒定的數(shù)目有限，并且需要依托基因組信息來驗(yàn)證；后者彌補(bǔ)了前者的不足，可以完成對(duì)研究對(duì)象批量的系統(tǒng)鑒定，并具有準(zhǔn)確性。隨著生物技術(shù)領(lǐng)域高通量方法的發(fā)展，后者成為了新興的研究方法，并日益成為主流。目前，結(jié)合計(jì)算機(jī)分析的高通量鑒定可分為以下3種(1)基于比較基因組學(xué)的序列保守性預(yù)測，這種方法在物種間保守的microRNA基因具有一定預(yù)測效果,而對(duì)物種特有的microRNA基因的鑒定效果不佳。由于不同物種間基因組的差異，導(dǎo)致研究對(duì)象中不一定存在該microRNA前體，使得方法I具有一定假陽性。(2)對(duì)已完成基因組測序的模式生物，可以結(jié)合小RNA測序進(jìn)行microRNA 預(yù)測將小RNA測序的Reads匹配到基因組上進(jìn)行延伸，獲得microRNA的候選前體序列；從而通過模擬microRNA生物學(xué)合成的方法來系統(tǒng)鑒定microRNA。但對(duì)于大量的沒有完成基因組測序的生物，這一方法并不適用；而完成基因組全測序是一個(gè)耗時(shí)并且價(jià)格昂貴的工作，限制了方法2在未完成基因組測序的生物中的應(yīng)用。(3)用EST替代基因組序列是方法2的一種退而求其次的選擇，由于EST序列在基因組中的覆蓋度低、數(shù)據(jù)量不足和零散分布等原因，使得方法3鑒定的microRNA不全面?；谝陨显颍壳耙呀?jīng)鑒定出的microRNA數(shù)目仍然十分有限，許多新的microRNA有待于被鑒定，其具有獨(dú)特功能有待于被發(fā)掘。因此，要在基因組的水平大量鑒定microRNA,研發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)而系統(tǒng)的microRNA高通量鑒定方法顯得十分必要
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種非編碼基因的高通量鑒定方法，特別適用于microRNA基因的檢測，尤其是對(duì)未完成基因組測序的生物的microRNA基因的高通量鑒定。本發(fā)明通過以下方案達(dá)到上述目的。一種非編碼基因的高通量鑒定方法，其包括以下步驟
(1)提取樣品總DNA，進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果拼接成contig序列；
(2)提取樣品總RNA，從中分離長度為18 30nt的小RNA，對(duì)小RNA進(jìn)行測序；
(3)將小RNA測序的Reads匹配到DNA的c ontig序列上進(jìn)行兩端延伸，獲得候選前體序列；
(4 )利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)候選前體序列進(jìn)行高通量鑒定。優(yōu)選地,步驟(I)中對(duì)DNA 測序的方法為 454、Solexa、SOLiD、illumina、HiSeq 或Helicos方法中的一種或多種；contig序列的長度大于所測基因的前體要求的長度；采用2倍以上的覆蓋度(coverage)對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行DNA測序。優(yōu)選地，步驟(4)中使用二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊、自由能計(jì)算、綜合罰分中的一種或多種對(duì)候選前體序列進(jìn)行分析。上述方案可以對(duì)基因進(jìn)行高通量鑒定，并且尤其適合于microRNA基因的鑒定。當(dāng)所述基因?yàn)閙icroRNA時(shí)，步驟(I)中contig序列的長度大于或等于60nt。更優(yōu)選地,所述microRNA為沒有基因組圖譜物種的microRNA。但是本發(fā)明的方法并不局限于未完成基因組測序的生物，對(duì)已有基因組的生物同樣適用，可用于對(duì)生物體microRNA系統(tǒng)梳理與校對(duì)。所述基因還可以是具有前體結(jié)構(gòu)的小RNA。由于本方法采用了 DNA高通量測序結(jié)合小RNA測序的方法，將小RNA片段延長獲得候選前體，這一特點(diǎn)不局限于microRNA，因此本發(fā)明同樣適用于具有前體結(jié)構(gòu)的小RNA的檢測。本發(fā)明具有以下有益效果由于本發(fā)明采用的是DNA高通量測序的方法，其結(jié)果能夠覆蓋研究對(duì)象的基因組，其拼接結(jié)果平均長度達(dá)到了 500 nt以上，滿足microRNA前體長度(60 nt以上)需要。因此，這一研究設(shè)計(jì)與通常的基因組測序的研究目的不同，并且不涉及進(jìn)行基因組精細(xì)圖的繪制，成本較低，是一種經(jīng)濟(jì)而有效的microRNA高通量鑒定方法。


圖I本發(fā)明實(shí)施例的步驟模塊示意 圖2本發(fā)明實(shí)施例的DNA測序結(jié)果的質(zhì)量檢測 圖3本發(fā)明實(shí)施例的小RNA測序結(jié)果的質(zhì)量檢測 圖4本發(fā)明實(shí)施例的DNA拼接結(jié)果 圖5本發(fā)明實(shí)施例的microRNA鑒定結(jié)果 圖6本發(fā)明實(shí)施例的microRNA高通量鑒定效果與已有基因組物種的對(duì)比 圖7本發(fā)明實(shí)施例的microRNA高通量鑒定效果與EST方法的對(duì)比圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例食用型香蕉(ifesa sp.)葉片microRNA的高通量鑒定 參考圖I所示步驟進(jìn)行高通量基因鑒定。I.樣品總DNA提取與質(zhì)量檢測
香蕉 DNA 采用 E. Z. N. A. HP Plant DNA Kit (Omega ，D2485-00)方法提取。DNA 樣品經(jīng)NanoDrop檢測，濃度為75 ng/u L ；0D260/280值為2. 00，產(chǎn)量為6 u go2.對(duì)DNA樣品進(jìn)行高通量測序
香蕉基因組C值為0. 58 0. 78 pg (1C)，均值為0.66 pg。預(yù)測基因組大小為6 X IO8bpo DNA樣品采用500bp插入文庫,經(jīng)cluster制備后,采用全基因組鳥槍法(WGS)測序,總測序量不低于6X IO9 bpo3.樣品總RNA提取與質(zhì)量檢測
香蕉 RNA 米用 Plant/Fungi Total RNA Purification Kit (Norgen Cat# 25800,31300, 31900)方法提取。RNA 樣品經(jīng) NanoDrop 檢測，濃度為 660 ng/y L ;0D260/280 值為
2.07，產(chǎn)量為 20 u g04.對(duì)RNA樣品進(jìn)行小RNA測序
從總RNA中分離小RNA (—般為18 30nt)，加接頭并純化。經(jīng)RT-PCR、建立小RNA文庫后，上機(jī)進(jìn)行測序(實(shí)施例中采用Illumina Genome Analyzer平臺(tái))。5.對(duì)DNA、RNA結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制與序列預(yù)處理
去掉實(shí)驗(yàn)中加入的接頭等雜質(zhì)序列后，采用對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量序列(實(shí)施例中采用FastQC等軟件)。并完成后續(xù)分析所需的序列格式轉(zhuǎn)換。質(zhì)量檢測結(jié)果請(qǐng)參見圖2和圖3。6.對(duì)DNA預(yù)處理結(jié)果進(jìn)行拼接
對(duì)預(yù)處理后的DNA測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得contig的N50為I. 2kp，其長度大于microRNA前體(一般為70-120 bp)，滿足microRNA候選前體的要求。(實(shí)施例中綜合采用ABySS> CAP、iAssembler、SOAPdenobo> Velvet等序列拼接軟件)。拼接結(jié)果參見圖4。7.以DNA測序拼接結(jié)果作為microRNA候選前體，結(jié)合小RNA測序預(yù)處理結(jié)果，利用軟件進(jìn)行microRNA高通量鑒定。將contig序列集結(jié)合預(yù)處理后的小RNA測序數(shù)據(jù)集，用程序進(jìn)行分析。得到microRNA前體為159條，成熟體為126條，星號(hào)序列為150條，其中新microRNA為77條，而84條星號(hào)序列為測序?qū)嶒?yàn)中獲得，說明結(jié)果可靠。數(shù)據(jù)量與已測序物種葡萄(雙子葉植物)、二穗短柄草(單子葉植物)、高粱(單子葉植物)等相當(dāng)。結(jié)果參見圖5、圖6和圖7。權(quán)利要求
1.一種非編碼基因的高通量鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 (1)提取樣品總DNA，進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果拼接成contig序列； (2)提取樣品總RNA，從中分離長度為18 30nt的小RNA，對(duì)小RNA進(jìn)行測序； (3)將小RNA測序的Reads匹配到DNA的contig序列上進(jìn)行兩端延伸，獲得候選前體序列； (4 )利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)候選前體序列進(jìn)行高通量鑒定。
2.如權(quán)利要求I所述的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中對(duì)DNA測序的方法為454、Solexa、illumina、SOLiD、HiSeq 或 Helicos 方法中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求I所述的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中contig序列的長度大于所測基因的前體要求的長度。
4.如權(quán)利要求I所述的鑒定方法，其特征在于步驟(I)中采用2倍以上的覆蓋度對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行DNA測序。
5.如權(quán)利要求I所述的鑒定方法，其特征在于步驟(4)中使用二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊、自由能計(jì)算、綜合罰分中的一種或多種對(duì)候選前體序列進(jìn)行分析。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的鑒定方法，其特征在于所述基因是microRNA。
7.如權(quán)利要求6所述的鑒定方法,其特征在于步驟(I)中contig序列的長度大于或等于60nt。
8.如權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征在于所述microRNA是沒有基因組圖譜物種的 microRNA。
9.如權(quán)利要求6所述的鑒定方法,其特征在于獲得的microRNA包含microRNA前體、成熟體與星號(hào)序列。
10.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的鑒定方法，其特征在于所述基因是具有前體結(jié)構(gòu)的小RNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非編碼基因的高通量鑒定方法，包括以下步驟(1)提取樣品總DNA，進(jìn)行DNA測序，并將測序結(jié)果拼接成contig序列；(2)提取樣品總RNA，從中分離長度為18~30nt的小RNA，對(duì)小RNA進(jìn)行測序；(3)將小RNA測序的Reads匹配到DNA的contig序列上進(jìn)行兩端延伸，獲得候選前體序列；(4)利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)候選前體序列進(jìn)行高通量鑒定。該發(fā)明主要針對(duì)于沒有基因組圖譜物種的microRNA及其基因的系統(tǒng)鑒定，發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA基因；對(duì)已有完成基因組測序的生物同樣適用；且不局限于microRNA，同樣適用于具有前體結(jié)構(gòu)的小RNA的檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102747147SQ201210170788
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者周惠, 屈良鵠, 廖建友, 楊建華, 溫俊志, 鄭凌伶 申請(qǐng)人:中山大學(xué)