專利名稱：檢測新布尼亞病毒的試劑盒和寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種檢測新布尼亞病毒的試劑盒和寡核苷酸，尤其是利用SYBR Green熒光定量PCR方法對生物樣品中新布尼亞病毒進行檢測。屬生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
新布尼亞病毒(Novel Bunyavirus)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae),白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)。病毒基因組包含三個單股負鏈RNA節(jié)段(L、M和S)。新布尼亞病毒導致發(fā)熱伴血小板減少綜合征，主要臨床表現(xiàn)為高熱，伴乏力、明顯納差、惡心、嘔吐等，部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等。少數(shù)病例病情危重，出現(xiàn)意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等多臟·器功能衰竭死亡。新布尼亞病毒是我國新發(fā)現(xiàn)的一種布尼亞病毒，曾在河南、湖北、山東等省的山區(qū)和丘陵地帶發(fā)現(xiàn)病例。目前已從患者以及蜱中分離到了該病的病原體，提示可以經(jīng)蜱叮咬傳播，但直接接觸急性期病人血液，也會導致感染，人群普遍易感。本病尚無特異性治療手段，主要為對癥支持治療。目前，通過病毒分離、血清特異性IgG抗體、血清特異性總抗體等方法來確診新型布尼亞病毒感染。病毒分離堪稱病毒檢測的“金標準”，但操作復雜，技術(shù)要求高，檢測周期長，無法及時為臨床診斷提供結(jié)果，且敏感性較差，病毒分離陰性并不能排除病毒的感染。血清學方法操作簡單，但是存在較長“窗口期”，不利于早期診斷，而且敏感性較核酸診斷明顯要低。病毒核酸是病毒感染最直接、最敏感和最特異的檢測指標。PCR方法以其高敏感性、高特異性和快速簡便等優(yōu)勢得到了廣泛的應用。目前在臨床檢測中使用較多的是熒光定量PCR，熒光標記探針的使用進一步提高了檢測的敏感性和特異性，但是成本相對較高。而SYBR Green實時定量檢測法成本較低，又同時實現(xiàn)了反應體系的全封閉和操作的全自動，減少了污染，提高了效率，而且不受生物個體因素影響，具有高度靈敏度、特異性，可以進行單個或成批樣品的檢測，適合基層單位的推廣，已成為病毒的常規(guī)檢測方法。本發(fā)明研究開發(fā)出一種檢測新布尼亞病毒的SYBR Green實時定量檢測試劑盒，該試劑盒使用方便，可廣泛應用于新布尼亞病毒的臨床及實驗室檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測新布尼亞病毒的寡核苷酸。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果準確的檢測新布尼亞病毒的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一組檢測新布尼亞病毒的寡核苷酸，由序列表SEQ ID No. I至序列表SEQ ID No. 2所示堿基序列的寡核苷酸組成；I)上游引物 5，-ATCCTCAACCTCTCTGTCACCATAC-3，(SEQIDN0:1)2)下游引物 5，-ACGGCTCCTTCTTCCCAAA-3’ (SEQ ID NO 2)本發(fā)明還提供一種檢測新布尼亞病毒的試劑盒，包括以下試劑I) RT-PCR 反應液，其包括Takara ExTag HS Mix、PrimerScript PLUS RTaseJl沖液、上游引物、下游引物、Rox染料，其中上游引物是序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2) DEPC 水； 3)陰性對照不含布尼亞病毒的蜱cDNA ；4)陽性對照布尼亞病毒cDNA或含布尼亞病毒目的基因的質(zhì)粒；其中，Rox (50 X )染料，購自寶生物工程(大連)，貨號DROXOl。緩沖液(2X)(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)含有dNTPMixture2 X conc, 4mM Mg2+, SYBR Green I 等；Takara ExTag HS Mix (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)含有TaKaRa Ex Taq HS I. 25U/25 U I 和輔助蛋白。PrimerScript PLUS RTase (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)內(nèi)含反轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑。本發(fā)明還提供了一種檢測新布尼亞病毒的試劑盒的使用方法I)提取待檢樣品的RNA，即模板RNA，可以利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法或試劑盒提??；2)進行SYBR Green熒光定量RT-PCR擴增反應，該反應體系見下表表I反應體系
組分使用終濃度
2X緩沖液IX
Takara ExTag HS Mix0.06|_iM
RT-PCTK A PrimerScript PLUS RTase0.02‘u.M
液 10 JiM上游引物(F3)0.4 ^iM
10JiM 下游引物(B3)0.4 JiM
50XRox 染料Ix
RNA 模板2 [xL~4[iL
反應體系為20^iL~50^L,不足的用DEPC水補足3)反應條件擴增程序為42 V X5min，95 V XlOsec ；95 °C X5sec —60°C X20 34sec 循環(huán) 40 次；溶解曲線分析 95°C Xlsec，65°C X15sec,95°C Xlsec (0. 1°C /sec)。4)結(jié)果判定
首先判定實驗結(jié)果是否有效。有效實驗結(jié)果應同時符合以下2個條件(I)陰性對照無擴增曲線；(2)陽性對照Ct值< 36并有明顯擴增曲線。在判定實驗結(jié)果有效的情況下報告結(jié)果(I)陰性無Ct值或Ct值> 36，且無明顯擴增曲線，報告為新布尼亞病毒SYBRGreen熒光RT-PCR檢測陰性；(2)陽性Ct值彡35，并有明顯擴增曲線，報告為新布尼亞病毒SYBR Green熒光RT-PCR檢測陽性。本發(fā)明的優(yōu)點是提供了一種高度靈敏性和特異性的新布尼亞病毒的檢測試劑盒，在實驗中實現(xiàn)了反應體系的全封閉和操作的全自動，減少了污染，提高了效率。克服了病毒分離方法的操作復雜，技術(shù)要求高，檢測周期長，敏感性較差；血清學方法操作簡單，但是存在較長“窗口期”，敏感性較核酸診斷低；熒光探針定量PCR成本相對較高的缺點。該方法可以進行單個或成批樣品的檢測，適合基層單位的推廣，可廣泛應用于新布尼亞病毒的臨床及實驗室檢測。下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖I臨床標本、其他病毒以及健康血清樣本檢測結(jié)果；圖2檢測新布尼亞病毒的試劑盒的特異性分析結(jié)果。
具體實施例方式實施例I :引物設計本方法下載已發(fā)表的全部新布尼亞病毒M基因序列，經(jīng)過序列比對，找出保守的基因序列，采用Primer Premier 5. 0軟件設計特異性引物，之后將擬選定的引物在GenaBank數(shù)據(jù)庫中進行BI as t比較,確定篩選特異性的引物。確定后的引物為如序列表SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。實施例2 :檢測新布尼亞病毒的試劑盒的組成(保存于_20°C )一、試劑盒的組成(保存于_20°C )I) RT-PCR 反應液，其包括Takara ExTag HS Mix、PrimerScript PLUS RTaseJl沖液(2X)、上游引物、下游引物、Rox染料(50X)，其中上游引物是序列表SEQID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2) DEPC 水；3)陰性對照不含布尼亞病毒的蜱cDNA ；4)陽性對照布尼亞病毒cDNA或含布尼亞病毒目的基因的質(zhì)粒；其中，Rox染料(50 X )，購自寶生物工程(大連)，貨號DROXOI。緩沖液(2X )(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)含有dNTPMixture
2X conc, 4mM Mg2+, SYBR Green I 等；Takara ExTag HS Mix (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)含有TaKaRa Ex Taq HS I. 25U/25 U I 和輔助蛋白；。PrimerScript PLUS RTase (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR096A)內(nèi)含反轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑.
二、陽性對照品的制備陽性對照為布尼亞病毒目的基因合成的質(zhì)粒，制備方法為用SEQ ID No. I和SEQID No. 2所示的引物序列對陽性樣本進行PCR反應，回收PCR產(chǎn)物，獲得高純度的145bp的M基因保守區(qū)序列(SEQ ID No. 3),與pGEM-Teasy載體進行連接,轉(zhuǎn)化E. coli CompetentCells DH5a感受態(tài)細胞，進行培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取，經(jīng)PCR和序列測定鑒定后獲得陽性重組質(zhì)粒，作為陽性對照，命名為pGEM-Bun。10倍連續(xù)梯度稀釋裂解液，測定Ct值，Ct值為22. (T28. 0均可作為陽性對照。實施例3 :檢測新布尼亞病毒的試劑盒的特異性I、材料用于特異性評價的健康人血清樣本及常見血液病毒DNA樣本來自軍事醫(yī)學科·學院微生物流行病研究所，包括乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus，HBV)，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV),人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV), EB 病毒(Epstein-Barr virus, EBV);森林腦炎病毒 MDJOl 株的 DNA。2、方法采用本發(fā)明所述的SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒對健康人血清及常見血液病毒DNA樣本檢測，驗證方法的特異性。3、結(jié)果健康人血清及常見血液病毒DNA樣本檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法對上述病原體無交叉反應，表明該體系具有良好的特異性。參見圖I。實施例4 :檢測新布尼亞病毒的試劑盒的靈敏性試驗I、材料新布尼亞病毒陽性對照品(人工制備含新布尼亞病毒核酸片段的質(zhì)粒)。2、方法利用DEPC水對陽性對照品進行10倍梯度稀釋(I X IO7, I X IO6, I X IO5, I X IO4, IX 103，IX 102copies/ml)，采用本發(fā)明所述的SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測，從檢出的濃度中選擇最低的那個濃度重復測定20次，若陽性率> 95%，即為該方法的分析靈敏度(copies/ml)。3、結(jié)果通過對梯度稀釋新布尼亞病毒陽性對照品進行檢測，確定本方法的最低檢測限為
IX 103copies/ml。見圖 2。實施例5 :檢測新布尼亞病毒的試劑盒對臨床樣品的檢測I、材料新布尼亞病毒(SFTSV)樣本來源臨床上診斷為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)患者的血清樣本50份，收集自河南省信陽市。臨床診斷采用《發(fā)熱伴血小板減少綜合征診療方案》(《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010版)》)所述標準具有流行病學史(流行季節(jié)在丘陵、林區(qū)、山地等地工作、生活或旅游史等或發(fā)病前2周內(nèi)有被蜱叮咬史)，發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，且外周血血小板和白細胞降低。利用德國QIAGEN公司RNAeasy Mini Kit提取樣本病毒核酸。2、方法
對這50份臨床樣品，采用本發(fā)明所述的SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測，并利用基因測序方法對分析結(jié)果進行驗證，即對PCR檢測產(chǎn)物進行序列分析，并將所得序列和已有新布尼亞病毒序列進行比對，以對檢測結(jié)果進行驗證。3、結(jié)果取50份新布尼亞病毒血清樣本進行檢測，其中40例檢測為陽性。同時，將擴增產(chǎn)物進行基因測序，經(jīng)比對驗證所得序列均為SFTSV基因組序列。見圖I。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列?！?br> 權(quán)利要求
1.一組檢測新布尼亞病毒的寡核苷酸，其特征在于由序列表SEQ ID No. I至序列表SEQ ID No. 2所示堿基序列的寡核苷酸組成；其中SEQ ID No. I為上游引物，SEQ ID No. 2為下游引物。
2.一種檢測新布尼亞病毒的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成 1)RT-PCR反應液，其包括TakaraExTag HS Mix,PrimerScript PLUS RTase、緩沖液、上游引物、下游引物、Rox染料；2)DEPC 水； 3)陰性對照不含布尼亞病毒的蜱cDNA； 4)陽性對照布尼亞病毒cDNA或含布尼亞病毒目的基因的質(zhì)粒， 其中，上游引物是序列表SEQ ID No. I所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR反應液包括0.06 u MTakara ExTag HS Mix>0. 02 u M PrimerScript PLUS RTase、I X 緩沖液、0. 4 u M上游引物、0. 4 ii M下游引物和I X Rox染料。
4.一種檢測新布尼亞病毒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 1)提取待檢樣品的RNA； 2)進行SYBRGreen熒光定量RT-PCR擴增反應，其中，使用的引物為序列表SEQ IDNo. I所示的上游引物和序列表SEQ ID No. 2所示的下游引物； 3)進行結(jié)果判定，無Ct值或Ct值>36，且無明顯擴增曲線為陰性；Ct值< 35，并有明顯擴增曲線為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測新布尼亞病毒的試劑盒和寡核苷酸，具體涉及一組檢測新布尼亞病毒的寡核苷酸，其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的寡核苷酸序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便。
文檔編號C12Q1/70GK102787177SQ20121032467
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者任彤, 劉艷華, 張麗杰, 江佳富, 王藝凱, 田潔, 賈娜, 郭惠琳 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局